Une biopuce microfluidique électrochimique à base d'analyse ADN hybridation Sans étiquette

Résumé

Nous présentons une biopuce microfluidique à base électrochimique-pour la détection d'hybridation d'ADN. Après ssADN sonde fonctionnalisation, la spécificité, la sensibilité et la limite de détection sont étudiées avec des objectifs de ssADN complémentaires et non complémentaires. Les résultats illustrent l'influence des événements d'hybridation d'ADN sur le système électrochimique, avec une limite de détection de 3,8 nM.

Résumé

La miniaturisation des procédures analytiques de paillasse dans la micro-échelle fournit des avantages significatifs en ce qui concerne le temps de réaction, le coût, et l'intégration des étapes de pré-traitement. L'utilisation de ces dispositifs vers l'analyse des événements d'hybridation de l'ADN est important car il offre une technologie pour de vrai l'évaluation des temps de biomarqueurs au point-of-care pour diverses maladies. Toutefois, lorsque l'empreinte de l'appareil diminue la domination de divers phénomènes physiques augmente. Ces phénomènes influent sur la précision de fabrication et la fiabilité de fonctionnement du dispositif. Par conséquent, il existe un grand besoin pour la fabrication de précision et de faire fonctionner ces dispositifs d'une manière reproductible dans le but d'améliorer la performance globale. Ici, nous décrivons les protocoles et les méthodes utilisées pour la fabrication et le fonctionnement d'une biopuce microfluidique à base électrochimique pour une analyse précise des événements d'hybridation d'ADN. La biopuce est composé de deux parties: une puce microfluidique avectrois micro-canaux parallèles en polydiméthylsiloxane (PDMS), et une micro-puce Arrayed électrochimique 3 x 3. Les événements d'hybridation d'ADN sont détectés en utilisant la spectroscopie d'impédance électrochimique (SIE) d'analyse. L'analyse permet EIS variations de surveillance des propriétés du système électrochimique qui sont dominantes à ces échelles de longueur. Avec la possibilité de surveiller les changements à la fois de transfert de charge et de résistance à la diffusion avec le biocapteur, nous démontrons que la sélectivité pour les objectifs de ADNsb complémentaires, une limite de détection calculée de 3,8 nM, et une réactivité croisée avec d'autres ADN à un brin non-complémentaire de 13% après 20 min d'incubation. Cette méthode permet d'améliorer les performances des dispositifs miniaturisés en éclaircissant sur le comportement de diffusion à l'échelle micro-régime et en permettant l'étude des événements d'hybridation d'ADN.

Introduction

Lab-on-a-chip microfluidique dispositifs (LOC) de fournir de nombreux avantages dans le diagnostic clinique, la surveillance environnementale et la recherche biomédicale. Ces dispositifs utilisent des canaux microfluidiques pour commander l'écoulement de fluide dans les régions de la puce où une variété de procédures peut avoir lieu notamment de mélange des réactifs, l'affinité de liaison sur la base, la transduction du signal, et la culture de cellules ^4.1. Microfluidique offre de nombreux avantages par rapport aux outils de diagnostic cliniques conventionnels tels que des lecteurs de plaques de microtitration ou des essais de retard sur gel d'électrophorèse. Les dispositifs microfluidiques nécessitent 2 à 3 ordres de grandeur (au lieu de nanolitres microlitres) de moins de réactifs pour réaliser des tests similaires. En outre, ces dispositifs peuvent accroître la vitesse à laquelle certains événements biologiques se produisent en raison de la plus petite confinement des espèces dans les canaux ^5,6. En troisième lieu, les capteurs peuvent être intégrés dans des dispositifs microfluidiques utilisant des techniques de lithographie et de gravure, qui peuvent fournir detectio sans étiquetten. Enfin, ces dispositifs sont peu coûteux à produire et nécessiter peu de travail de la part du technicien pour fonctionner ^7-10.

Détection sans étiquette est habituellement effectuée en utilisant un capteur optique ou électrique. Les unités optiques peuvent présenter de meilleures performances de détection en raison de faibles niveaux d'interférence avec des analytes dans l'échantillon. Néanmoins, leur performance est compromise dans les cas où le fond de l'échantillon a la même longueur d'onde de résonance que le capteur ^11. Il ya de nombreux avantages à l'aide de signaux électriques pour effectuer une détection chimique et biologique dans les systèmes microfluidiques. La fabrication est intrinsèquement moins compliqué puisque ces capteurs ne nécessitent généralement des électrodes à motifs pour fonctionner. En outre, les signaux électriques peuvent être directement interfacés avec la plupart des équipements de mesure pendant que les autres modalités de signaux peuvent nécessiter un transducteur pour convertir le signal ^{de 12 à 15.} Capteurs électriques mesurent généralement des changements dans impedance ^16,17, capacité ¹⁸ ou ¹⁹ redox activité. Cependant, de nouveaux défis sont présentés comme ces systèmes sont miniaturisés. Les défis les plus importants à surmonter sont les suivants: préparation de l'échantillon et le mélange des fluides (en raison de la faible volume d'échantillon et le nombre de Reynolds), les effets physiques et chimiques (y compris les forces de capillarité, la rugosité de surface, les interactions chimiques entre les matériaux de construction et les analytes), faible signalisation sur-bruit (produit par la réduction de la superficie de la surface et du volume) ^{de 20 à 23,} et tout risque d'interférence à partir de substances à analyser électro-actif dans des échantillons biologiques complexes (par exemple, de sang et de salive). Une enquête plus approfondie de ces effets se traduira par des lignes directrices pour une fabrication précise et le fonctionnement de ces dispositifs d'une manière reproductible qui permettraient d'améliorer leur performance globale.

La détection d'hybridation d'ADN est largement utilisé pour le diagnostic des maladies génétiques et ^24,25 différentes formes de cancer ^26. Chaque année, plusieurs souches de la grippe sont identifiés chez les patients utilisant les résultats de techniques d'hybridation d'ADN ^27. Le virus de la grippe représente à lui seul 36 000 décès chaque année aux États-Unis ^28. Ces exemples pourraient bénéficier d'une paillasse dispositif microfluidique qui peut effectuer les mêmes techniques d'essai comme un essai de déplacement de lecteur de plaque ou d'un gel avec un volume d'échantillon et à une faible fraction du coût, sans sacrifier la sensibilité ou la spécificité. En raison des nombreux avantages de l'étiquette libre-détection électrochimique, il a été largement utilisée pour la détection d'événements d'hybridation d'ADN ^29,30. Une configuration d'électrodes, où la macro-échelle (de l'ordre du millimètre) sont plongées dans des béchers avec la solution d'intérêt peut être utilisée pour fournir des données très sensibles en ce qui concerne la cinétique de liaison des séquences d'ADN simples brins à leurs séquences complémentaires correspondantes. Récemment, il ya eu quelques progrès en intégrant la détection électrochimique en microfluidics pour hybridation de l'ADN. Des études ont été effectuées en ce qui concerne la cinétique d'hybridation ³¹ et de l'intégration de capteurs de détection ¹⁵ dans les canaux microfluidiques. Cependant, il existe encore un besoin pour un dispositif microfluidique à haut débit rapide qui permet d'analyser les événements d'hybridation d'ADN en parallèle, sans étapes compliquées de préparation de l'échantillon.

Le dispositif présenté dans ce travail fournit une plate-forme qui permet de multiples interactions qui seront projetés en parallèle et sans étapes compliquées de préparation des échantillons. Notre protocole présente comment microfluidique à base de biopuces électrochimiques sont microfabriqués avec les systèmes micro-électromécaniques (MEMS) ^32,33. On décrit le procédé de fabrication à la fois de la puce microfluidique, en polydiméthylsiloxane (PDMS), et la puce électrochimique, composé d'un réseau d'électrodes. La fonctionnalisation chimique de la biopuce avec des sondes ADN simple brin est également abordé. Enfin, la capalité du biocapteur pour détecter spécifiquement et analyser des cibles d'ADN simple brin est démontrée. Dans l'ensemble, la biopuce microfluidique à base électrochimique-est une technique rapide et l'analyse à haut débit. Il peut être utilisé pour étudier les interactions entre les molécules biologiques et les transducteurs conductrices, et peut être utilisé dans une variété d'applications de laboratoires sur puce.

Protocole

1. microfabrication de la puce microfluidique

1. Préparer électrochimique Chip
   1. Motif d'or électrodes
      1. Rincez un vide '' tranche 4 de silicium (prime de qualité de qualité) avec de l'acétone, le méthanol et l'isopropanol («AMI» propre). Rincer le isopropanol de la tranche avec de l'eau déminéralisée (DI) suivie d'un séchage avec N ₂ armes à feu.
      2. Croître une couche de passivation d'épaisseur 1 pm de SiO ₂ avec un dépôt chimique en phase vapeur assisté par plasma (PECVD) outil. Déposer une couche épaisse de 200 Å de chrome suivie d'une épaisse couche de 2000 Å d'or avec un outil de pulvérisation DC.
      3. Spin "PR1" résine photosensible positif (filature paramètres: 3000 rpm, 1000 rpm / s, 30 s) afin de créer un film uniforme ~ 1,6 um d'épaisseur. Pré-cuire la plaque pendant 1 minute à 100 ° C sur une plaque chauffante.
      4. Exposer la tranche à 190 mJ / cm ² à 405 nm de longueur d'onde à travers un photomasque. Développer la tranche de 30 secondes à 352 developer et rincer la plaquette avec DI et sec avec N ₂ armes à feu.
      5. Graver la médaille d'or avec gravure d'or pendant 1,5 minutes. Graver le chrome avec gravure de chrome pour ~ 30 sec. Rincer la plaquette avec DI et sec avec N ₂ armes à feu.
      6. Bande de la résine photosensible avec "AMI" procédure de nettoyage.
         REMARQUE: oxydant puissant et potentiellement explosif.
      7. Nettoyer la plaquette avec 4: 1 H ₂ SO _4: H ₂ O ₂ ("piranha" clean) pendant 1 min. Rincer la plaquette avec DI et sec avec N ₂ armes à feu.
   2. Motif Platinum électrodes
      1. Spin "PR2" résine photosensible positif (filature paramètres: 3000 rpm, 1000 rpm / s, 30 s) afin de créer un film uniforme ~ 1,4 um d'épaisseur. Pré-cuire la plaque pendant 1 minute à 100 ° C sur une plaque chauffante.
      2. Exposer la tranche à 30 mJ / cm ² à 405 nm de longueur d'onde à travers un photomasque. Cuire la galette pendant 45 secondes à 125 ° C sur une plaque chauffante. Flood exposerla plaquette à 1000 mJ / cm ² à 405 nm de longueur d'onde sans un photomasque. Développer la plaquette pendant 2 min dans 6: 1 développeur de AZ400K et rincer la plaquette avec DI et sec avec N ₂ armes à feu.
      3. Déposer une couche d'épaisseur de 400 Å de titane suivie d'une couche d'épaisseur 1600 Å de platine à l'aide d'un système d'évaporation par faisceau d'électrons.
      4. Soulever résine photosensible dans un bain d'ultrasons pendant l'acétone 5 min puis rincer avec de l'acétone et l'isopropanol. Rincer la plaquette avec DI et sec avec N ₂ armes à feu.
2. Préparer dosage Chaînes
   1. Préparer Moule pour dosage Chaînes
      1. Rincez un vide '' plaquette de silicium 4 (qualité grade de test) avec "AMI" procédure de nettoyage. Rincer le isopropanol de la plaquette avec DI suivie d'un séchage avec N ₂ armes à feu.
      2. Spin "PR3" résine photosensible négative (2 étapes filature paramètres:. Étape - 600 rpm, 120 rpm / s, 10 s Étape deux - 1150 rpm, 383 rpm / sec,27 sec) pour créer un film uniforme ~ 100 um d'épaisseur. Pré-cuire la galette sur une plaque chauffante (paramètres de cuisson 2 étapes:. Première étape - montée en puissance de la température ambiante à 65 ° C à 300 ° C / h et maintenir la température pendant 10 min Étape 2 - rampe jusqu'à 95 ° C à 300 ° C / h et la température de maintien pendant 30 minutes).
      3. Exposer la tranche à 2500 mJ / cm ² à 405 nm de longueur d'onde à travers un photomasque. Post-cuire la galette rampe d'accélération jusqu'à 95 ° C à 300 ° C / h et maintenir la température pendant 10 minutes sur une plaque chauffante. Développer la plaquette pendant 10 min dans Monométhylique du Propylène Glycol Ether Acetate (PGMEA) développeur. Rincer la plaque avec de l'isopropanol et sec avec N ₂ armes à feu.
   2. Fabriquer dosage Chaînes
      1. Préparation 10: 1 polydiméthylsiloxane (PDMS) mélange (20 g d'élastomère, 2 g d'agent de reticulation) et complètement dégazer dans une chambre à vide pendant 20 min.
      2. Définir une enceinte autour de la plaquette de moule de papier d'aluminium et verser lentement le PDMS non durcisur le moule.
      3. Cuire le moule avec les PDMS dans un four de boîte (paramètres de cuisson 2 étapes:. Étape - 5 min rampe depuis la température ambiante à 80 ° C Étape 2 - maintenir à 80 ° C pendant 17 min).
      4. Peler les PDMS du moule et placer sur une feuille d'aluminium. Couper les puces de dosage avec un couteau de chirurgien, définir des trous avec un outil de poinçonnage biopsie.

2 Monter le périphérique

1. Aligner manuellement les canaux de dosage PDMS avec les électrodes de travail sur la puce électrochimique. PDMS colle bien à la puce électrochimique, l'étanchéité des canaux et empêcher les fuites.
2. Connectez un tuyau flexible (DO 0,087 '' et ID 0,015 ') à un coude en plastique ou connecteur droit à l'aide d'un tube flexible à court comme un adaptateur (OD 0,1875' 'et ID 0,0625' '). Fixez les connecteurs à chacune des entrées percées de trous dans le dispositif.
3. Raccorder une seringue à l'autre extrémité dele tube et placer la seringue dans une pompe à seringue. Alternativement changer le jeu d'une seringue, un tube, et un connecteur selon l'étape de la procédure prévue aux articles 3 et sa solution correspondante.

3 Analyser hybridation de l'ADN

REMARQUE: Introduire chaque solution lentement dans le canal à un débit de 200 ul / h de débit jusqu'à ce que tout le canal est rempli.

1. Fonctionnaliser chaque microcanal vertical avec une séquence de la sonde ADN à un brin différent (en parallèle pour effectuer des micro-canaux verticaux séparés 3):
   1. Remplir chaque microcanal avec une solution sonde d'incubation ADNsb différent (10 mM de tampon phosphate, 100 mM de NaCl, 10 uM de tris (2-carboxyéthyl) phosphine (TCEP), et 1 uM sonde ADN sb), et incuber pendant 1 heure suivie d'un rinçage du microcanal avec du PBS.
   2. Remplir les micro-canaux avec une solution contenant 1 mM de 6-mercapto-1-hexanol (MCH) dans un tampon de PBS à 10 mM, NaCl 100 mM et 1,395 mM de TCEP, et incubate pendant 1 heure suivie d'un rinçage avec du PBS microcanal.
2. Soulevez le PDMS, une rotation de 90 ° pour une orientation horizontale, et placer pour exposer des rangées séparées de chambres de réaction à chaque ligne contenant un guichet unique et l'électrode de référence (Figure S1).
3. Remplissez les microcanaux avec une solution de mesure de contrôle de 4x concentrés citrate de solution saline sodium (SSC) tampon, et incuber pendant 20 min.
4. mesure de fond: Complétez les microcanaux avec 5 mM de ferricyanure / 5 ferrocyanure mM dans une solution de PBS et enregistrer les valeurs d'impédance du système électrochimique pour des fréquences différentes (spectroscopie d'impédance électrochimique; EIE) à l'aide d'un potentiostat connecté au travail, contre, et des électrodes de référence ( EIS paramètres: gamme de fréquence de 1 MHz à 0,1 Hz, 10 points de données de fréquence par décennie, 25 mV d'amplitude, 5 mV par rapport à la polarisation de l'électrode de référence). Répétez cette mesure pour chaque électrode de travail dans les microcanaux.
5. Mesurer hybridation de l'ADN (effectuer pour chaque cible de ssADN non complémentaire et complémentaire).
   1. Remplir les micro-canaux avec une solution de mesure cible ADNsb de 4x tampon SSC concentré contenant 1 pM de l'ADN à un brin cible, et incuber pendant 20 min. Mesurer l'ADN selon l'étape 3.4.

Résultats

Procédé de fabrication précise et contrôlable pour le dispositif expérimental est essentiel dans la recherche. Il permet aux chercheurs d'obtenir des expériences de débit reproductibles et élevés. Ici, nous avons démontré un rendement élevé, un processus de microfabrication haute reproductibilité d'une biopuce microfluidique à base électrochimique (Figure 1). Avec un faible taux d'échec, quelques dispositifs ont montré des problèmes de liaison qui mènent à une fuite de s...

Discussion

Nos travaux montrent la fabrication d'une biopuce à base électrochimique microfluidique, et son utilisation pour l'analyse d'événements d'hybridation d'ADN. Grâce à un processus de microfabrication à haut rendement contrôlée, nous développons un dispositif composé de canaux micrométriques intégrés à un réseau de transducteurs électrochimiques. Nous avons mis au point des paramètres de traitement de la procédure de contrôle de photolithographie de la puce électrochimique et le mou...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4'' Silicon wafer	Ultrasil	4-5664	Single side polished; P-type; Boron doped; Orientation 1-0-0; Thickness 500 micron; Resistance 10-20 ohm·cm
Shipley 1813 photoresist ("PR1")	Microchem		positive photoresist
AZ5214 photoresist ("PR2")	Hoechst Celanse		positive photoresist
SU-8 50 photoresist ("PR3")	Microchem		negative photoresist
Gold etchant	Transene	TFA	No dilution
Chromium etchant	Transene	1020AC	No dilution
PDMS elastomer	Dow Corning	3097366 1004
PDMS curing agent	Dow Corning	3097358 1004
Biopsy punching tool	Healthlink	BP20
Tygon flexible tubing	Cole Parmer	R 3603	0.015"
Tygon flexible adapter	Cole Parmer	06417-41	0.0625"
1 ml syringe	Beckton-Dickenson	301025
Monobasic potassium phosphate	Fluka	1551139
Potassium phosphate dibasic anhydrous	Sigma	RES20765-A7
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
tris(2-carboxyethyl)phosphine	Aldrich	C4706
6-mercapto-1-hexanol	Aldrich	451088
20x concentrated saline-sodium citrate buffer	Sigma	93017
Potassium hexacyanoferrate(III)	Aldrich	455946
Complementary ssDNA #1	Integrated DNA Technologies (IDT)	100 nmole DNA oligo	5’-GGGACGTCCACGGAGCGCTA TCGGAGCTTT-3’
Target ssDNA #2	Integrated DNA Technologies (IDT)	100 nmole DNA oligo	5’-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA ATCGATGAGT-3’
Complementary ssDNA #2	Integrated DNA Technologies (IDT)	100 nmole DNA oligo	5’-ACTCATCGATTCGTCAATGA CCTGACCCGT-3’
Target ssDNA #3	Integrated DNA Technologies (IDT)	100 nmole DNA oligo	5’-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA CCCATGATGA-3’
Complementary ssDNA #3	Integrated DNA Technologies (IDT)	100 nmole DNA oligo	5’-TCATCATGGGTCTAACTACT GGATCTAGGT-3’
Instrument
Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD)	Oxford Instruments	PlasmaLab System 100	Chamber pressure 1,000 mTorr, Tempreture 200 °C, RF power 20 W, Gasses: a) N2O flow rate 710 sccm; b) a composition of 5% SiH4 and 95% N2 gasses flow rate 170 sccm, SiO2 growth rate 690 Å/min.
DC sputtering unit	AJA International	ATC 1800-V	For Chrome: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 10 nm/min. For Gold: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 36 nm/min.
E-beam evaporation system	Denton	Custom-built	For Titanium: Chamber pressure < 2 x 10-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5 kW, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 6-10 Å/sec. For Platinum: Chamber pressure < 2 x 10-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5 kW, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 2-3 Å/sec.
Potentiostat	CH Instruments	660D
Syringe pump	KD Scientific	KDS230