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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt die Anreicherung von Proteinen mit den synaptischen Plasmamembran durch Ultrazentrifugation auf einem diskontinuierlichen Saccharosegradienten verbunden. Die anschließende Herstellung der postsynaptischen Dichte Proteine ​​wird ebenfalls beschrieben. Proteinpräparate eignen sich für Western-Blot-oder 2D-DIGE-Analyse.

Zusammenfassung

Neuronale subzellulärer Fraktionierung Techniken erlauben die Quantifizierung von Proteinen, die in und aus der Synapse gehandelt werden. Wie ursprünglich in den späten 1960er Jahren beschrieben, können Proteine, die mit den synaptischen Plasmamembran assoziiert durch Ultrazentrifugation auf einem Saccharose-Dichtegradienten isoliert werden. Sobald synaptischen Membranen isoliert werden, kann der makromolekularen Komplex postsynaptischen Dichte bekannt anschließend aufgrund seiner Unlöslichkeit Reinigungsmittel isoliert werden. Die zur synaptischen Plasmamembranen und postsynaptischen Dichte Proteine ​​zu isolieren Techniken im Wesentlichen gleich bleiben nach 40 Jahren, und sind weit verbreitet in der aktuellen neurowissenschaftlichen Forschung. Dieser Artikel beschreibt die Fraktionierung von Proteinen mit der synaptischen Plasmamembran und postsynaptischen Dichte mit einem diskontinuierlichen Saccharosegradienten verbunden. Resultierenden Proteinpräparate eignen sich für Western-Blot-oder 2D-DIGE-Analyse.

Einleitung

Neuronen kommunizieren über Synapsen und die Qualität dieser Kommunikation wird durch Veränderungen in der Zusammensetzung der Proteine ​​an der Synapse weitgehend reguliert. Insbesondere die Proteine ​​in der postsynaptischen Dichte liegt in der neuronalen Kommunikation teilnehmen, die durch inniges Gerüst Neurotransmitter-Rezeptoren mit ihren Signalübertragungssysteme 1. Weiterhin sind dauerhafte Änderungen in der Stärke der synaptischen Wirksamkeit durch Zugabe oder Entfernung von Rezeptoren an der postsynaptischen Dichte 1-6 gesteuert. Daher ist die Isolierung und Quantifizierung der synaptischen Proteinen eine notwendige und nützliche Technik, um einen Einblick in die Möglichkeiten, die Nervenzellen reagieren auf Reize und verändern synaptischen Wirksamkeit 7 zu gewinnen. Dieser Artikel beschreibt eine übliche Technik, synaptischen Proteinen aus Hirngewebe von Nagern durch Ultrazentrifugation auf diskontinuierlichen Saccharose-Gradienten zu isolieren. Die synaptischen Plasmamembranfraktion angereichert und isoliert werden, basierend aufseine Dichte in Saccharose, die empirisch bestimmt worden ist, ähnlich zu 1,2 M Saccharose ist.

Je nachdem welche biologischen Frage kann subzellulären Fraktionen durch kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Gradienten von Saccharose oder Percoll getrennt werden. Kontinuierlichen Gradienten ermöglichen die Trennung von Proteinen in mehrere Fraktionen; Dies kann besonders nützlich sein, um die Co-Lokalisierung von Proteinen in einer gegebenen Fraktion 8 zeigen. Jedoch ist die Herstellung von kontinuierlichen Gradienten mühsamer und unnötig für viele Anwendungen. Diskontinuierlichen Gradienten vergleichsweise leichter herzustellen und kann verwendet werden, um Proteine ​​in wenigen, allgemein definierten Fraktionen zu trennen. Diskontinuierlichen Gradienten, der aus drei Schichten von Saccharose Erhöhung Molarität bestehen in großem Umfang verwendet, um Proteine, die mit den synaptischen Plasmamembran (SPM) zugeordnet isolieren. Diese synaptischen Plasmamembranfraktion kann weiter auf der postsynaptischen Dichte fractio verarbeitet werdenn (PSD) durch Detergensbehandlung und Isolierung der Waschmittel-unlöslichen Fraktion.

Wenn dieses Verfahren wurde zuerst in den 1960er Jahren 9,10 beschrieben wurde Elektronenmikroskopie verwendet, um die Organellen und Membranen, die in etwa definieren die synaptischen Plasmamembran und postsynaptischen Dichte Fraktionen 9-14 demonstrieren. Diese Studien zeigten, die Aufnahme von prä-und postsynaptischen Membranen und synaptischen Vesikeln in der SPM-Fraktion; nach Detergens-Behandlung vor allem die Elektronendichte, waren postsynaptischen Dichten sichtbar. In dem Verfahren wird ein hypotonischen Schock verwendet, um aus dem Zellkörper 10 abzuklemmen die synaptischen Prozessen. Dieser Schritt nutzt die Tatsache, dass Mitochondrien sind resistenter gegen osmotischen Schock und intakt bleiben, so dass sie an der Unterseite des Saccharosegradienten (Figur 1) zu sedimentieren.

Mit dem gleichen Anreicherungstechnik, waren die SPM und PSD-Fraktionen erste biochemischdurch Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Sequenzierung der Hauptproteinkomponenten 15-17. Anschließend Western Blot-Analyse wurde verwendet, um zu detektieren und zu quantifizieren, die Pegel der synaptischen Proteinen und definieren diese Fraktionen weiter (Figur 2). Wir haben diese Technik in unseren Laboratorien verwendet, um Änderungen in der synaptischen Ebenen der Dopamin-Transporter, wenn das SLC6A3-Locus in der Maus 18 doppelt auftreten, zu quantifizieren. Wir haben auch diese Technik in NMDA-Rezeptor-defizienten Mäusen verwendet, um Synapse-spezifische Verringerung der Proteine, die Teil des DISC1 Interaktom 19 aufzudecken.

Es ist aus Western-Blot-Analyse, die SPM Fraktionen enthalten synaptische Vesikel Membranproteine, Endosomen-Marker, mitochondriale Proteine, membranassoziierten synthetische Enzyme und Signaltransduktion Moleküle sowie als integrierte Komponenten der postsynaptischen Dichte und synaptischen Plasmamembranen 20-23. Even PSD Fraktionen Kontamination mit reichlich mitochondriale Proteine ​​und es kann notwendig, um einen zweiten Gradienten Sedimentation oder zusätzliche Reinigungsschritte durchzuführen, um diese 13 zu entfernen. Kürzlich wurde die quantitative Massenspektrometrie eine Liste von über 100 Proteinen in der postsynaptischen Dichte allein, sowie einen Hinweis auf die relative Menge dieser Komponenten 24,25 vorgesehen.

Protokoll

Das folgende Protokoll entspricht den Richtlinien des Canadian Council der Tierpflege und wurde von der Fakultät für Medizin und Pharmazie Animal Care Committee an der Universität von Toronto genehmigt worden.

1. Bereiten Sie benötigten Reagenzien, wie in Tabelle 1 beschrieben,

  1. Hinzufügen Protease und Phosphatase (falls erforderlich) Inhibitoren für alle Saccharoselösungen, Puffer und ddH 2 O, die in Tabelle 1 angegebenen Konzentrationen. Wichtig: Führen alle Schritte bei 4 ° C und vor-kühlen alle Reagenzien und Ausrüstung vor dem Start des Experiments. Kennzeichnen Sie alle Rohre, einschließlich Ultrazentrifuge Rohre, mit Permanentmarker.

2. Präparation der entsprechende Hirnregion

  1. Opfern das Tier durch Genickbruch oder Enthauptung. Haus und einschläfern Tiere in Einklang mit den institutionellen und Regierungspolitik auf die Tierpflege.
  2. Schnell zu entfernen the Gehirn aus dem Schädel und Platz auf einer gekühlten Dissektion Block.
  3. Präparieren Sie die entsprechende Hirnregion aus frischem Gewebe und fahren Sie mit Schritt 3 fort.

3. Gewebehomogenisierung mit Motor Driven Glas-Teflon-Homogenisator

  1. Zeigen 50-100 mg (für SPM) oder 100-200 mg (PSD) des sezierten Gewebe in einem markierten 13 ml Polypropylen-Röhrchen mit 4 ml 0,32 M HEPES-gepufferte Saccharose-Lösung. Übertragen Sie die Probe in ein 15 ml Glas-Kegel Teflon Gewebemühle / Homogenisator, stellen Sie den Motorantrieb bis 900 Umdrehungen pro Minute (Stufe 7) und homogenisieren die Probe mit 12 Schlägen über einen Zeitraum von 30 Sekunden. Verwenden Sie eine andere Glas-Teflon-Homogenisator zwischen den Proben, oder spülen Sie den Homogenisator mit kaltem destilliertem Wasser zwischen den Proben und wischen Sie mit einem trockenen Kimwipe. HINWEIS: Bis zu 4 g Gewebe kann in 4 ml 0,32 M HEPES-gepufferten Saccharoselösung homogenisiert werden jedoch ratsam, weniger Gewebe verwenden, um die richtige Fraktionierung gewährleisten, ist es.
  2. Übertragen Sie die Probe homogenisiert zurück to die gleiche 13 ml Polypropylen-Röhrchen. Reserve 100 ul Homogenat und bei -80 ° C für die anschließende Proteinquantifizierung und Western-Blot-Analyse des Gesamtproteinfraktion.

4. Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit, um die Kernfraktion entfernen (Renditen Überstand S1)

  1. Zentrifuge das Homogenat in einem Festwinkelrotor bei 900 × g für 10 min bei 4 ° C ist. Den Überstand (S1) zu einem neuen, markierten 13-ml-Röhrchen und resuspendieren Kernfraktion Pellet (P1) in 500 ul 0,32 M HEPES-gepufferter Saccharose. HINWEIS: Die (P1) Fraktion kann bei -80 ° C gelagert und für die Western-Blot-Analyse der Kernfraktion benutzt werden.

5. Anreicherung des Crude Synaptosomale Fraktion (Pellet Renditen P2)

  1. Zentrifugieren der Überstand (S1) bei 10.000 × g für 15 min bei 4 ° C ist. Entfernen Sie den Überstand (S2) und Reserve 500 ul in einem Mikrozentrifugenröhrchen bei -80 ° C für die spätere Protein Quant speichernkation und Western-Blot-Analyse der cytosolischen / Licht Membranfraktion. Resuspendieren verbleibende rohe synaptosomale Fraktion Pellet (P2) in 1 ml 0,32 M HEPES-gepufferter Saccharose-Lösung und dann einen weiteren 3 ml 0,32 M HEPES-gepufferter Saccharose-Lösung.
  2. Zentrifuge bei 10.000 x g für 15 min bei 4 ° C ist. Den Überstand (S2) und Reserve 500 ul in einem Mikrozentrifugenröhrchen bei -80 ° C für die anschließende Proteinquantifizierung und Western-Blot-Analyse der cytosolischen / Licht Membranfraktion zu speichern. Speichern Sie die gewaschene rohe synaptosomale Pellet (P2 ') in der Polypropylen-Röhrchen.

6. Lysing (Hypoosmotische Shock) der rohen Synaptosomale Fraktion

  1. Lyse der rohe synaptosomale Pellet (P2 ') in Polypropylenröhrchen durch Resuspendieren in 1 ml ddH 2 O. Fügen Sie weitere 3 ml ddH2O, Transfer zu einem Glas-Teflon-Gewebe-Homogenisator und homogenisieren von Hand mit 3 Schlägen. HINWEIS: Es ist wichtig,diesen Schritt so schnell wie möglich durchzuführen und schnell gehen Sie zu Schritt 6.2.
  2. Übertragungs Proben aus dem Homogenisator in denselben 13 ml Polypropylenröhrchen und schnell einstellen Probe wieder auf 4 mM HEPES mit 16 ul 1 M HEPES-Lösung zum Mischen umgekehrt.
  3. Drehen Proben bei 4 ° C für 30 Minuten, um eine vollständige Lyse sicherzustellen.

7. Anreicherung des Synaptosomale Membranfraktion (P3)

  1. Zentrifuge bei 25.000 x g für 20 min bei 4 ° C ist. Entfernen des rohen vesikulären Fraktion Stand (S3) und behalten sie in einem 5-ml-Röhrchen bei -80 ° C für die anschließende Proteinquantifizierung und Western-Blot-Analyse zu speichern. Resuspendieren synaptosomalen Membranfraktion (P3) in 1 ml 0,32 M HEPES-gepufferter Saccharose-Lösung.

8. Vorbereitung der diskontinuierlichen Saccharosegradienten

  1. Pipette genau 3,5 ml 1,2 M HEPES-gepufferter Saccharose-Lösung und exakt 3,0 ml von 1,0 M und 0,8 M HEPES-gepufferte Saccharose-Lösung in separate 6 ml Snap Cap Röhren. ANMERKUNG: Dies geschieht vor Messung der Volumina der Puffer, die verwendet werden, um den Saccharose-Gradienten bilden. Genaue Messung der Volumina ist wichtig, um sicherzustellen, dass die resultierenden Verläufe für Ultrazentrifugation ausgeglichen werden.
  2. Mit einer Glaspasteurpipette und Birne, übertragen 1.2 M HEPES-gepufferten Saccharoselösung zu den 12 ml Polyallomer Ultrazentrifugenröhrchen. Schicht sorgfältig die 1,0 M HEPES-gepufferter Saccharose-Lösung auf der Oberseite der 1,2 M HEPES-gepufferter Saccharose-Lösung. Schließlich Schicht das 0,8 M HEPES-gepufferter Saccharose-Lösung auf der Oberseite der 1,0 M HEPES-gepufferter Saccharose-Lösung. Verwenden Sie eine frische Pasteur-Pipette für jedes Saccharose-Lösung und kümmern uns nicht um die Saccharose-Gradienten zu stören. Vibrationen von einer Bank oder Mikrowirbel wird die Integrität des Gradienten zu stören.
  3. Verwendung einer Pasteur-Pipette resuspendiert Schicht die synaptosomale Membranfraktion (P3) auf der Oberseite des vorbereiteten diskontinuierlichen Saccharosegradienten.Stellen Sie sicher, dass die Gradienten durch Wiegen sie in den Eimer des Schwingbecherrotor ausgeglichen. Wenn die Eimer nicht ausgeglichen sind, verwenden Sie ein P200-Pipette vorsichtig hinzufügen 0,32 M HEPES-gepufferte Saccharose an die Spitze des Gradienten und das Gleichgewicht der Rotorschaufeln.

9. Fraktionierung der synaptischen Plasmamembran (SPM)

  1. Ultrazentrifuge in einem Schwingbecher-Rotor bei 150.000 × g für 2 h bei 4 ° C ist. Die Saccharose-Gradienten vorsichtig aus dem Eimer Ultrazentrifuge. Verwendung einer 18 G-Nadel und einer 1 ml-Spritze durchstoßen das Rohr an der Unterseite der 1,0 M / 1,2 M HEPES-gepufferter Saccharose-Lösung Interphase und zieht die synaptischen Plasmamembranschicht (SPM).
  2. Notieren Sie sich die Lautstärke, die jedes SPM Probe in der 1 ml Spritze einnimmt. Legen Sie die gesammelten SPM Schicht in 3,5 ml dickwandigen Rohren Ultrazentrifuge, fügen Sie genau 2,5 Volumen 4 mM HEPES, um die Saccharose-Konzentration von 1,2 m bis 0,32 M. einstellen Sobald jeder Probe wurde einstellened auf 0,32 M Saccharose, mit 0,32 M HEPES-gepufferte Saccharose-Lösung das Gleichgewicht der Rohre.
  3. Ultrazentrifuge in einem Festwinkelrotor bei 200.000 × g für 30 min bei 4 ° C ist. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren synaptischen Plasmamembranpellet (SPM) in 300 ul 50 mM HEPES / 2 mM EDTA-Lösung. Proben bei -80 ° C bis zur Western-Blot verwendet.

10. Herstellung der postsynaptischen Dichte Fraktion (PSD)

  1. Auftauen SPM Proben auf Eis.
  2. Machen Sie eine Lösung von 0,54% Triton X-100 in 50 mM HEPES / 2 mM EDTA-Lösung.
  3. In einem 5 ml-Polystyrolröhrchen, kombinieren 2,7 ml Triton X-100 / HEPES / EDTA-Lösung und 300 ul SPM Fraktion und Drehen der Probe für 15 min bei 4 ° C
  4. Übertragungs Proben zu 3,5 ml dickwandiger Rohre Ultrazentrifuge und Zentrifugenproben bei 32.000 × g für 20 min bei 4 ° C ist.
  5. Reservieren Sie den Überstand (Triton X-100 löslichen Fraktion [TS]) und bei -80, ° C. HINWEIS: In dieser Stufe wird das Pellet stellt die "PSD-1T" Fraktion. Eine zweite Behandlung mit Reinigungsmittel ein "PSD-2T" Fraktion zu produzieren. Wenn eine PSD-1T-Fraktion gewünscht wird, gehen Sie zu Schritt 10.6.
    1. Um ein PSD-2T Fraktion produzieren, das Pellet in 3 ml 0,5% Triton X-100 in 50 mM HEPES / 2 mM EDTA-Lösung. Drehen Proben für 15 min bei 4 ° C ist. Zentrifugieren Sie die Proben bei 32.000 g für 20 min bei 4 ° C und gehen Sie zu Schritt 10.6.
  6. Überstand verwerfen und resuspendieren postsynaptischen (PSD) Pellet in 50 mM HEPES / 2 mM EDTA-Lösung. HINWEIS: Die Resuspension Volumen kann von der Größe der Pellets ab; ein Volumen von 50-75 ul empfohlen. Weil der PSD-Fraktion eine Waschmittel-unlöslichen Fraktion, ist es oft notwendig, 1-2 ul 0,5% SDS in den vollständigen Resuspendierung des Proteins zu ermöglichen. Proben bei -80 ° C bis zur Western-Blot verwendet.

Ergebnisse

Die Vorbereitung der Saccharosedichtegradienten sollten in einer klaren Trennung der drei Mol-Lösungen von Saccharose (0,8, 1,0 und 1,2 M Saccharose) führen. Siehe 3A ein Beispiel des Verlaufs bevor die Proteinprobe zugegeben. Wenn der Gradient zu viel im Voraus vorbereitet, oder wenn es auf einer Arbeitsfläche, mit Vibrationen von anderen Geräten hergestellt, wird der Gradient verglichen werden kann und korrekte Trennung nicht erreicht werden. Wenn eine klare Trennung der drei Lösungen nicht sicht...

Diskussion

Es gibt mehrere Schritte in der Prozedur, die entscheidend für ein erfolgreiches Ergebnis sind. In Schritt 3 ist es wichtig, dass ein gleichmäßiger Grad der Homogenisierung wird für jede Probe erreicht. Beim Homogenisieren Gewebe mit dem Motor angetrieben Homogenisator wird eine konstante Geschwindigkeit nicht nur für die Drehbewegung des Stößels, sondern auch mit der Anzahl von Hüben. Die Inkubationszeit bei der osmotischen Schock sollten präzise sein, da längere Homogenisierung oder Inkubation in der hypoton...

Offenlegungen

The authors have no conflicts of interest to disclose.

Danksagungen

The authors thank Dr. Mike Ehlers and his laboratory members for originally demonstrating the protocol for subcellular fractionation of synaptic plasma membranes. We also thank Wendy Horsfall for management of the mouse colonies. This work was supported by operating grants from CIHR (AJR and AS).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1M HEPES, pH 7.4BioShopHEP003.100
HEPESBioShopHEP001.500 
Sucrose BioShopSUC507.1
EDTABioBasicEB0185
PMSFBioShopPMS123.5
AprotininBioShopAPR600.1
LeupeptinBioShopLEU001.1
PepstatinBioShopPEP605.5
BenzamidineBioShopBEN601.25
Sodium fluorideBioShopSFL001.100
Sodium pyrophosphateBioShopSPP310.100
Sodium orthovanadateBioShopSOV664.10
β-glycerophosphateBioShopGYP001.10
Triton X-100BioShopTRX506.500
18G x 1 ½” needleBD305196
1cc syringeBD309659
Name of EquipmentCompanyCatalog number
Glass Teflon homogenizer Kontes Duall 23VWRKT885450-0023
IKA Model RW 16 Basic StirrerIKA Works2572100
Sorvall SM-24 Fixed Angle RotorThermoScientific29017
Sorvall RC 6 Plus CentrifugeThermoScientific46910
Thinwall Polyallomer Tubes (13.2mL)Beckman Coulter331372
SW 41 Ti Rotor Swinging BucketBeckman Coulter331362
Beckman L-80 Floor UltracentrifugeBeckman Coulter
Thickwall Polycarbonate Tubes (3.5mL)Beckman Coulter349622
TLA-100.3 Fixed Angle RotorBeckman Coulter349481
Beckman TL-100 Tabletop UltracentrifugeBeckman Coulter

Referenzen

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