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Resumo

Este artigo fornece detalhes sobre o enriquecimento de proteínas associadas com a membrana de plasma sináptico por ultracentrifugação num gradiente de sacarose descontínuo. A elaboração definitiva de proteínas de densidade pós-sináptica é também descrito. Preparações de proteínas são adequados para western blot ou análise 2D DIGE.

Resumo

Técnicas de fraccionamento subcelular neuronais permitir a quantificação de proteínas, que são objecto de tráfico de e para a sinapse. Tal como foi inicialmente descrito, no final dos anos 1960, as proteínas associadas à membrana plasmática sináptica pode ser isolado por ultracentrifugação em gradiente de densidade de sacarose. Uma vez que as membranas sinápticas são isolados, o complexo macromolecular conhecido como a densidade pós-sináptica pode ser subsequentemente isolado devido à sua insolubilidade em detergente. As técnicas utilizadas para isolar membrana plasmática sináptica e proteínas de densidade pós-sináptica permanecer essencialmente o mesmo depois de 40 anos, e são amplamente utilizados em pesquisas de neurociência atual. Este artigo fornece detalhes sobre o fraccionamento de proteínas associadas com a membrana plasmática sináptica e pós-sináptica de densidade utilizando um gradiente de sacarose descontínuo. Resultantes preparações de proteínas são adequados para western blot ou análise 2D DIGE.

Introdução

Os neurônios se comunicam através de sinapses, ea qualidade desta comunicação é regulado, em grande medida por alterações na composição das proteínas na sinapse. Em particular, as proteínas localizadas na densidade pós-sináptica participar na comunicação neuronal por receptores de neurotransmissores intimamente andaime com os seus sistemas de transdução de sinal 1. Além disso, alterações na duração da força de eficácia sináptica são controladas por meio da adição ou remoção de receptores na densidade pós-sináptica 1-6. Portanto, o isolamento e quantificação de proteínas sinápticas é uma técnica útil e necessário para obter insights sobre os caminhos que os neurônios respondem a estímulos e alterar eficácia sináptica 7. Este artigo descreve uma técnica comum para isolar proteínas sinápticas de tecido cerebral dos roedores por ultracentrifugação em gradiente de sacarose descontínuo. A fracção de membrana de plasma sináptico podem ser enriquecidas e isoladas com base ema sua densidade em sacarose, que tenha sido determinada empiricamente para ser semelhante a 1,2 M de sacarose.

Dependendo da causa biológica, fracções subcelulares podem ser separados por gradientes contínuos ou descontínuos de Percoll ou sacarose ou. Gradientes contínuos permitem a separação de proteínas em várias fracções; isto pode ser particularmente útil para demonstrar a co-localização de proteínas no interior de uma dada fracção 8. No entanto, a preparação de gradientes contínuos é mais trabalhoso e não é necessária para muitas aplicações. Gradientes descontínuos são comparativamente mais fáceis de preparar e pode ser usada para separar proteínas em algumas fracções, geralmente definidos. Gradientes descontínuos que são compostos por três camadas de aumento de sacarose molaridade têm sido amplamente utilizados para isolar as proteínas associadas com a membrana de plasma sináptico (SPM). Esta fracção de membrana de plasma sináptico pode ser ainda processado para a fractio densidade pós-sináptican (PSD) por tratamento com detergente e isolamento da fracção insolúvel em detergente.

Quando este processo foi descrito pela primeira vez na década de 1960 9,10, microscopia eletrônica foi utilizada para demonstrar as organelas e membranas que cerca definem a membrana plasmática sináptica e frações de densidade pós-sináptica 9-14. Estes estudos demonstraram a inclusão de membranas pré-e pós-sinápticos e vesículas sinápticas em fracção do SPM; após tratamento com detergente principalmente o elétron-denso, densidade pós-sináptica eram visíveis. No processo, um choque hipotónico é usado para comprimir fora os processos sinápticas do corpo da célula 10. Esta etapa leva vantagem de o facto de que as mitocôndrias são mais resistentes a choque osmótico e permanecem intactos, de modo que eles e sedimentam na parte inferior do gradiente de sacarose (Figura 1).

Usando a mesma técnica de enriquecimento, as frações de SPM e PSD foram os primeiros bioquimicamentedefinido por electroforese em gel de poliacrilamida e sequenciação dos principais componentes proteicos 15-17. Análise de mancha ocidental Subsequentemente foi usado para detectar e quantificar os níveis de proteínas sinápticas e ainda definir estas fracções (Figura 2). Nós temos usado essa técnica em nossos laboratórios para quantificar mudanças nos níveis sinápticos do transportador de dopamina que ocorrem quando o locus SLC6A3 é duplicada em camundongos 18. Também tenho usado essa técnica em receptores NMDA camundongos deficientes para descobrir reduções específicas de sinapse em proteínas que fazem parte da DISC1 interactome 19.

É evidente a partir da análise de Western blot que fracções SPM contêm proteínas de membrana de vesícula sináptica, marcadores endossoma, proteínas mitocondriais, enzimas associadas à membrana sintéticas e moléculas de transdução de sinal, bem como componentes integrais da densidade pós-sináptica e as membranas de plasma sinápticas 20-23. Efracções PSD ven pode ter contaminação com proteínas mitocondriais abundantes e pode ser necessário realizar um segundo gradiente de sedimentação ou de passos de purificação adicionais para removê-los 13. Recentemente, a espectrometria de massa quantitativo tem fornecido uma lista de mais de 100 proteínas na densidade pós-sináptica por si só, bem como uma indicação da abundância relativa destes componentes 24,25.

Protocolo

O protocolo a seguir está de acordo com as diretrizes do Conselho Canadense de Cuidado Animal e foi aprovado pela Faculdade de Medicina e do Comitê Animal Care Farmácia da Universidade de Toronto.

1 Prepare Obrigatório Reagentes conforme descrito na Tabela 1

  1. Adicionar protease e da fosfatase (se necessário) os inibidores a todas as soluções de sacarose, tampões e ddH2O para concentrações descritas na Tabela 1. Importante: executar todos os passos a 4 ° C e pré-fresco todos os reagentes e equipamentos antes do início da experiência. Rotular todos os tubos, incluindo tubos de ultracentrífuga, com marcador permanente.

2 Dissecção da região do cérebro adequada

  1. Sacrificar o animal por deslocamento cervical ou decapitação. Casa e eutanásia de animais de acordo com as políticas institucionais e governamentais sobre cuidados com os animais.
  2. Rapidamente remover ªe cérebro do crânio e colocar em um bloco de dissecção gelada.
  3. Dissecar a região do cérebro apropriado de tecido fresco e vá para a Etapa 3.

3. Tissue homogeneização com Motor Impulsionada Glass-Teflon Homogeneizador

  1. Coloque 50-100 mg (de SPM), ou 100-200 mg (por PSD) do tecido dissecado em um tubo de polipropileno de 13 ml rotulados, contendo 4 ml de solução de sacarose 0,32 M tamponada com HEPES. Transfira a amostra para 15 ml de um tecido de vidro cónico-moinho Teflon / homogeneizador, definir o accionamento do motor para 900 rpm (posição 7) e homogeneizar a amostra com 12 pancadas ao longo de um período de 30 seg. Use um homogeneizador de vidro-Teflon diferente entre as amostras, ou lavar o homogeneizador com água fria destilada entre amostras e seque com um Kimwipe. NOTA: até 4 g de tecido podem ser homogeneizados em 4 ml de solução de sacarose 0,32 M tamponada com HEPES, no entanto, é aconselhável a utilização de menos tecido para assegurar o fraccionamento adequado.
  2. Transferir a amostra homogeneizada para trás to o mesmo tubo de 13 ml de polipropileno. Reserva de 100 ul de homogeneizado e armazenar a -80 ° C para posterior quantificação de proteínas e análise de transferência de western da fracção de proteína total.

4. baixa velocidade de centrifugação para remover a Fração Nuclear (Yields sobrenadante S1)

  1. Centrifugar o homogenato num rotor de ângulo fixo a 900 xg durante 10 min a 4 ° C. Transferir o sobrenadante (S1) para um novo, rotulado 13 ml tubo e ressuspender o sedimento de fracção nuclear (P1) em 500 mL de sacarose 0,32 M tamponada com HEPES. NOTA: O (P1) fracção pode ser armazenada a -80 ° C e utilizada para a análise de transferência western da fracção nuclear.

5. enriquecimento da fracção bruta sinaptossomais (Yields Pellet P2)

  1. Centrifuga-se o sobrenadante (S1) a 10.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Retirar o sobrenadante (S2) e 500 ul de reserva em um tubo de microcentrífuga para armazenar a -80 ° C para subsequente quant proteínasificação e western blot da fração citosólica da membrana / light. Ressuspender o sedimento fracção sinaptosomal em bruto remanescente (P2) em 1 ml de solução de sacarose 0,32 M tamponada com HEPES e, em seguida, adicionar uma outra solução de 3 ml de sacarose 0,32 M tamponada com HEPES.
  2. Centrifuga-se a 10000 x g durante 15 min a 4 ° C. Retirar o sobrenadante (S2) e de reserva de 500 ul num tubo de microcentrífuga para armazenar a -80 ° C para posterior quantificação de proteínas e análise de Western blot da fracção citosólica membrana / luz. Salve o pellet sinaptosomal bruto lavado (P2 ') no tubo de polipropileno.

6. Lise (hiposmótico Choque) da Fração Crude sinaptossomais

  1. Lise do sedimento sinaptosomal bruto (P2 ') no tubo de polipropileno por ressuspensão lo em 1 ml de ddH 2 O. Adicionar mais 3 ml de DDH 2 O, transferir para um homogeneizador de tecido de vidro-Teflon, e homogeneizar à mão com três golpes. NOTA: É importantepara realizar esta etapa o mais rápido possível e rapidamente avançar para o passo 6.2.
  2. Amostras de transferência do homogeneizador de volta na mesma 13 ml tubo de polipropileno e rapidamente ajustar a amostra de volta para HEPES 4 mM com 16 mL de uma solução M HEPES, inverter para misturar.
  3. Rodar as amostras a 4 ° C durante 30 minutos para assegurar a lise completa.

7 Enriquecimento da Fração sinaptossomais Membrane (P3)

  1. Centrifuga-se a 25000 x g durante 20 min a 4 ° C. Retirar o sobrenadante fracção vesicular bruto (S3) e reservar com um tubo de 5 ml para armazenar a -80 ° C para posterior quantificação de proteínas e análise de transferência de western. Ressuspender a fracção de membrana sinaptosomal (P3) em 1 ml de solução de sacarose 0,32 M tamponada com HEPES.

8 Preparação do gradiente de sacarose descontínuo

  1. Pipetar exactamente 3,5 ml de solução de sacarose 1,2 M tamponada com HEPES e exactamente 3,0 ml cada de 1,0 M e 0,8 M HEPESolução de sacarose tamponada-S em separado 6 ml encaixar tubos de capitalização. NOTA: Isto é feito a pré-medir os volumes dos buffers que são usados ​​para fazer o gradiente de sacarose. Medição exacta dos volumes é importante para assegurar que os gradientes resultantes irá ser equilibrada por ultracentrifugação.
  2. Usando uma pipeta Pasteur e bulbo de vidro, transferir 1,2 M HEPES solução de sacarose a 12 ml polialómero tubo ultracentrífuga. Colocar cuidadosamente a solução de sacarose 1,0 M HEPES no topo da solução de sacarose 1,2 M tamponado com HEPES. Por fim, a camada de solução de sacarose 0,8 M HEPES no topo da solução de sacarose 1,0 M tamponado com HEPES. Use uma pipeta Pasteur fresco para cada solução de sacarose e tomar cuidado para não perturbar o gradiente de sacarose. As vibrações de um vórtice banco ou microcentrifuge vai perturbar a integridade do gradiente.
  3. Utilizando uma pipeta de Pasteur, a camada de fracção de membrana sinaptosomal ressuspenso (P3) na parte superior do gradiente de sacarose descontínuo preparado.Certifique-se de que os gradientes são equilibradas por pesá-las dentro do balde da caçamba móvel rotor. Se os recipientes não estão equilibrados, utilizar uma pipeta de P200 para adicionar cuidadosamente sacarose 0,32 M tamponada com HEPES para o topo do gradiente e equilibrar os baldes de rotor.

9 Fracionamento do Plasma Membrane Synaptic (SPM)

  1. Ultracentrífuga num rotor basculante a 150.000 xg durante 2 horas a 4 ° C. Remova cuidadosamente os gradientes de sacarose dos baldes de ultracentrífuga. Usando uma agulha de 18 G e seringa de 1 ml, perfurar o tubo no fundo da solução de sacarose 1,0 M interfase / 1,2 M de HEPES e retirar a camada de membrana de plasma sináptico (SPM).
  2. Anote o volume que cada amostra SPM ocupa na seringa de 1 ml. Coloque a camada SPM recolhido em 3,5 ml de tubos de ultracentrífuga de parede espessa, adicionar exactamente 2,5 volumes de HEPES 4 mM para ajustar a concentração de sacarose de 1,2 M a 0,32 M. Depois de cada amostra foi ajustared para 0,32 M de sacarose, equilibrar os tubos com solução de sacarose 0,32 M HEPES.
  3. Ultracentrífuga num rotor de ângulo fixo a 200.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Remova e descarte o sobrenadante. Ressuspender o sedimento de membranas de plasma sináptico (SPM) em 300 ul de solução 50 mM de EDTA HEPES / 2 mM. Armazenar as amostras a -80 ° C até ser utilizado para transferência de western.

10 Preparação da Fração densidade pós-sináptico (PSD)

  1. Descongele amostras SPM no gelo.
  2. Adicione uma solução de 0,54% de Triton X-100 em solução de EDTA a 50 mM de HEPES / 2 mM.
  3. Em um tubo de poliestireno de 5 ml, 2,7 ml de combinar de Triton X-100 / HEPES / solução de EDTA e 300 ul fracção SPM e girar a amostra durante 15 min a 4 ° C
  4. Amostras de transferência para 3,5 ml tubos de ultracentrífuga de parede espessa e amostras centrifugar a 32.000 xg por 20 min a 4 ° C.
  5. Reservamo-nos o sobrenadante (Triton X-100 fração solúvel [TS]) e armazenar a -80; ° C. NOTA: Nesta fase, o pellet representa a fração "PSD-1T". Um segundo tratamento com detergente vai produzir uma fracção de "PSD-2T". Se uma fração PSD-1T é desejada, vá para o passo 10.6.
    1. Para produzir uma fracção PSD-2T, ressuspender o sedimento em 3 ml de 0,5% de Triton X-100 em 50 mM de HEPES / EDTA a 2 mM. Rodar as amostras durante 15 min a 4 ° C. Centrifugar as amostras a 32.000 xg por 20 min a 4 ° C e vá para a etapa 10.6.
  6. Descartar o sobrenadante e ressuspender o pós-sináptica (PSD) sedimento em solução de 50 HEPES / EDTA 2 mM. NOTA: O volume de ressuspensão pode depender do tamanho do pelete; Recomenda-se um volume de 50-75 mL. Porque a fracção PSD é uma fracção insolúvel em detergente, é muitas vezes necessário adicionar 1-2 mL de 0,5% de SDS, para permitir a ressuspensão completa de proteína. Armazenar as amostras a -80 ° C até ser utilizado para transferência de western.

Resultados

A preparação do gradiente de densidade de sacarose deve resultar em uma separação clara entre as três soluções molares de sacarose (0,8, 1,0 e 1,2 M de sacarose). Ver Figura 3A para um exemplo do gradiente é adicionado antes da amostra de proteína. Se o gradiente é preparado com muita antecedência, ou se ele é preparado em uma superfície de bancada com a vibração de outro equipamento, o gradiente será comprometida e separação adequada não será alcançado. Se uma separação clara ent...

Discussão

Existem várias etapas do procedimento que são fundamentais para um bom resultado. No passo 3, é importante que um grau consistente de homogeneização é obtido para cada amostra. Quando homogeneizar o tecido com o homogeneizador accionado por motor, uma velocidade constante é utilizado não só para a rotação do pilão, mas também com o número de acidentes vasculares cerebrais. O tempo de incubação durante o choque osmótico deve ser mais preciso, uma vez que a homogeneização prolongada ou de incubação na...

Divulgações

The authors have no conflicts of interest to disclose.

Agradecimentos

The authors thank Dr. Mike Ehlers and his laboratory members for originally demonstrating the protocol for subcellular fractionation of synaptic plasma membranes. We also thank Wendy Horsfall for management of the mouse colonies. This work was supported by operating grants from CIHR (AJR and AS).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1M HEPES, pH 7.4BioShopHEP003.100
HEPESBioShopHEP001.500 
Sucrose BioShopSUC507.1
EDTABioBasicEB0185
PMSFBioShopPMS123.5
AprotininBioShopAPR600.1
LeupeptinBioShopLEU001.1
PepstatinBioShopPEP605.5
BenzamidineBioShopBEN601.25
Sodium fluorideBioShopSFL001.100
Sodium pyrophosphateBioShopSPP310.100
Sodium orthovanadateBioShopSOV664.10
β-glycerophosphateBioShopGYP001.10
Triton X-100BioShopTRX506.500
18G x 1 ½” needleBD305196
1cc syringeBD309659
Name of EquipmentCompanyCatalog number
Glass Teflon homogenizer Kontes Duall 23VWRKT885450-0023
IKA Model RW 16 Basic StirrerIKA Works2572100
Sorvall SM-24 Fixed Angle RotorThermoScientific29017
Sorvall RC 6 Plus CentrifugeThermoScientific46910
Thinwall Polyallomer Tubes (13.2mL)Beckman Coulter331372
SW 41 Ti Rotor Swinging BucketBeckman Coulter331362
Beckman L-80 Floor UltracentrifugeBeckman Coulter
Thickwall Polycarbonate Tubes (3.5mL)Beckman Coulter349622
TLA-100.3 Fixed Angle RotorBeckman Coulter349481
Beckman TL-100 Tabletop UltracentrifugeBeckman Coulter

Referências

  1. Delint-Ramirez, I., et al. In vivo composition of NMDA receptor signaling complexes differs between membrane subdomains and is modulated by PSD-95 and PSD-93. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 30, 8162-8170 (2010).
  2. Wang, Q., et al. The psychiatric disease risk factors DISC1 and TNIK interact to regulate synapse composition and function. Mol Psychiatry. 16, (2010).
  3. Ehlers, M. D. Reinsertion or degradation of AMPA receptors determined by activity-dependent endocytic sorting. Neuron. 28, 511-525 (2000).
  4. Tomita, S., Fukata, M., Nicoll, R. A., Bredt, D. S. Dynamic interaction of stargazin-like TARPs with cycling AMPA receptors at synapses. Science. 303, 1508-1511 (2004).
  5. Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. C., Choquet, D. Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity. Neuron. 54, 447-460 (2007).
  6. Bats, C., Groc, L., Choquet, D. The interaction between Stargazin and PSD-95 regulates AMPA receptor surface trafficking. Neuron. 53, 719-734 (2007).
  7. Ehlers, M. D. Activity level controls postsynaptic composition and signaling via the ubiquitin-proteasome system. Nat Neurosci. 6, 231-242 (2003).
  8. Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles. J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).
  9. Rodriguez de Lores, A., Alberici, M., De Robertis, E. Ultrastructural and enzymic studies of cholinergic and non-cholinergic synaptic membranes isolated from brain cortex. Journal of Neurochemistry. 14, 215-225 (1967).
  10. Gray, E. G., Whittaker, V. P. The isolation of nerve endings from brain: an electron-microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation. J Anat. 96, 79-88 (1962).
  11. Cotman, C. W., Taylor, D. Isolation and structural studies on synaptic complexes from rat brain. J Cell Biol. 55, 696-711 (1972).
  12. Cotman, C. W., Banker, G., Churchill, L., Taylor, D. Isolation of postsynaptic densities from rat brain. The Journal of Cell Biology. 63, 441-455 (1974).
  13. Carlin, R. K., Grab, D. J., Cohen, R. S., Siekevitz, P. Isolation and characterization of postsynaptic densities from various brain regions: enrichment of different types of postsynaptic densities. The Journal of Cell Biology. 86, 831-845 (1980).
  14. Jones, D. H., Matus, A. I. Isolation of synaptic plasma membrane from brain by combined flotation-sedimentation density gradient centrifugation. Biochim Biophys Acta. 356, 276-287 (1974).
  15. Kennedy, M. B., Bennett, M. K., Erondu, N. E. Biochemical and immunochemical evidence that the "major postsynaptic density protein" is a subunit of a calmodulin-dependent protein kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80, 7357-7361 (1983).
  16. Moon, I. S., Apperson, M. L., Kennedy, M. B. The major tyrosine-phosphorylated protein in the postsynaptic density fraction is N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2B. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 3954-3958 (1994).
  17. Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein. Neuron. 9, 929-942 (1992).
  18. Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4405-4410 (2008).
  19. Ma, D. K., et al. Neuronal activity-induced Gadd45b promotes epigenetic DNA demethylation and adult neurogenesis. Science. 323, 1074-1077 (2009).
  20. Budreck, E. C., Scheiffele, P. Neuroligin-3 is a neuronal adhesion protein at GABAergic and glutamatergic synapses. The European Journal of Neuroscience. 26, 1738-1748 (2007).
  21. Wu, J., et al. Arc/Arg3.1 regulates an endosomal pathway essential for activity-dependent beta-amyloid generation. Cell. 147, 615-628 (2011).
  22. Huttner, W. B., Schiebler, W., Greengard, P., De Camilli, P. Synapsin I (protein I), a nerve terminal-specific phosphoprotein. III. Its association with synaptic vesicles studied in a highly purified synaptic vesicle preparation. J Cell Biol. 96, 1374-1388 (1983).
  23. Nagy, A., Baker, R. R., Morris, S. J., Whittaker, V. P. The preparation and characterization of synaptic vesicles of high purity. Brain Res. 109, 285-309 (1976).
  24. Cheng, D., et al. Relative and absolute quantification of postsynaptic density proteome isolated from rat forebrain and cerebellum. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 5, 1158-1170 (2006).
  25. Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).
  26. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning : a Laboratory Manual. , (1989).
  27. Eggena, M., et al. Identification of histone H1 as a cognate antigen of the ulcerative colitis-associated marker antibody pANCA. J Autoimmun. 14, 83-97 (2000).
  28. Salahpour, A., et al. Homodimerization of the beta2-adrenergic receptor as a prerequisite for cell surface targeting. J Biol Chem. 279, 33390-33397 (2004).
  29. Bernocco, S., et al. Sequential detergent fractionation of primary neurons for proteomics studies. Proteomics. 8, 930-938 (2008).
  30. Grunewald, T. G., et al. Nuclear localization and cytosolic overexpression of LASP-1 correlates with tumor size and nodal-positivity of human breast carcinoma. BMC Cancer. 7, 198 (2007).
  31. Heimann, K., Percival, J. M., Weinberger, R., Gunning, P., Stow, J. L. Specific isoforms of actin-binding proteins on distinct populations of Golgi-derived vesicles. J Biol Chem. 274, 10743-10750 (1999).
  32. Neff, R. A., Gomez-Varela, D., Fernandes, C. C., Berg, D. K. Postsynaptic scaffolds for nicotinic receptors on neurons. Acta Pharmacol Sin. 30, 694-701 (2009).
  33. Cella, N., Cornejo-Uribe, R. R., Montes, G. S., Hynes, N. E., Chammas, R. The lysosomal-associated membrane protein LAMP-1 is a novel differentiation marker for HC11 mouse mammary epithelial cells. Differentiation. 61, 113-120 (1996).
  34. Otera, H., et al. Peroxisomal targeting signal receptor Pex5p interacts with cargoes and import machinery components in a spatiotemporally differentiated manner: conserved Pex5p WXXXF/Y motifs are critical for matrix protein import. Mol Cell Biol. 22, 1639-1655 (2002).
  35. Goubaeva, F., et al. Cardiac mitochondrial connexin 43 regulates apoptosis. Biochem Biophys Res Commun. 352, 97-103 (2007).
  36. Lamers, K. J., et al. Protein S-100B, neuron-specific enolase (NSE), myelin basic protein (MBP) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in cerebrospinal fluid (CSF) and blood of neurological patients. Brain Res Bull. 61, 261-264 (2003).
  37. Arunachalam, L., et al. Munc18-1 is critical for plasma membrane localization of syntaxin1 but not of SNAP-25 in PC12 cells. Mol Biol Cell. 19, 722-734 (2008).
  38. Brandstatter, J. H., Fletcher, E. L., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D., Wassle, H. Differential expression of the presynaptic cytomatrix protein bassoon among ribbon synapses in the mammalian retina. Eur J Neurosci. 11, 3683-3693 (1999).

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