Optimierte<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Züchtung von Hühnerembryonen zu fortgeschrittenen Entwicklungsstadium

Zusammenfassung

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

Zusammenfassung

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

Einleitung

Ex ovo culturing has played an important role in the study of development of the chicken^{1, 2}. This culturing method has been used to study neurological diseases, limb development, craniofacial development, and as a model to investigate malformations associated with diabetes ^{3, 4, 5}.

There are many variations to the ex ovo technique. The most common approach is to use a Styrofoam cup^6,7,8 or a glass bowl⁵. In these methods, the cup or bowl is lined with plastic wrap to cradle the embryo, a lid is placed on the cup, and the embryo is then placed in an incubator with appropriate humidity⁶. This set up however, can be technically challenging. The first challenge is the plastic wrap that is used to cradle the embryo. This wrap is difficult to work with and often does not adhere to the cup very well. To solve this problem, an elastic band is placed around the cup to hold the wrap in place. Despite this, the wrap can still slip, which is fatal to the embryo. The plastic wrap has the potential to tear or get punctured by forceps or needles that may be used during embryo manipulations and observations. Finally, this set-up is not very stable and students can easily knock the cups over. The height of the cups also makes it very difficult to place the embryo under a stereomicroscope, which has a limited objective to stage height. These challenges make it difficult for undergraduate students to work with live chick embryos in teaching labs, such as advanced developmental biology courses.

The above challenges in the ex ovo method has meant that researchers turn to the windowing method ^9,10 to view embryonic chick development. In this technique, a hole or “window” is made in the eggshell overlying the embryo. The hole can be re-sealed with tape or wax⁹ to allow for further embryonic development. Although the windowing method has some advantages, such as the ability to view embryonic development and easy maintenance, this method also has several limitations. The first is that the window needs to be fairly large in order to view the entire embryo (especially at late stages). Secondly, large windows are difficult to seal; an improper seal will lead to sterility and survivability problems. Using molten wax as a sealant adds another inconvenient and messy step to the protocol. Therefore, although the windowing method may be ideal for chick embryos at young stages (HH 11 – HH 27), viewing the entire embryo at late stages is not easily accomplished.

Here, we describe an improved and simple ex ovo culturing technique¹¹ that avoids the need for high tech equipment, is easy to handle under a stereomicroscope, gives the embryo enough support to perform microscopic manipulations, and enables researchers to view the growth of the embryo in its entirety well into the later stages of development (up to HH 40-41). With these advances in the ex ovo technique, individuals gain access to a more complete understanding of embryonic development. For instance, growth into later stages allows individuals to observe developmental processes that do not occur until this time point, such as ossification, feather development, and advanced limb and eye development. The entire embryo and extraembryonic membranes and vasculature are clearly visible. More advanced research can also be performed, such as, embryonic manipulations (i.e., implanting beadssoaked in inhibitors or inserting barriers between tissue layers), and researchers are then able to observe the effect of the manipulations in later stage embryos.

Protokoll

Hinweis: Alle Lieferungen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

1. Speichern der Hühnerembryonen

1. Inkubieren Hühnereier des Stammes Gallus gallus horizontal ^bei 37 ° C mit ca. 40% Luftfeuchtigkeit und schalten Eier einmal oder zweimal täglich. Drehen Eier ist wichtig, den Embryo aus auf die Eierschale haftet.
2. Sie nicht, das Ei in den 24 Stunden vor der Einrichtung der Kultur, da sonst der Embryo ventral der Dottermasse entfernt werden und wird beim Öffnen der Eier in Schritt 3 Zusätzlich beschädigt schalten, halten Sie die Eier bei 4 ^o C Grad für nicht mehr als eine Woche vor der Inkubation auf "halt" Entwicklung, aber das ist nicht ideal.

2. Staging Hühnerembryonen

1. Stufe die Hühnerembryonen mit dem Hamburger und Hamilton ¹² Staging-Tabelle. Die ideale Bühne für die Einrichtung des Ex-ovo-Kultivierung ist HH Stadium 19-20 (ca. 3 Tagen Inkubation) because dies kurz nach der Kopf dreht sich mit 53 HPF.
   Hinweis: HH Stadium 19-20 wird durch folgende morphologische Merkmale gekennzeichnet: Somiten in die Mehrheit der Schwanz verlängert, aber die ganz am Ende der Schwanz bleibt unsegmentierten die Schwanzknospe gewellt ist, ist die Allantois klein und hat Gefäßsystem beschränkt, die Beinknospen sind größer als die Flügelknospen und die Augen sind nicht pigmentierten oder haben eine gräuliche Farbe.

3. Entfernen der Embryo von der Shell

1. Vor dem Entfernen der Embryo aus der Schale, sprühen die Shell mit 70% Ethanol und lassen Sie ihn trocknen. Das Ei Schalten Sie nicht schnell, da dies den Embryo schädigen.
2. Darauf achten, daß die Ausrichtung des Eier verändern, vorsichtig knacken das Ei an der Unterseite (dh der Seite, die während der Inkubation ventralen war) und lassen den Embryo in eine sterile wiegen Boot (88 x 88 x 23 mm). Wischen Sie wiegen Boote mit 70% Ethanol. Untersuchen Sie den Embryo, um sicherzustellen, dass der Dottersack nicht beschädigt wird. Wenn das Eigelb hgebrochen, entsorgen Sie den Embryo, da es nicht überlebt.
3. Beachten Sie die Embryos zu gewährleisten, dass es machbar ist; das Herz schlägt, erscheint Gefäßsystem normal und keine offensichtlichen Anomalien vorhanden sind. Sicherzustellen, dass die Ränder des Wägeschiffchen trocken sind.
4. Mit einer Pipette fallen 40 ul Penicillin / Streptomycin (5.000 Einheiten Penicillin, 5 mg Streptomycin pro ml) auf der Oberseite des Albumin zur Verhinderung einer Infektion.

4. Vorbereiten der Feuchtekammer

1. Eine kleine Stapel von Kim-Wipes und / oder ein absorbierendes Kissen aus Baumwolle in den Boden einer sterilen Kunststoffbehälter (12 x 12 x 6 cm) abgewischt und mit 70% Ethanol.
2. In sterilem destilliertem Wasser, um die kim-Wischtücher und / oder Baumwolle (ca. 150 ml Wasser) befeuchten.

5. Montage der Ex Ovo Kultur

1. Legen Sie die wiegen Boot, das die Embryos auf der Oberseite des feuchten Polsterung. Dann Ort Hälfte eines quadratischen sterile Petrischale (9.5 x 9.5 cm) oben auf ter Boot wiegen, um eine lose Deckel zu bilden.
2. Decken Sie die Kunststoffbehälter mit Deckel. Drücken Sie zwei Ecken des Deckels, eine Teildichtung, die noch ermöglicht eine gute Luftzirkulation in der Kammer gewährleistet.
3. Legen Sie das Setup in das ³⁷ ° C-Inkubator, bis die gewünschte Stufe.
4. Platzieren Behälter Wasser in den Inkubator zur Kontrolle der Feuchtigkeit, wenn ein kontrollierter Luftfeuchtigkeit Inkubator nicht verfügbar ist. Sterilisieren Sie das gesamte Wasser in den Feuchtekammern und in den Inkubator und füllt als während der Inkubationszeit benötigt. 40% Luftfeuchtigkeit ist ideal.

Ergebnisse

Diese ex ovo Verfahren erlaubt die Beobachtung von Embryonen aus einem frühen Entwicklungsstadium (HH 19/20) zum fortgeschrittenen Stadium der Entwicklung (HH 40-41) (1A und 1B). Einrichten der Kultur bei HH 19-20 erhöht die Überlebensfähigkeit der Embryonen in der Kultur. Vor dem Drehen des Kopfes (vor 53 HPF) Überlebensfähigkeit in Kultur und nach der Stufe 21 sehr niedrig ist, neigt der Embryo mehr an die Shell auf Entfernung bleiben so weniger intakte Embryonen gewonn...

Diskussion

Ex Ovo Kultivierung und Fenster beide haben Vorteile und Herausforderungen. Hier vergleichen wir die Vorteile und Herausforderungen der Styroporbecher ex ovo-Methode und der Fenster Methode, um unsere verbesserte ex ovo Methode angezeigt. Unsere Methode ermöglicht Manipulation und einfache Beobachtung des Hühnerembryos in späten Entwicklungsstadien und unsere Verbesserungen der traditionellen ex ovo Verfahren ^{1, 2, 3} machen es zudem sehr einfach, in grundständigen Lehre...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Penicillin/Streptomycin	Sigma	P4458	Make small aliquots to avoid freeze/thaw events
Square Petri Dish			9.5 cm x 9.5 cm
Weigh Boat	Fischer Scientific	8732113	88 x 88 x 23 mm
Ziplock container	Ziplock	N/A	12 cm x 12 cm x 6 cm