최적화<em&gt; 전 비켜</em&gt; 개발의 고급 단계에 병아리 배아의 배양

요약

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

초록

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

서문

Ex ovo culturing has played an important role in the study of development of the chicken^{1, 2}. This culturing method has been used to study neurological diseases, limb development, craniofacial development, and as a model to investigate malformations associated with diabetes ^{3, 4, 5}.

There are many variations to the ex ovo technique. The most common approach is to use a Styrofoam cup^6,7,8 or a glass bowl⁵. In these methods, the cup or bowl is lined with plastic wrap to cradle the embryo, a lid is placed on the cup, and the embryo is then placed in an incubator with appropriate humidity⁶. This set up however, can be technically challenging. The first challenge is the plastic wrap that is used to cradle the embryo. This wrap is difficult to work with and often does not adhere to the cup very well. To solve this problem, an elastic band is placed around the cup to hold the wrap in place. Despite this, the wrap can still slip, which is fatal to the embryo. The plastic wrap has the potential to tear or get punctured by forceps or needles that may be used during embryo manipulations and observations. Finally, this set-up is not very stable and students can easily knock the cups over. The height of the cups also makes it very difficult to place the embryo under a stereomicroscope, which has a limited objective to stage height. These challenges make it difficult for undergraduate students to work with live chick embryos in teaching labs, such as advanced developmental biology courses.

The above challenges in the ex ovo method has meant that researchers turn to the windowing method ^9,10 to view embryonic chick development. In this technique, a hole or “window” is made in the eggshell overlying the embryo. The hole can be re-sealed with tape or wax⁹ to allow for further embryonic development. Although the windowing method has some advantages, such as the ability to view embryonic development and easy maintenance, this method also has several limitations. The first is that the window needs to be fairly large in order to view the entire embryo (especially at late stages). Secondly, large windows are difficult to seal; an improper seal will lead to sterility and survivability problems. Using molten wax as a sealant adds another inconvenient and messy step to the protocol. Therefore, although the windowing method may be ideal for chick embryos at young stages (HH 11 – HH 27), viewing the entire embryo at late stages is not easily accomplished.

Here, we describe an improved and simple ex ovo culturing technique¹¹ that avoids the need for high tech equipment, is easy to handle under a stereomicroscope, gives the embryo enough support to perform microscopic manipulations, and enables researchers to view the growth of the embryo in its entirety well into the later stages of development (up to HH 40-41). With these advances in the ex ovo technique, individuals gain access to a more complete understanding of embryonic development. For instance, growth into later stages allows individuals to observe developmental processes that do not occur until this time point, such as ossification, feather development, and advanced limb and eye development. The entire embryo and extraembryonic membranes and vasculature are clearly visible. More advanced research can also be performed, such as, embryonic manipulations (i.e., implanting beadssoaked in inhibitors or inserting barriers between tissue layers), and researchers are then able to observe the effect of the manipulations in later stage embryos.

프로토콜

참고 : 모든 소모품은 표 1에 나열되어 있습니다.

1. 닭 배아를 저장

1. 약 40 %의 습도 루스가 37 ^℃로 수평 루스 균주의 닭 알을 품어 한 번 또는 두 번 매일 계란을 켭니다. 달걀을 돌리면 껍질에 부착 배아를 방지하는 것이 중요하다.
2. 4 ^O C에서 계란을 유지, 이전에, 그렇지 않으면 배아는 노른자 질량에 복부를 위치 할 것이며, 또한 3 단계에서 계란을 여는 손상되는 바와 같이 문화를 설정하여 24 시간에 계란을 설정하지 마십시오 "정지"개발에 배양하기 전에 이하 1 주일도하지만이 적합하지 않습니다.

2. 닭 배아를 준비

1. 햄버거와 해밀턴 ⁽¹²⁾ 스테이징 테이블을 사용하여 닭 배아를 스테이지. 전 비켜 배양를 설정하는 이상적인 단계는 HH 단계 19 ~ 20 (배양 3 약 일) 벡입니다ause이는 머리가 53 HPF에서 전환 직후입니다.
   주 : HH 단계 19-20는 다음의 형태 학적 특성을 특징으로한다 : somites 꼬리의 과반수로 연장되어 있지만, 꼬리의 끝은 꼬리 봉오리가 말려, 비분 남아 allantois이 작고 맥관 한계가 다리 싹이 날개 - 싹이보다 큰하고 눈은 착색 또는 회색 빛 색조를 가지고있다.

3. 쉘에서 배아를 제거

1. 쉘에서 배아를 제거하기 전에, 70 % 에탄올로 쉘을 스프레이하고 건조 할 수 있습니다. 이 배아를 손상되므로 신속하게 계란을 끄지 마십시오.
2. 조심하는 것은 조심스럽게 아래쪽에 계란을 균열, 달걀의 방향을 변경하지 (즉, 배양 중에 복부이었다 측)과 멸균에 배아를 해제 보트 (88 X 88 X 23mm)에 무게. 닦아 70 % 에탄올 보트의 무게. 노른자 자루가 손상되지 않았는지 확인하기 위해 배아를 검사합니다. 노른자 시간의 경우깨진로 생존하지 않으므로, 배아를 폐기합니다.
3. 그것이 가능한 지 확인하기 위해 배아를 관찰; 심장 박동, 혈관은 정상 나타나고, 명백한 이상이 존재하지 않습니다. 무게 보트의 가장자리가 건조되었는지 확인합니다.
4. 피펫을 사용하여 감염을 방지하기 위해 알부민의 상단에 페니실린 / 스트렙토 마이신의 40 μL (5,000 단위의 페니실린, 1 mL 당 5 mg을 스트렙토 마이신)를 놓습니다.

4. 습도 챔버 준비

1. 킴 와이프 ​​- 및 / 또는 멸균 플라스틱 용기 (12 X 12 X 6cm)의 바닥면으로 이루어지는 흡수 패드의 작은 스택을 놓고 70 % 에탄올로 닦았다.
2. 김 와이프 ​​및 / 또는면 (물 약 150 ml)에 축축하게 멸균 증류수를 추가합니다.

5. 예 비켜 문화 조립

1. 축축한 패딩의 상단에있는 배아를 포함하는 무게 보트를 놓습니다. 그런 다음, t의 상단에 사각형 멸균 페트리 접시 (9.5 X 9.5 cm)의 장소 반그는 느슨한 뚜껑을 형성하기 위해 보트의 무게.
2. 그 뚜껑이있는 플라스틱 용기를 커버. 여전히 챔버 내부에 좋은 공기 흐름을 허용하는 부분 도장을 보장, 뚜껑의 두 모서리를 누르십시오.
3. 조심스럽게 원하는 단계까지 37 ^O를 C 배양기에 설치를 놓습니다.
4. 제어 습도 배양기를 사용할 수없는 경우, 습도를 제어 할 수 있도록하기 위해 인큐베이터에서 물 용기를 놓습니다. 습도 챔버 및 배양기에서 모든 물을 소독 잠복기 동안 필요에 따라 보충. 40 %의 습도가 이상적입니다.

결과

방법 비켜이 전 늦게 개발의 단계 (HH 40 ~ 41) (그림 1A 및 1B)에 개발의 초기 단계 (HH 19/20)에서 배아의 관찰이 가능합니다. HH 19 ~ 20에서 문화를 설정하는 것은 문화의 배아의 생존을 증가시킨다. 생존의 문화와 단계 (21) 후 매우 낮은 (53 HPF 전) 선회 머리 이전에, 배아 적은 그대로 배아가 얻어진다 있도록 분리에 쉘에 더 집착하는 경향이있다. (약 40 % HH 40-41로 생존) 일?...

토론

배양을 모두 윈도 비켜 예 장점과 도전이있다. 여기에서 우리는 장점과 방법 비켜 스티로폼 컵 전 아래에 표시된 방법 비켜 우리의 최적화 된 예에 윈도우 방법의 문제를 비교합니다. 우리의 방법은 늦게 개발의 단계 및 방법 ^{1, 2} 비켜 전통적인 예에 대한 우리의 개선에 조작과 병아리 배아를 관찰 할 수 ^{있도록, 3} 학부 교육 실험실 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Penicillin/Streptomycin	Sigma	P4458	Make small aliquots to avoid freeze/thaw events
Square Petri Dish			9.5 cm x 9.5 cm
Weigh Boat	Fischer Scientific	8732113	88 x 88 x 23 mm
Ziplock container	Ziplock	N/A	12 cm x 12 cm x 6 cm