Identifikation von Kinase-Substrat-Pairs Mit High Throughput Screening

Zusammenfassung

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Zusammenfassung

Wir haben ein Screening-Plattform zu dedizierten menschliche Proteinkinasen phosphoryliert für Substrate, die verwendet werden können, um neue Signaltransduktionswege aufzuklären identifizieren. Unsere Vorgehensweise bietet die Verwendung einer Bibliothek von gereinigtem GST-markiertes humanes Protein-Kinasen und ein rekombinantes Protein Substrat von Interesse. Wir haben diese Technologie ein Protein für die Beta-Zellproliferation erforderlich ist, sowie die verwendet werden, um MAP / Mikrotubuli-Affinität regulierenden Kinase 2 (Modell 2) als Kinase für eine Glucose-regulierten Website auf CREB-Regulated Transcriptional Koaktivator 2 (CRTC2) zu identifizieren, Axl Familie von Tyrosinkinasen als Regulatoren der Zellmetastasen durch Phosphorylierung des Adapterprotein ELMO. Wir beschreiben diese Technologie und diskutieren, wie sie helfen können, eine umfassende Karte, wie Zellen auf Reize aus der Umwelt zu etablieren.

Einleitung

Protein posttranslationale Modifikationen (PTMs) essentiell für die intrazelluläre Kommunikation. Vielleicht ist die am besten untersuchten aller PTMs ist Phosphorylierung durch Proteinkinasen, die eine Vielzahl von Proteinfunktionen, einschließlich ihrer biochemischen Aktivität, subzelluläre Lokalisierung, Konformation und Stabilität regulieren katalysiert. Die Identifizierung von Phosphorylierungsstellen auf Zielproteine ​​können durch tryptische Phosphopeptid Kartierung oder jetzt Standard Proteomics Techniken unter Verwendung von Proben für die phosphorylierten Peptide ^1,2 angereichert erreicht werden. Während drei Viertel der zum Ausdruck Proteom sollen phosphoryliert ³ und eine identifizierte 200.000 Phosphorylierungsstellen ^5, wobei die Schätzungen bis zu 1 Mio. ^6, viele von ihnen haben keine zugewiesenen Biologie, Signalwegs oder Proteinkinase.

Während Identifizierung der phosphorylierten Websites ist relativ einfach, eine vergleichsweise größere Herausforderung ist es,identifizieren die verwandten Kinase (n), dass diese Seiten abzielt, ein Prozess, wir als Mapping-Kinase: Substrat-Paare. Mehrere Ansätze zum Identifizieren von Kinase: Substrat-Paare beschrieben wurden, entweder ausgehend von einer Kinase von Interesse und der nach seiner Substrate oder beginnend mit einem Substrat von Interesse und zu versuchen, eine modifizierende Kinase experimentell ^7-11 oder rechnerisch ¹² finden. Kinasen für eine bekannte phosphorylierte Substrat identifizieren kann Bioinformatik verwendet, um Proteine, die eine kurze konservierte Aminosäuresequenz flankieren den phosphorylierten Rest (der Konsensusstelle), sowie die Identifizierung Kinasen, die einen präzipitierbaren Komplex mit dem Substrat enthalten identifizieren. Allerdings sind diese Ansätze zeitaufwendig und oft nicht von Erfolg gekrönt.

Wir entwickelten eine systematische funktionalen Ansatz schnell zu identifizieren Kinasen, die eine gegebene ^Substrat 13 phosphorylieren kann. Der Bildschirm Assay produziert hervorragende spezifischekeit, mit sehr klaren Auswahl für eine mögliche verwandte Kinasen. Angesichts der Zentralität der Phosphorylierung an biologischen Signal, der Bildschirm ist nützlich für die Entdeckung in nahezu allen Zellsignalwege ^14-16. Der Bildschirm beinhaltet die Durchführung einer großen Kinase-Assay mit einer Bibliothek von menschlichen Proteinkinasen. Die Kinasen wurden mit bakteriellen Glutathion-S-Transferase (GST) -Protein, markiert worden und werden aus Säugetierzellextrakten gereinigt ist, was bedeutet, daß die rekombinanten Enzyme - im Gegensatz zu den aus Bakterien hergestellt, - in Gegenwart der vorgeschalteten Proteinkinasen oft die erforderliche erzeugten rekombinante Enzyme Aktivität haben in vitro. Tatsächlich, während Serin, Threonin und Tyrosin Kinaseaktivität für nachgeschaltete Kinaseaktivierung in Hefe ¹⁰ vorhanden sind, codiert das Hefegenom 122 Proteinkinasen, die anzeigt, dass die Säuger Kinoms, mit mehr als 500 Gene ¹⁷ ist wesentlich komplexer zu werden, um Regulate die Prozesse eindeutig höherer Ordnung Organismen. Darüber hinaus kann die Wirkung der relevanten Zellbiologie und menschlichen Erkrankungen (wie beispielsweise kleinen Molekülen, Wachstumsfaktoren, Hormone, etc.) verschiedene Reize zu ^14,15 modulate Kinase-Aktivität in einem geeigneten Kontext eingesetzt werden.

Protokoll

1. Vorbereitung der Reagenzien, Platten und Zellen

1. Bilden 500 ml Lyse-Puffer: 25 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 50 mM NaF, 0,5 mM EDTA pH 8,0, 0,5% Triton X-100, 5 mM beta-Glycerophosphat, 5% Glycerin. Lagerung bei 4 ° C. Unmittelbar vor der Verwendung, fügen Sie 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und 1 mM Natriumvanadat. Nach diesem Schritt wird PMSF in keiner Spülpuffer erforderlich.
2. Machen 20 ml 10x Kinase-Puffer: 200 mM Tris pH 7,5, 50 mM beta-Glycerophosphat (FW 216), 2 mM Natriumvanadat. Aliquot in 1-ml-Röhrchen und bei -20 ° C. Unmittelbar vor der Verwendung, fügen Sie 5 mM DTT.
3. Machen Sie 20 ml 10x M-ATP-Puffer: 300 um Adenosintriphosphat (ATP), 66 mM MgCl _2, 33 mM MnCl ₂ Aliquot in 1-ml-Röhrchen und bei -20 ° C.
4. Auf 100 ml 2x Natriumdodecylsulfat (SDS) Lysepuffer: 1,5 g Tris-Base, 20 ml Glycerin, 30 ml _H 2 O. Auflösen und pH-Wert auf 6,8 mit HCl. In 40ml 10% SDS, die Lautstärke auf 100 ml. In 25 mg Bromphenolblau.
5. Spot 4 ul 25 ng / ul Säuger-Expressionsplasmid ein GST-Kinase ^{14 pro} in Sätze von 96-Well-Platten und Kennzeichenschilder entsprechend kodiert gut. Dichtung und gefrier Platten bei -20 ° C bis zur Verwendung.
6. 1-2 Tage vor der Transfektion, Kultur HEK293T-Zellen in Komplett Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) + 10% fötalem Rinderserum (FBS) und Antibiotika in einem 37 ° C-Inkubator mit _CO 2 (5% final) ergänzt. Passage mit Trypsin und erlauben nicht die Aktie um> 80% konfluent während der Expansion zu werden. Für den Bildschirm (ca. 3 x 15 cm-Schalen aus HEK293T-Zellen bei 80% Konfluenz) sind mindestens 6 x ¹⁰ 7 Zellen erforderlich.

2. Transfektion

Hinweis: Siehe Abbildung 1 für ein Flussdiagramm des gesamten Protokoll.

1. Wenn Platten, die Kinase-Plasmide wurden eingefroren, bei Raumtemperatur auftauen einnd Zentrifuge bei 1.900 × g für 3 min, vorhandene Feuchtigkeit an der Unterseite der Vertiefungen sammeln.
2. Mischungs 8,6 ml reduzierte Serummedium (zB OPTI-MEM) mit 312,7 & mgr; l Lipid basierende Transfektionsreagenz. Lassen Sie sitzen für 5 min.
3. Zugabe von 10 & mgr; l der reduzierten Serummedium zu jeder Vertiefung unter Verwendung eines automatisierten Flüssigkeitsabgabevorrichtung mit einem kleinen Volumen Kassette angebracht.
4. In 10 ul pro Vertiefung der reduzierten Serum-Medium / Transfektionsreagenz Mischung aus Schritt 2.2 unter Verwendung eines automatisierten Flüssigkeitsspender mit einem kleinen Volumen Kassette ausgestattet. Lassen Sie sich für 20 bis 45 min.
5. Resuspendieren 293T-Zellen mit 7,5 ^× 10 5 Zellen / ml in 80 ml ​​vollständigem DMEM. 100 ul Zellsuspension (dh 7,5 × 10 ^{4 Zellen)} pro Vertiefung unter Verwendung eines automatisierten Flüssigkeitsabgabevorrichtung mit einem Standardvolumen Kassette angebracht.
6. Überprüfen Brunnen unter dem Mikroskop für eine gleichmäßige Zellverteilung und zum Inkubator für 24 Stunden.

3. GST-Pulldown-Kinase

1. Stellen Sie fresh: 4 mM Pervanadat-Lösung durch Mischen von 60 ul 0,2 M Natriumvanadat mit 540 & mgr; l _H 2 O In einem zweiten Rohr Mischung 2,7 ul 30% Wasserstoffperoxid und 1,4 ml PBS. Fügen Sie die beiden Lösungen zusammen und lassen Sie sich für 15 Minuten vor dem Gebrauch.
2. Mit Hilfe einer Mehrkanalpipette (verwenden Sie nicht eine automatische Flüssigkeitsspender, wie es erzeugt zu viel Turbulenz in der gut) verzichtet werden 2 ul von 0,25 M _CaCl 2 in jede Vertiefung, gefolgt von 2,5 ul des Pervanadat in Schritt 3.1 vorbereitet. Inkubieren jede Platte bei 37 ° C für 10 min und dann auf Eis zu stellen.
3. Vorbereitung 35 ml Lyse-Puffer durch Zugabe von DTT, PMSF und Natriumvanadat, wie in Abschnitt 1 (Herstellung der Reagentien) angegeben.
4. Keeping Platten auf Eis zu entfernen Medium aus jeder Vertiefung unter Verwendung einer Vakuumstrahlpumpe. Sofort im 50 ul / Vertiefung von eiskaltem Lyse-Puffer unter Verwendung eines automatisierten Flüssigkeitsspender mit einer Standardkassette ausgestattet. Lassen Sie sitzen 30 Minuten lang auf Eis zu lysieren (optional: Hier können gegebenenfalls durch Versiegelung plat stoppene und Lagerung bei -80 ° C. Um auftauen Platten auf Eis) fortsetzen.
5. Spin-Platten bei 1.900 × g für 3 min bei 4 ° C.
6. Kratzen Zellen aus jeder Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette und übertragen Sie alle Inhalte in geeigneter Weise V-Boden Platten mit 96 Vertiefungen gekennzeichnet. Spin-Platten bei 1.900 × g für 10 min bei 4 ° C.
7. Während Spin, füllen Glutathion-beschichteten Platten (eine für jede 96-Well-Platte) mit 100 ul / Vertiefung von eiskaltem Lyse-Puffer (ohne PMSF) als Spülung. Halten Platten auf Eis.
8. Entfernen V-Bodenplatten aus der Zentrifuge. Ein zu einer Zeit, zu invertieren die Glutathion-Platten über ein Waschbecken zu schütteln den Lysepuffer und Blot auf einem Papiertuch. Bringen Lysepuffer aus den V-Bodenplatten auf die Glutathion-Platten durch Kippen der Platte und mit einer Mehrkanalpipette, man aufpassen, nicht das Pellet am Boden stören. Abdeckplatten und lassen auf Eis für mindestens 2 Stunden zu binden.
9. In der Nähe des Ende der 2 Stunden Bindungsschritt, bereiten Sie einen Radiostation, die Gewährleistung tEr erforderlichen Sicherheitsvorkehrungen bestehen für radioaktive Arbeit. Stellen Hybridisierungsofen bis 30 ° C.
10. Vorbereitung 200 ml Lysispuffer durch Zugabe von DTT und Natriumvanadat wie in Abschnitt 1. PMSF deutet ist in diesem Stadium nicht erforderlich.
11. Kehren Sie die Glutathion-Platten über ein Waschbecken zu schütteln den Lysepuffer und tupfen Sie auf einem Papiertuch. Spülen Sie die Taschen 3x mit 100 ul Lysepuffer (ohne PMSF). Lassen Sie sich nicht Brunnen sitzen trocken - halten sie in Spülung bis bereit zu gehen.
12. Bereiten Sie 55 ml 1x Kinasepuffer (KB) durch Verdünnen des 10fach und das Hinzufügen von DTT, wie in Abschnitt 1. Spülen Platten einmal mit 50 ul 1x KB mit Hilfe eines automatisierten Flüssigkeitsspender mit einem Standardvolumen Kassette ausgerüstet angezeigt. Lassen 1x KB in Brunnen, bis die Lösung A bereit ist:
    1. Vorbereitung der Lösung A durch Zugabe von 500 bis 530 ug des Substrats von Interesse ist, 500 & mgr; g des basischen Myelinproteins (MBP), 2,65 ml 10 × KB, 13,25 & mgr; l 1 M DTT, _und H 2 O bis auf 15,9 ml.
13. Ein zu einer Zeit, zu invertieren die Platten über ein Waschbecken, um 1x KB Spülung entfernen, Fleck auf Papiertuch, und sofort fügen 30 ul Lösung A unter Verwendung eines automatisierten Flüssigkeitsspender mit einem kleinen Volumen Kassette ausgestattet. Halten Platten auf Eis.
14. Vorbereitung der Lösung B in den Arbeitsbereich der Radioaktivität durch Zugabe von 2,5 ml 10x M-ATP, 500 & mgr; Ci ³² P ATP gamma- und H _{2 O} auf 10 ml.
    1. In 20 ul Lösung B pro Vertiefung mit einem Repeater-Pipette, die aufgrund von Ausstoßkraft Mischhilfen. Decken und Inkubation in 30 ° C Hybridisierungsofen für 30 min.
15. Nach 30 min Übertragungsplatten wieder auf Eis. Zugabe von 50 ul 2 x SDS-Lysepuffer zu jedem Well mit einer Mehrkanalpipette. Kann an dieser Stelle, um zum nächsten Schritt, oder dichten die Platten mit Aluminiumfolie und bei -20 ° C, bis praktisch.

4. Laufsport, Färbung und Trocknung Gele

Hinweis: Alle Arbeiten sind in einem Gebiet durchgeführt werden DESIGNAted auf Radioaktivität.

1. Schalten Sie Hybridisierungsofen und auf 85 ° C eingestellt. Tau-Platten bei Raumtemperatur. Sobald Backofen Temperatur, Übertragungsplatten zum Ofen und Inkubation für 10 min, um Proben zu denaturieren erreicht.
2. Last 26-Well-Fertig Gele mit 15 ul jeder Reaktion unter Verwendung einer Mehrkanalpipette um mehrere Brunnen auf einmal zu füllen. Ist darauf zu achten, dass alle Spitzen ausgerichtet entsprechend gut, bevor Proben werden. Führen Gel bei 150 V Lassen Sie die Markierungsfarbstoff (blaue Linie) ablaufen der Unterseite des Gels, da dies enthält den unincorporated ATP.
3. Demontieren Sie die Gele und schneiden Sie die nicht rechtsfähige ATP (blaue Linie) mit einem Skalpell oder gerade Kante, wie es die Filme überbelichtet. Legen Sie die Gele in beschriftete Behälter geben und mit Coomassie-Färbung für 15 min.
4. Entfernen Sie die Coomassie-Färbung, kurz spülen Sie die Gele mit Wasser, und fügen Sie destain Lösung. Entfärben der Gele bis die Proteine ​​sind deutlich sichtbar. Ein Band für MBP und ein Band für das Substrat solltewerden für jede Probe sichtbar.
5. Um die Gele trocken:
   1. Schneiden Sie ein großes Blatt Filterpapier und legen Sie es auf dem Trockner.
   2. Befeuchten Sie ein Cellophanfolie in destilliertem Wasser, bis es glatt ist und knitterfrei, und legen Sie sie auf dem Papier.
   3. Verlegen Sie die Gele auf dem Zellophan Blech, die eine Anmerkung in der Größenordnung von Gelen. Befeuchten Sie ein zweites Blatt Cellophan und legen Sie auf der Gele.
   4. Rollen Sie alle Luftblasen (eine Platte Siegelwalze funktioniert gut für diese) für eine schöne gleichmäßige Oberfläche. Schließen Sie die Klappe, schalten Sie das Vakuum und trocknen Sie die Gele für 3 Stunden bei 80 ° C.
6. Sobald Gele trocken sind, setzen Sie sie XAR-Film mit einem Bildschirm, um das Signal zu verstärken. Wickeln Sie die Kassette mit Frischhaltefolie oder eine Plastiktüte und verschließen Sie mit Klebeband gegen Frost draußen zu halten. Bewahren Sie die Kassette bei -80 ° C über Nacht.

5. Entwicklung XAR Films

1. Am folgenden Tag, entfernen Kassette aus dem Gefrierschrank und lassen bei Raumtemperatur auftauen. Entwickeln Sie den Film inDunkelkammer unter Verwendung eines Filmprozessors gemß den Anweisungen des Herstellers.
   Hinweis: Überprüfen Sie die Folien nach Beweisen für Kinase-Substrat-Paare. Ein zweiter längerer Exposition kann auch nützlich sein schwächer Phosphorylierungsereignisse detektieren.

Ergebnisse

Repräsentative Ergebnisse von einem Bildschirm werden in Abbildung 2 dargestellt. 180 Kinasen wurden unter Verwendung eines GST-tagged Peptidsubstrat entsprechend zu AS 268-283 von CRTC2 sowie klassischen Kinaseassays Substrat das basische Myelinprotein (MBP) gescreent. Nur zwei Kinasen, MARK2 und die eng verwandte Kinase phosphoryliert das MARK3 CRTC2 Peptids. MBP ist als eine interne Kontrolle in allen Assays eingeschlossen, da es enthält viele phosphorylierbare Reste und läuft bei 18 kDa, in Richt...

Diskussion

Seit den ursprünglichen Veröffentlichungen über den Ansatz ^14,15 ist die ursprüngliche Bibliothek 180 GST-Kinasen wurden in 420 Mitglieder oder ~ 80% des menschlichen Protein Kinoms erweitert. Der erweiterte Bibliothek, die wie beschrieben Protokoll dauert 4-5 Tage und dann 1-4 Tage, um Filme zu entwickeln (wie dies notwendig erscheint), die durch die Verwendung von Phosphorimaging und digitale Signalverstärkung verkürzt werden konnte. Es gibt mehrere wichtige Schritte, bei denen darauf geachtet werden ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lysis buffer	Made in house		See Protocol step 1.1
10x kinase buffer	Made in house		See Protocol step 1.2
10x M-ATP	Made in house		See Protocol step 1.3
Human kinase plasmids	Orfeome, Invitrogen, Origene		GST-tagged in house
96 well plates	Fisher Scientific	CS003595
293T cells	ATCC	CRL-11268
DMEM	Fisher Scientific	SH3002201	supplement with 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 10% fetal calf serum.
CO2 incubator	Sanyo	MCO-17AIC
15 cm cell culture dishes	Fisher Scientific	877224
Reduced serum medium	Invitrogen	22600-050
Lipid-based transfection reagent	Invitrogen	11668-019
Automated liquid dispenser	Thermo Scientific	5840300
Small cassette attachment	Thermo Scientific	24073295
Standard cassette attachment	Thermo Scientific	14072670
4 mM pervanadate	Made in house		See Protocol step 3.1
0.25 M CaCl2	Made in house
Multichannel pipette (20-200 μl)	Labnet	p4812-200
Multichannel pipette (1-10 μl)	Thermo Scientific	4661040
V-bottom 6-well plates	Evergreen Scientific	290-8116-01V
Glutathione coated 96-well plates	Fisher Scientific	PI-15240
Hybridization oven	Biostad	350355
GST tagged substrate	Made in house
Myelin Basic Protein (MBP)	Sigma	M1891
Repeater pipette (1 ml)	Eppendorf	22266209
32P gamma-ATP	Perkin Elmer	BLU502Z500UC
2x SDS lysis buffer (100 ml)	Made in house		See Protocol step 1.4
26-well precast TGX gels	BioRad	567-1045	gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest
Coomassie stain	Made in house		0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol
Coomassie destain	Made in house		10% acetic acid, 20% methanol
Labeled gel containers	Made in house		Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel
Whatman filter paper	Fisher Scientific	57144
Cellophane sheets (2)	BioRad	165-0963
Gel dryer	Labconco	4330150
Double emulsion autoradiography film	VWR	IB1651454
Film cassette	Fisher Scientific	FBAC-1417
Intensifying screen	Fisher Scientific	FBIS-1417
Plate sealing rubber roller	Sigma	R1275