Identification de paires Kinase-substrat en utilisant criblage à haut débit

Résumé

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Résumé

Nous avons développé une plate-forme de criblage pour identifier kinases dédiés de protéines humaines pour les substrats phosphorylés qui peuvent être utilisés pour élucider de nouvelles voies de transduction du signal. Notre approche comprend l'utilisation d'une bibliothèque de protéines kinases humaine étiquetée GST purifiées et un substrat de protéine recombinante d'intérêt. Nous avons utilisé cette technologie pour identifier MAP / microtubules affinité de régulation de la kinase 2 (MARK2) en tant que kinase pour un site de glucose régulé sur CREB-réglementées transcription coactivateur 2 (CRTC2), une protéine nécessaire pour la prolifération des cellules bêta, ainsi que la famille de tyrosine kinases de Axl tant que régulateurs de la métastase des cellules de la phosphorylation de la protéine adaptatrice rétroprojecteur. Nous décrivons cette technologie et nous discutons comment elle peut aider à établir une carte complète de la façon dont les cellules répondent aux stimuli environnementaux.

Introduction

Modifications post-traductionnelles de protéines (PTM) sont essentiels pour la communication intracellulaire. Peut-être le mieux étudié de PTM est tout phosphorylation, catalysée par la protéine-kinases, qui régulent une multitude de fonctions de protéines, y compris leur activité biochimique, la localisation subcellulaire, la conformation et la stabilité. L'identification des sites de phosphorylation sur des protéines cibles peut être accomplie par la cartographie trypsique phosphopeptide ou par des techniques protéomiques maintenant standard en utilisant des échantillons enrichis pour des peptides phosphorylés ^1,2. Alors que les trois quarts du protéome exprimé devraient être phosphorylée ^{3 et un} identifiées 200.000 sites de phosphorylation ^5, avec des estimations allant jusqu'à 1 million ^6, beaucoup d'entre eux ont pas attribué la biologie, voie, ou la protéine kinase de signalisation.

Bien que l'identification des sites phosphorylés est relativement simple, comparativement plus grand défi est deidentifier la kinase apparenté (s) qui cible ces sites, un processus que nous appelons cartographie kinase: paires de substrat. Plusieurs approches pour l'identification kinase: paires de substrats ont été décrits, que ce soit à partir d'une kinase d'intérêt et à la recherche de ses substrats ou à partir d'un substrat d'intérêt et d'essayer de trouver une modification kinase expérimentalement ou par calcul ^{12 11.7.} Pour identifier les kinases pour un substrat phosphorylé connu, la bioinformatique peuvent être utilisés pour identifier des protéines qui contiennent une séquence conservée courte d'acides aminés flanquant le résidu phosphorylé (le site de consensus), ainsi que l'identification des kinases qui forment un complexe précipitable avec le substrat. Cependant, ces approches sont longues et souvent ne répondent pas avec succès.

Nous avons développé une approche fonctionnelle systématique pour identifier rapidement les kinases qui peut phosphoryler un substrat donné ^13. Le test de l'écran produit une excellente spécifiquelité, avec une sélection très clair pour les kinases apparentées potentiels. Compte tenu de la centralité de la phosphorylation de la signalisation biologique, l'écran est utile pour la découverte dans la quasi-totalité des voies de signalisation cellulaires ^14-16. L'écran consiste à effectuer une analyse de kinase à grande échelle avec une bibliothèque de protéines kinases humaines. Les kinases ont été marqués avec du glutathion bactérienne S-transférase (GST) et sont purifiés à partir d'extraits de cellules de mammifères, ce qui signifie que les enzymes recombinantes - à la différence de ceux qui sont préparés à partir de bactéries - sont générés en présence des protéines kinases en amont souvent requises pour la enzymes recombinantes ayant une activité in vitro. En effet, alors que l'activité de kinase de sérine, de la thréonine, et la tyrosine requise pour l'activation de la kinase en aval sont présents dans la levure ^10, le génome de la levure codant pour 122 protéines kinases, ce qui indique que la kinome mammifère, plus de 500 gènes ^17, est devenue nettement plus complexe dans le but de RegulaTe les processus uniques pour les organismes d'ordre supérieur. De plus, l'effet de différents stimuli pertinents pour la biologie cellulaire et la maladie humaine (tels que des petites molécules, facteurs de croissance, des hormones, etc.) peut être utilisé pour l'activité de kinase de ^14,15 moduler dans un contexte approprié.

Protocole

1. Préparation des réactifs, des assiettes et des cellules

1. Ajouter 500 ml de tampon de lyse: Tris 25 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, NaF 50 mM, EDTA 0,5 mM pH 8,0, 0,5% de Triton X-100, 5 mM de bêta-glycérophosphate, 5% de glycerol. Conserver à 4 ° C. Immédiatement avant l'utilisation, ajouter 1 mM de dithiothréitol (DTT), 1 mM de fluorure de phénylméthyl sulfonyle (PMSF), vanadate de sodium et 1 mM. Après cette étape, PMSF est pas nécessaire dans tout tampon de rinçage.
2. Ajouter 20 ml de tampon kinase 10x: Tris 200 mM pH 7,5, 50 mM de bêta-glycérophosphate (FW 216), vanadate de sodium 2 mM. Aliquote de 1 ml tubes et conserver à -20 ° C. Immédiatement avant l'utilisation, ajouter 5 mM de DTT.
3. Faire 20 ml de tampon 10x M-ATP: 300 um adénosine triphosphate (ATP), 66 _mM de MgCl2, 33 mM MnCl _2. Aliquoter dans 1 ml tubes et conserver à -20 ° C.
4. Ajouter 100 ml de 2x du dodécylsulfate de sodium (SDS) de tampon de lyse: 1,5 g de base Tris, 20 ml de glycerol, 30 ml _de H 2 O. Dissoudre et ajuster le pH à 6,8 avec HCl. Ajouter 40ml SDS à 10%, ajuster le volume à 100 ml. Ajouter 25 mg de bleu de bromophénol.
5. SPOT 4 pi de 25 ng / ul mammifère plasmide d'expression codant pour un TPS-kinase ¹⁴ par puits dans des ensembles de plaques à 96 puits et les plaques d'étiquettes en conséquence. Plaques d'étanchéité et congeler à -20 ° C jusqu'à utilisation.
6. 1-2 jours avant la transfection, les cellules HEK293T culture dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco complet (DMEM) + 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et des antibiotiques dans un incubateur à 37 ° additionné de _CO 2 (finale 5%). Passage à la trypsine et ne permettent pas le stock de devenir> 80% de confluence lors de l'expansion. Un minimum de 6 x 10 ⁷ cellules sont nécessaires pour l'écran (environ 3 x 15 cm boîtes de cellules HEK293T à 80% de confluence).

2. La transfection

Remarque: Voir la Figure 1 pour un organigramme d'ensemble du protocole.

1. Si les plaques contenant des plasmides de kinases ont été gelés, les décongeler à la température ambiante, une centrifuger à 1900 g pendant 3 min pour recueillir l'humidité au fond des puits.
2. Mélanger 8,6 ml de milieu de sérum réduit (par exemple, OPTI-MEM) avec 312,7 ul de réactif de transfection à base de lipides. Laisser reposer pendant 5 min.
3. Ajouter 10 ul de milieu de sérum réduit à chaque puits en utilisant un distributeur de liquide automatique équipé d'une cassette de petit volume.
4. Ajouter 10 ul par puits de milieu de sérum / réactif de transfection mélange réduit de l'étape 2.2 en utilisant un distributeur de liquide automatique équipé d'une cassette de petit volume. Laisser reposer pendant 20 à 45 min.
5. Remettre en suspension les cellules 293T à 7,5 x 10 ⁵ cellules / ml dans 80 ml ​​de DMEM complet. Ajouter 100 ul de suspension cellulaire (soit 7,5 x 10 ⁴ cellules) par puits en utilisant un distributeur de liquide automatique équipé d'une cassette de volume standard.
6. Vérifiez puits au microscope pour la distribution de cellules uniforme et retourner à l'incubateur pendant 24 heures.

3. déroulant TPS-kinase

1. Assurez-fresh: 4 mM de solution pervanadate en mélangeant 60 ul de 0,2 M vanadate de sodium avec 540 ul de H ₂ O. Dans un second tube de mélange de 2,7 ul de peroxyde de 30% et 1,4 ml de PBS. Ajouter les deux solutions ensemble et laisser reposer pendant 15 min avant utilisation.
2. En utilisant une pipette multicanaux (ne pas utiliser un distributeur de liquide automatisé car elle crée trop de turbulence dans le puits) dispenser 2 pi de 0,25 M CaCl ₂ dans chaque puits, suivi par 2,5 pi de la pervanadate préparé à l'étape 3.1. Incuber chaque plaque à 37 ° C pendant 10 min, puis placer sur la glace.
3. Préparer 35 ml de tampon de lyse en ajoutant la TNT, PMSF, et vanadate de sodium comme indiqué à la section 1 (Préparation des réactifs).
4. Garder plaques sur de la glace, éliminer le milieu de chaque puits en utilisant un aspirateur à vide. Immédiatement ajouter 50 pl / puits de tampon de lyse froid de la glace en utilisant un distributeur de liquide automatisé muni d'une cassette standard. Laisser reposer 30 min sur la glace de lyse (en option: peut arrêter là si nécessaire par plat d'étanchéitée et le stockage à -80 ° C. Pour continuer, plaques dégel sur la glace).
5. Plaques de tourner à 1900 g pendant 3 min à 4 ° C.
6. Grattez les cellules de chaque puits à l'aide d'une pipette multicanaux et de transférer tous les contenus à dûment étiquetés plaques à 96 puits à fond en V. Plaques de tourner à 1900 g pendant 10 min à 4 ° C.
7. Lors de l'essorage, remplissez glutathion revêtu plaques (une pour chaque plaque de 96 puits) avec 100 pl / puits de glace tampon de lyse froid (sans PMSF) comme un rinçage. Conserver les plaques sur de la glace.
8. Retirer des plaques à fond en V à partir de la centrifugeuse. Un à la fois, inverser les plaques de glutathion sur un évier pour secouer le tampon de lyse et tache sur une serviette en papier. Transfert de tampon de lyse à partir des plaques à fond en V aux plaques de glutathion en inclinant la plaque et à l'aide d'une pipette multicanaux, en faisant attention de ne pas perturber le culot au fond. Couvrir et laisser les plaques sur de la glace pendant au moins 2 heures à lier.
9. Près de la fin de l'étape de liaison de deux heures, préparer une station de travail de la radioactivité, en veillant à til précautions de sécurité nécessaires sont en place pour le travail radioactifs. Set four d'hybridation à 30 ° C.
10. Préparez 200 ml de tampon de lyse en ajoutant la TNT et de sodium vanadate comme indiqué à la section 1. PMSF est pas nécessaire à ce stade.
11. Inverser les plaques de glutathion sur un évier pour secouer le tampon de lyse et éponger sur un papier absorbant. Rincer puits 3x avec 100 tampon de lyse (sans PMSF). Ne pas laisser les puits sont assis à sec - garder dans rinçage jusqu'à ce que prêt à procéder.
12. Préparer 55 ml de tampon kinase 1x (KB) en diluant le 10x stock et ajoutant la TNT comme indiqué à la section 1. Rincer les plaques une fois avec 50 pi de 1x KB aide d'un distributeur de liquide automatisé muni d'une cassette de volume standard. Laissez 1x KB dans les puits jusqu'à ce que la solution A est prêt:
    1. Préparer la solution A en ajoutant 500 ug à 530 du substrat d'intérêt, 500 ug de protéine basique de la myéline (MBP), 2,65 ml de 10x KB, 13,25 ul de DTT 1 M, et H _{2 O} 15,9 ml jusqu'à.
13. Un à la fois, inverser les plaques sur un évier pour enlever 1x KB rinçage, éponger sur du papier absorbant, et immédiatement ajouter 30 ul de la solution A l'aide d'un distributeur de liquide automatisé muni d'une petite cassette de volume. Conserver les plaques sur de la glace.
14. Préparer la solution B dans la zone de travail de la radioactivité en ajoutant 2,5 ml 10x M-ATP, ³² P ATP de la 500 uCi, et H _{2 O} à 10 ml.
    1. Ajouter 20 pi de solution B par puits en utilisant une pipette à répétition qui aide à mélanger en raison de la force d'éjection. Couvrir et incuber à 30 ° hybridation four C pendant 30 min.
15. Après 30 minutes, transférer les plaques de retour à la glace. Ajouter 50 ul de tampon de lyse SDS 2x à chaque puits en utilisant une pipette multicanaux. Peut procéder à ce stade à l'étape suivante, ou sceller les plaques avec une feuille d'aluminium et conserver à -20 ° C jusqu'à ce que pratique.

4. course, la coloration, et les gels de séchage

Remarque: Tous les travaux doivent être effectués dans une désignation de zoneTed pour la radioactivité.

1. Tournez sur l'hybridation four et à 85 ° C. Plaques décongeler à température ambiante. Une fois que le four a atteint la température, plaques de transfert au four et incuber pendant 10 min pour dénaturer échantillons.
2. Charge: 26 puits gels pré-coulés à 15 ul de chaque mélange réactionnel à l'aide d'une pipette multicanaux pour remplir plusieurs puits à la fois. Il faut veiller à ce que tous les conseils alignent correspondant bien avant d'ajouter échantillons. Exécutez gel à 150 V. Ne laissez pas le colorant de suivi (ligne bleue) fonctionne hors du fond du gel car il contient de l'ATP non constituée en société.
3. Démonter les gels et couper l'ATP non constituée en société (ligne bleue) à l'aide d'un scalpel ou le bord droit comme il se surexposer les films. Placez les gels dans des contenants étiquetés et couvrir avec Coomassie pendant 15 min.
4. Enlever la tache de Coomassie, brièvement rincer les gels avec de l'eau, et d'ajouter Destain solution. Destain les gels jusqu'à ce que les protéines sont clairement visibles. Une bande de MBP et une bande pour le substrat devraitêtre visible pour chaque échantillon.
5. Pour sécher les gels:
   1. Couper une grande feuille de papier-filtre et le placer sur la sécheuse.
   2. Mouiller une feuille de cellophane dans de l'eau distillée jusqu'à ce qu'elle soit lisse et sans plis, et le placer sur le dessus du papier.
   3. Disposez les gels sur le dessus de la feuille de cellophane, faire une note de l'ordre de gels. Mouiller une deuxième feuille de cellophane et placer sur le dessus des gels.
   4. Etaler toutes les bulles (un rouleau d'étanchéité de la plaque fonctionne bien pour cela) pour une surface uniforme agréable. Fermer le clapet, tourner sur le vide, et sécher les gels pendant 3 heures à 80 ° C.
6. Une fois que les gels sont secs, les exposer à un film XAR utilisant un écran d'intensifier le signal. Enveloppez la cassette avec une pellicule ou un sac en plastique et sceller avec du ruban adhésif pour empêcher les gelées. Rangez la cassette à -80 ° C pendant la nuit.

5. Développer XAR Films

1. Le lendemain, retirez la cassette du congélateur et laissez-les décongeler à la température ambiante. Développer le filmune chambre noire à l'aide d'un processeur de film selon les instructions du fabricant.
   Remarque: Examiner les films pour preuve de paires kinase-substrat. Une deuxième exposition plus longue peut également être utile pour détecter des événements de phosphorylation plus faibles.

Résultats

Des résultats représentatifs de l'écran sont représentés sur la figure 2. 180 kinases ont été criblés en utilisant un peptide de substrat GST-marqué correspondant à aa 268-283 de CRTC2 ainsi que la protéine basique classique dosage de kinase substrat de la myéline (MBP). Seuls deux kinases, MARK2 et de la MARK3 de kinase hautement liés phosphorylés le peptide CRTC2. MBP est incluse en tant que contrôle interne dans tous les dosages, car il contient beaucoup de résidu...

Discussion

Depuis les publications originales décrivant l'approche ^14,15, la bibliothèque originale de 180 TPS-kinases a été élargi à 420 membres, soit environ 80% de la kinome protéine humaine. Avec la bibliothèque élargi, le protocole comme décrit prend 4-5 jours, puis 1-4 jours pour développer des films (le juge nécessaire), qui pourrait être raccourcie par l'utilisation de phosphorimaging et l'amélioration de signal numérique. Il ya plusieurs étapes clés où les soins doivent être prise...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lysis buffer	Made in house		See Protocol step 1.1
10x kinase buffer	Made in house		See Protocol step 1.2
10x M-ATP	Made in house		See Protocol step 1.3
Human kinase plasmids	Orfeome, Invitrogen, Origene		GST-tagged in house
96 well plates	Fisher Scientific	CS003595
293T cells	ATCC	CRL-11268
DMEM	Fisher Scientific	SH3002201	supplement with 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 10% fetal calf serum.
CO2 incubator	Sanyo	MCO-17AIC
15 cm cell culture dishes	Fisher Scientific	877224
Reduced serum medium	Invitrogen	22600-050
Lipid-based transfection reagent	Invitrogen	11668-019
Automated liquid dispenser	Thermo Scientific	5840300
Small cassette attachment	Thermo Scientific	24073295
Standard cassette attachment	Thermo Scientific	14072670
4 mM pervanadate	Made in house		See Protocol step 3.1
0.25 M CaCl2	Made in house
Multichannel pipette (20-200 μl)	Labnet	p4812-200
Multichannel pipette (1-10 μl)	Thermo Scientific	4661040
V-bottom 6-well plates	Evergreen Scientific	290-8116-01V
Glutathione coated 96-well plates	Fisher Scientific	PI-15240
Hybridization oven	Biostad	350355
GST tagged substrate	Made in house
Myelin Basic Protein (MBP)	Sigma	M1891
Repeater pipette (1 ml)	Eppendorf	22266209
32P gamma-ATP	Perkin Elmer	BLU502Z500UC
2x SDS lysis buffer (100 ml)	Made in house		See Protocol step 1.4
26-well precast TGX gels	BioRad	567-1045	gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest
Coomassie stain	Made in house		0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol
Coomassie destain	Made in house		10% acetic acid, 20% methanol
Labeled gel containers	Made in house		Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel
Whatman filter paper	Fisher Scientific	57144
Cellophane sheets (2)	BioRad	165-0963
Gel dryer	Labconco	4330150
Double emulsion autoradiography film	VWR	IB1651454
Film cassette	Fisher Scientific	FBAC-1417
Intensifying screen	Fisher Scientific	FBIS-1417
Plate sealing rubber roller	Sigma	R1275