Kantitatif gerçek zamanlı PCR ile fare meme tümör modellerinde akciğer metastazı Değerlendirilmesi

Özet

Bu protokol fare akciğer dokusu içindeki metastazı temsil tümör hücre spesifik mRNA tespit etmek için kantitatif gerçek zamanlı PCR (QRT-PCR) nasıl kullanılacağı açıklanır.

Özet

Metastatik hastalık uzak organ primer kanser sitesinden habis tümör hücrelerinin yayılması ve kanserle ilişkili ölüm ¹ birincil nedenidir. Metastatik yayılım Ortak siteleri akciğer, lenf nodu, beyin ve kemik ² sayılabilir. Metastazı sürücü mekanizmalar kanser araştırmaları yoğun alanlardır. Metastaz uzak siteler kanser araştırmaları için enstrümantal şunlardır Sonuç olarak, tahliller metastatik yükünü ölçmek için. Meme tümörü modellerinde akciğer metastazlarının değerlendirilmesi, genel olarak, aşağıdaki akciğer dokusunun diseksiyon brüt niteliksel gözlem ile gerçekleştirilir. Metastazı değerlendirilmesinde nicel yöntemler şu anda ex vivo ve kullanıcı tanımlı parametre gerektiren vivo görüntüleme bazlı teknikler sınırlıdır. Bu tekniklerin çoğu oldukça hücresel düzeyde ^3-6 den bütün organizma düzeyinde bulunmaktadır. Çoklu foton mikroskopi kullanılarak yeni görüntüleme yöntemleri metalar değerlendirebilecektir rağmenhücresel düzeyde ^7'de tasis, bu son derece zarif prosedürleri yayılma mekanizmaları yerine metastatik yükünün kantitatif değerlendirmesini değerlendirmek için daha uygundur. Burada, kantitatif metastaz değerlendirmek için basit bir in vitro yöntem sunulmaktadır. Kantitatif gerçek zamanlı PCR kullanılarak (QRT-PCR), tümör hücresi spesifik mRNA fare akciğer dokusu içinde tespit edilebilir.

Giriş

QRT-PCR analizi, tümör metastazı değerlendirmek için bir yöntem olarak önerilmektedir. Bu yöntem metastazı değerlendirilmesinde ilgilenen ancak in vivo görüntüleme ekipmanı ya da bir floresan yetenekli Stereoskop gibi belirli ekipmana erişimi olmayan kullanıcılar için bir alternatif olarak önerilmiştir. Yaygın olarak kullanılan yöntemlerin bir tartışma QRT-PCR analizi, ayrı olarak ya da metastaz değerlendirmek için eşlik eden bir yöntem olarak da kullanılabilir nasıl bir gösteri ardından sunulmuştur. Bu prosedür metastatik yükünün kantitatif analiz sağlama potansiyeline sahiptir.

Bir stereomikroskop altında akciğerlerin görüntülenmesi yanı sıra hematoksilen ve eozin ardından seri kesit olmak üzere brüt analiz standart yöntemler, akciğer dokusunun (H & E) boyama, ölçülebilir ancak ^2-5 sayılması için kullanıcı tanımlı parametrelere dayanmaktadır. Stereomikroskopta kullanarak tüm akciğerleri değerlendirirken, sadece geniş yüzey metastazları visi vardırble ve analiz metastatik lezyon neyin belirlemek için akciğer anatomik yapının makul bilgiye sahip araştırmacı gerektirir. GFP ve ilgili uyarım / emisyon maksimumları (GFP örneğin yakınındaki 470/510 nm) ile bir ışık küp içeren bir stereomikroskop kullanımı gibi, bir işaretleyici ile tümör hücrelerinin floresan etiketleme bu işlemde yardımcı ancak yüzey tümör nodülleri saptanabilir . Buna ek olarak, GFP ile aynı parametreleri altında görünür kan kontaminasyonu, floresan, mümkün olan metastatik yanlış tanımlanmasına yol açabilir.

Akciğer metastazı görselleştirmek için H & E boyama ile takip akciğerin Kesit mikrometastazları ve bağışıklık hücre infiltrasyonu dahil olmak üzere diğer mikroskobik süreçleri değerlendirmek için yararlı bir yöntemdir ancak genellikle parafine, kesit ve boyama işlemleri için tüm akciğer dokusunun kullanılmasını gerektirir. Bu nedenle, mansap işlemleri bu metho aşağıdaki ideal değildird. Ölçülebilir, ancak bu işlem analizi akciğer tüm 3D yapısı oluşturan sağlamak için hayvan başına lekeli akciğer bölümlerinin büyük sayısını değerlendirmek için araştırmacı gerektirir. Sonuç olarak, bu tür muayeneler hatasını sayma yol açabilir, zaman tüketen ve analiz araştırmacı takdirine dayanır.

(MR, PET, SPECT gibi) şu anda gerçekleştirmek veya deneysel kemirgen modellerinde ⁸ biyolojik süreçleri test etmek için kullanılan in vivo görüntüleme teknikleri Çeşitli. In vivo bioluminescent görüntüleme metastazı ⁹ brüt görünüm elde etmek için kullanılan yaygın bir yöntemdir. Bu teknik genellikle nedeniyle tümör hücresi implantasyonundan sonra meme bezi ve spontan metastaz sırasında akciğer gibi belirli organların ikamet bir lusiferaz cevap veren bir eleman ihtiva edecek şekilde tümör hücreleri, birikimine lusiferaz raportör etkinliği varlığını değerlendirmek uygulanır ¹Lusiferaz raportör etkinliği 0. Görselleştirme lusiferin substratının (D-lusiferin) mevcudiyetinde tarafından indüklenir. Lusiferaz biyolüminesans üreten oksilusiferin D-luciferase oksidatif dekarboksilasyonunu katalize eder. Bilgilendirici olmakla birlikte, bu yöntem, alt-tabaka stabilite (örneğin, kısa yarı-ömür), deney hayvanlarına verilir bağlıdır alt-tabakanın yeterli bir dağılımı ve algılama ⁹ düşük hassasiyeti de dahil olmak üzere birçok faktör tarafından sınırlanır. Bu tekniğe Bir ana hak o, non-invaziv bir canlı hayvan üzerinde yapılabilir ve normalde diseksiyon ^9,10 hasat edilmemiş olabilir birden organlarda tümör hücre metastazı saptanması yol açabilir olmasıdır.

In vivo görüntüleme tekniklerinden biri olumlu yönü akciğer dokusu parafine gibi ikincil işlemler için izin dönülmelidir ya da burada sunulan, QRT-PCR analizi olmasıdır. Bununla birlikte, QRT-PCR Teorik olduğully tespiti daha hassas bir ölçümü, brüt değerlendirme akciğer tümör hücrelerinin mevcut düşük sayıda görülmemelidir. Yararlı ise, yukarıda tarif edilen görüntüleme teknikleri yer değiştirmiş olabilir veya şu anda tarif QRT-PCR yöntemi ile takviye edilmiştir. QRT-PCR akciğer içinde tümör kaynaklı mRNA duyarlı bir ölçüsünü sağlamak için potansiyele sahiptir.

Protokol

Protokol kurallarına ve South Carolina (MUSC) ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Tıp Üniversitesi (IACUC) hayvan bakım standartlarını izler.

1. Akciğer Diseksiyon

1. Meme tümör diseksiyonu (opsiyonel çalışma hedeflerine ve primer tümör analiz veya kuyruk ven enjeksiyon yapıldı mı bağlı).
   1. IACUC ve üniversite yönetmeliğine göre izofluran anestezisi bir öldürücü doz kullanarak fare Euthanize. Cerrahi dislokasyon euthanization onaylayın.
   2. Köpük tahta, bacaklarda yayılması ile sırtında fare koyarak diseksiyon iğneleri ile pim üzerinde.
   3. % 70 etanol ile fare püskürtün.
   4. Forseps kullanarak, merkezde hayvan alt kısmını kavramak.
   5. Makas kullanarak, fare periton boşluğuna delmek için dikkatli olmak, deri yoluyla boyun doğru yukarı kesti.
   6. Tümör dokusu ortaya çıkarmak için bacaklarda cildi kesin.
   7. Tümör dokusu ve pr parçalara ayırDaha fazla analiz için (değil bu protokolde ayrıca tartışılacaktır), bu tür donma veya fiksasyonu gibi, tercih edilen yöntem ile eserve.
2. Akciğer doku diseksiyonu.
   1. Yukarıda açıklandığı gibi tümör dokusu hasat ise, herhangi bir aşırı cilt aşağı pin.
   2. Forseps kullanarak, hayvanın alt ucunda periton kavramak ve boyun tabanına doğru yukarı kesme başlar.
   3. Dikkatle göğüs boşluğuna kanama olabilir herhangi bir kan damarlarını kesmekle önlemek için dikkatli olmak kaburga kafesinin sağ ve sol kenarlarında kesilmiş. Sol ve sağ kaburga kafesinin diyafram ve üst kısımları keserek kaburga kemikleri çıkarın.
   4. Forseps kullanarak fare trakea kavramak ve ileri çekin.
   5. Diseksiyon makas ile trakea Sever ve fare akciğerleri kaldırmak.
      Not: Kalp akciğer takılı kalabilir. Bu durum ortaya çıkarsa, dikkatli beş lobları toplamak için dikkatli olmak akciğerlere uzak kalbini incelemek (bakınız Şekil 1 ).
   6. Aşırı kan çıkarmak için PBS ile hafifçe yıkayın.
3. Akciğer dokusunda Brüt değerlendirilmesi.
   1. Seçenek 1: In vivo görüntüleme.
      1. Lusiferaz görüntüleme için, ~ 10 dakika önce görüntüleme, hayvanlara intraperitonal (ip) enjeksiyonu ile luciferase bir 150 mg / kg doz vermek. Anestezi altındaki hayvanlarda veya diseksiyon (Şekil 2) ⁵ sonra kaldırılması üzerine in vivo Görüntü akciğerler.
   2. Seçenek 2: Brüt değerlendirme.
      1. Tümör nodüller görselleştirmek için stereo mikroskop altında akciğerleri inceleyin. Not: hücreler, etiketli GFP ise, GFP tespit etmek için (470/510 nm civarındaki gibi) uygun bir uyarım / emisyon maksimum ile ışık küp ihtiva eden bir floresan yeteneğine stereomikroskop işleme öncesinde floresan stereoskopik akciğerlere incelemek için kullanılabilir.
   3. Akciğerler derhal analiz edilecek ise, 'RNA izolasyonu' bölümüne geçin. Aksi takdirde, Sıvı sabun kullanılarak dondurularak doku ekid azot veya kuru buz. -80 ° C saklayın.

2. RNA İzolasyon

Not: Örnek analizinde, RNA, bir RNA izolasyon kiti (Malzeme listesi) kullanılarak izole edilmiştir. Geçerli analiz belirli bir üreticinin ürettiği kullanırken, izolasyon kitleri çeşitli birçok saygın satıcılardan temin edilebilir. Ayrıca, sigara kit tabanlı santrifüj yöntemleri de bir seçenek vardır. cDNA, standart eğrisi analizi için bir hücre hattı veya plazmid olarak, bir pozitif kontrol RNA numunesinden hazırlanmalıdır. Alternatif olarak, primer prob seti için belirli bir pozitif kontrol satın alınabilir (Malzeme Listesi'ne bakın).

1. Önceden dondurulmuş doku kullanıyorsanız, kuru buz dondurulmuş doku toplamak.
2. Örneğin aşağıdaki yöntemlerden biri kullanılarak doku homojenize: havan ve tokmak doku sıvı nitrojen içerisinde dondurulduktan sonra, kuru buz üzerine el ile yapılan öğütme; Doku homojenizatörü veya mekanik ayrışma cihazıÜreticinin öneri başına; sonikasyon veya diğer tercih edilen yöntem.
   Not: temsilci analizi için homojenizasyon tercih edilen yöntemdir sonikasyonudur.
   1. Şekil 3 sunulan analizi için, bir oranda parçalama (RNA izolasyon kiti sağlanan) tampon ve 2-merkaptoetanol hazırlanması 20 ul 2-merkaptoetanol lisis tamponu, her 1 ml. Süspanse dokusu 300 ul liziz tamponu içinde% 30 genlik ayarlanmış sonikatör 10 sn için doku ve sonikasyon, her 30 g 2-merkaptoetanol ile takviye edilmiştir.
   2. Öğütme sonrası 300 ul liziz tamponu içinde tekrar süspansiyon temel doku, harç ve havan tokmağı kullanılarak edin.
3. 590 ul TE tampon maddesi (1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0) 10 ul proteinaz K ilave. Doku (yani her 30 mg) her 300 ul 600 ul proteinaz K çözüm ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
   Not: Sindirim süresi değişebilir.
4. ≥1 örnekleri Santrifüj10 dakika boyunca 3000 gr enkaz kaldırmak için.
5. Yeni tüplere süpernatant aktarın.
6. RNA çöktürmek için süpernatan, her 900 ul için 450 ul etanol (% 96 -100%) ekleyin.
7. Kolona lizat / etanol karışımı 700 ul aktarın.
8. 1 dakika boyunca ≥13,000 g'de santrifüjleyin örnekleri kolona RNA bağlama.
9. Sıvı atık atın ve sütun kalan süpernatant ekleyin ve tekrar döndürün.
10. Tüm lisatı kolonu boyunca bükülmüş bir kez, 30 saniye süre ile ≥13,000 g kolonu ve santrifüj örnekleri üst kısmına Yıkama Tamponu 1 350 ul ilave edin.
11. Sütundan sıvıyı atın ve üst kısmı değiştirin.
12. Ben 10x DNaz 5 ul ve numune başına DNaz / RNaz ücretsiz su 40 ul (50 ul / numune toplam hacim) ile enzim DNaz 5 birim karıştırılarak DNaz hazırlayın.
13. DNase 50 ul, her sütun için karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe ekleyin.
14. Kolon ve santrifüj sam ile Yıkama Tamponu 1 350 ul ekleyinples 30 sn için ≥13,000 g.
15. Sütundan sıvıyı atın ve üst kısmı değiştirin.
16. Kolonuna Yıkama Tamponu 2 600 ul ilave edin ve ≥13,000 g'de 30 saniye dönerler.
17. Sütundan sıvıyı atın ve üst kısmı değiştirin.
18. ≥13,000 g'de 2 dakika süre ile 250 Yıkama Tamponu 2 ul ve santrifüj ekleyin.
19. Yeni koleksiyon tüpüne sütunun kısmını koyun ve eski toplama tüpü atın.
20. Sütuna RNaz / DNaz serbest su 50-100 ul ilave edin ve 1 dakika boyunca inkübe edin.
21. ≥13,000 g 1 dakika boyunca dönerler.
22. Yeniden çalıştırın RNA verimi artırmak için kolon boyunca toplanan eluatın.
23. Acil kullanım için, buz üzerinde örnekleri tutmak ve kantitatif geçin. Daha sonra kullanmak için, kuru buz veya sıvı azot üzerinde dondurma ek. -80 ° C derin dondurucuda saklayın de ihtiyaç kadar.

3. içine First Strand Synthesis

Not: temsilci analizi için, ters transkriptaz (RT) reaksiyonu, bir F gerçekleştirildi(Malzeme Listesi'ne bakınız) QRT-PCR için tasarlanmış irst Strand cDNA sentez kiti.

1. Numuneler daha önceden toplanmış olsaydı, buz üzerinde tüpler çözülme.
2. Bir spektrofotometre kullanılarak RNA miktarını ölçün.
3. Toplam RNA'nın 0,5-2 ug kullanılarak cDNA stokunun oluşturulması için ters transkriptaz kullanılarak birinci sarmal sentezi gerçekleştirmek.
   1. Steril, RNaz / DNaz içermeyen PCR tüpleri / levha, reaksiyon karışımı (Tablo 1) hazırlanması. Yavaşça ve santrifüj karıştırın. Standart bir PCR makinesi (Tablo 2) programlayın.
4. Steril nükleaz içermeyen su kullanılarak istenen hacme (genellikle 50-100 ul) bitmiş reaksiyonu sulandırmak.

4. Real-time PCR

Not: temsilci analizi için, SYBR yeşil kullanılmıştır. Ancak, herhangi bir tercih edilen yöntem, kullanıcının takdirine bağlı olarak ikame edilebilir.

1. Bir pozitif kontrol cDNA kullanılarak, her bir primer grubu için bir standart eğri ayarlayın.
   1. Analiz i gösterilen İçinn Şekil 3, pozitif kontrol cDNA tavsiye üreticisi kullanarak insan HER2 için standart eğri hazırlamak (Malzeme Listesi'ne bakın). Fare GAPDH için, bir standart eğri oluşturmak için negatif kontrol akciğer cDNA'nın kullanılmasıdır. 5 standartları üretmek için 4: her bir prob için, seri cDNA 1 seyreltin.
2. Standart eğri ve deneysel örnekleri içermelidir toplam örnek sayısını, hesaplayın.
   Not: Analiz burada açıklanan için numune başına 2-3 deneysel çoğaltır analiz edildi. Standart eğri analizi son normalleştirilmiş miktarını hesaplamak için, numune başına göre HER2 miktarı ve GAPDH belirlemek için uygulanabilecek bir basit doğrusal regresyon modeli oluşturmak için gerçekleştirilmiştir. Bu analiz aynı zamanda astar verimliliği eldeki analiz için yeterli olmasını sağlayacaktır.
3. Steril, RNaz / DNaz ücretsiz tüp içinde, ana karışımı (Tablo 3) hazırlar.
   1. Ana karışımı Amoun hesaplayınNumune başına t. Birden fazla örnek için büyütmek. Çevrede oluşturduğu her bir deney geni, hem de GAPDH gibi bir iç kontrol için bir ana karışımı kullanın. 200 nM'lik bir nihai konsantrasyonda GAPDH için primerler kullanarak.
      Not: İnsan ve fare hücre kökenli ayırt çalışırken iç kontrol özellikle yararlıdır.
      Not: HER2 için primer konsantrasyonu optimize edilmiş ve üretici tarafından belirlenmiştir.
4. Her standart veya numune deney tekabül eden 1 ul cDNA'lan ihtiva eden test plakası hazırlanır. Her bir primer prob için en az 1 cDNA örnek / ayırın. Her primer prob için kuyu başına ana karışımı 19 ul ekleyin.
   Not: Şekil 3 temsili veriler için, alınan cDNA, her bir primer prob için iki kopya halinde analiz edilmiştir ve iki numune ortalaması olarak grafik haline.
5. QRT-PCR makinesinde çalıştırın reaksiyon tavsiye veya önceden PCR protokolü test kullanarak. Tablo 4 görün Şekil 3 ve Şekil 4'te temsili veriler için kullanılan PCR protokolü için trong>.

Sonuçlar

Zaman ötesinde deneysel hayvana ve gerekirse, tümör hücrelerinin ilk aşılama gerçekleştirmek için gereken performans, in vivo tümör analizi, doku hasat, RNA izolasyonu ve QRT-PCR analizi birincil bir 1-2 günlük bir işlemdir (Şekil 1) .

Brüt analizinin bir örneği, akciğer dokusu içindeki tümör hücrelerini değerlendirmek için bir biyoışıldama görüntülemedir. Burad...

Tartışmalar

Bu protokol, ksenograft fare modeli kullanarak, akciğer, meme tümör hücresi metastazının değerlendirmek için QRT-PCR kullanımını tarif etmektedir. Bu bioluminescent görüntüleme dahil olmak üzere diğer teknikler mevcuttur ve ayrıca kendi değerlerini ve sınırlamalar olmasına rağmen metastaz saptanması için etkili olduğu kabul edilmektedir. Sunulan veriler QRT-PCR Toplam metastaz ölçülmesi için, akciğer dokusu içindeki tümör kaynaklı mRNA tespit etkili bir ölçüsü temin ettiğine işare...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Fisher	BP176-100
DNAse	Thermo Scientific	EN0521
GeneJet RNA Isolation Kit	Thermo Scientific	K0732
iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR	Bio-Rad	1708841
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121
PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human	Bio-Rad	100-25636
PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human	Bio-Rad	100-25716
gapdh Primer Sequence			For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG