Avaliação de metástases pulmonares em Rato mamárias tumorais Models por Quantitative PCR em tempo real

Resumo

Este protocolo descreve como usar quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR) para detectar ARNm específicos de células tumorais representam metástases no tecido do pulmão do rato.

Resumo

A doença metastática é a propagação de células tumorais malignas do local do tumor primário para um órgão distante e é a principal causa de morte do cancro associado ^1. Os lugares mais comuns de propagação metastática incluem pulmão, linfonodo, cérebro e ossos ^2. Mecanismos que conduzem metástase são áreas de intensa pesquisa sobre o câncer. Consequentemente, os ensaios eficazes para medir a carga metastático em locais distantes de metástases são fundamentais para a investigação do cancro. Avaliação de metástases do pulmão em modelos de tumor mamário é geralmente realizada por observação qualitativa bruta de tecido de pulmão a seguir a dissecção. Métodos quantitativos de avaliação de metástase está actualmente limitado a ex vivo e em técnicas de imagem com base vivo que exigem parâmetros definidos pelo usuário. Muitas dessas técnicas são em todo o organismo, em vez de nível do nível celular ^3-6. Embora os métodos de imagem mais recentes utilizando microscopia multi-fotão somos capazes de avaliar MetasTasis a nível celular ^7, estes procedimentos altamente elegantes são mais adequados para avaliar os mecanismos de difusão em vez de uma avaliação quantitativa da carga metastática. Aqui, um método in vitro simples para avaliar quantitativamente a metástase é apresentado. Usando quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR), o ARNm específico de células de tumor pode ser detectado no tecido do pulmão do rato.

Introdução

Análise de qRT-PCR, como é proposto um método para avaliar a metástase tumoral. Este método é proposto como uma alternativa para os usuários que estão interessados ​​em avaliar a metástase, mas não podem ter acesso ao equipamento específico, como in vivo equipamentos de imagem ou uma fluorescência estereoscópio capaz. Uma discussão de métodos vulgarmente utilizados é apresentada seguido por uma demonstração de como a análise de QRT-PCR pode ser usado tanto como um separado ou como um método para avaliar companheiro metástase. Este procedimento tem o potencial de fornecer uma análise quantitativa de carga metastático.

Métodos padrão de análise bruta, incluindo a visualização dos pulmões sob microscópio estereoscópico, bem como cortes seriados seguido por hematoxilina e eosina (H & E) coloração do tecido pulmonar, são quantificáveis, mas dependem fortemente de parâmetros definidos pelo usuário para a contagem ^2-5. Ao avaliar os pulmões inteiros usando um microscópio estereoscópico, metástases superfície apenas as grandes são visible e análise requer o investigador ter conhecimento razoável da estrutura anatômica pulmonar para determinar o que constitui uma lesão metastática. Marcação fluorescente de células de tumor com um marcador, tais como GFP e o uso de um microscópio estereoscópico que contém um cubo de luz com os máximos de excitação / emissão adequados (por exemplo perto de 470/510 nm para GFP) auxilia neste processo, mas apenas nódulos tumorais de superfície são detectáveis . Além disso, a fluorescência a partir de contaminação do sangue, o que é visível sob os mesmos parâmetros como GFP, pode levar a falsa identificação de possíveis lesões metastáticas.

Seccionamento do pulmão seguido por H & E coloração de visualizar metástase pulmonar é um método útil para avaliar micrometástases e outros processos microscópicos incluindo a infiltração de células imunes, mas muitas vezes requer o uso de todo o tecido pulmonar para inclusão em parafina, seccionamento, e procedimentos de coloração. Portanto, os procedimentos a jusante não são ideais seguindo este metod. Embora quantificável, este procedimento requer que o investigador para avaliar um grande número de secções de pulmão coradas por animal para assegurar que a análise é responsável por toda a estrutura 3D do pulmão. Consequentemente, este tipo de exame é demorado, pode levar a contagem de erro, e análise depende fortemente de investigador discrição.

Vários em técnicas de imagem in vivo (por exemplo, ressonância magnética, PET, SPECT) são usados ​​atualmente para executar ou testar os processos biológicos em modelos de roedores experimentais ^8. In vivo a imagem de bioluminescência é um método comum usado para adquirir uma visão bruta de metástase ^9. Esta técnica é geralmente aplicado para avaliar a presença de actividade repórter da luciferase, devido à acumulação de células tumorais, que são modificados para conter um elemento de resposta de luciferase, que residem em órgãos específicos, como na glândula mamaria depois da implantação de células de tumor e o pulmão após a metástase espontânea ¹0. A visualização da actividade de luciferase repórter é induzida pela presença de substrato luciferina (D-luciferina). A luciferase catalisa a descarboxilação oxidativa de D-luciferina para oxiluciferina gerando bioluminescência. Enquanto informativo, este método é limitado por vários factores, incluindo a estabilidade do substrato (isto é, curta meia-vida), a distribuição adequada do substrato, o qual depende da forma como é entregue a animais experimentais, e baixa sensibilidade de detecção ^9. Um mérito principal desta técnica é que é não-invasiva, pode ser realizada em animais vivos, e pode conduzir à detecção de metástases de células de tumor em vários órgãos que podem não ter sido normalmente colhido em dissecção ^9,10.

Um aspecto positivo de técnicas de imagiologia in vivo é que o tecido de pulmão não é perturbada permitindo procedimentos secundários como parafina ou como aqui apresentado, a análise de qRT-PCR. No entanto, porque qRT-PCR é theoretically uma medida mais sensível de detecção, a avaliação bruta pode não revelar baixos números de células tumorais presentes no pulmão. Embora útil, as técnicas de imagiologia descritos acima podem ser substituídos ou suplementados com o método de qRT-PCR actualmente descrito. QRT-PCR tem o potencial de proporcionar uma medida sensível de ARNm derivado de tumores dentro de um pulmão.

Protocolo

O protocolo segue as diretrizes e padrões de cuidados de animais da Medical University of South Carolina (MUSC) e seu Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC).

1. Lung Dissection

1. Dissecção do tumor mamário (opcional, dependendo objetivos do estudo e se a análise do tumor primário ou veia da cauda injeção foi realizada).
   1. Euthanize rato usando uma dose letal de anestesia isoflurano acordo com IACUC e regulação universidade. Confirme a eutanásia por deslocamento cirúrgico.
   2. Na placa de espuma, o pino com pinos de dissecação, colocando o mouse sobre as suas costas com membros spread.
   3. Spray de rato com etanol 70%.
   4. Usando fórceps, agarrar a parte inferior do animal no centro.
   5. Usando tesoura, corte para cima do pescoço através da pele, tendo o cuidado de não perfurar a cavidade peritoneal do rato.
   6. Cortar pele nos membros para revelar o tecido do tumor.
   7. Dissecar tecido tumoral e preserva por método preferido, como o congelamento ou fixação, para análise posterior (não discutido neste protocolo).
2. Dissecção do tecido pulmonar.
   1. Se o tecido tumoral foi colhido como descrito acima, o pino para baixo qualquer excesso de pele.
   2. Usando fórceps, compreender peritoneu na extremidade inferior do animal e iniciar o corte para cima para a base do pescoço.
   3. Corte cuidadosamente ao longo dos lados esquerdo e direito da caixa torácica tomando cuidado para evitar cortar quaisquer vasos sanguíneos que podem sangrar para dentro da cavidade torácica. Retirar as costelas por corte para a esquerda e para a direita através do diafragma e porções superiores da caixa torácica.
   4. Utilizando uma pinça agarrar a traqueia do rato e puxar para a frente.
   5. Atingir a traquéia com tesouras de dissecação e remover pulmões de rato.
      Nota: O coração pode permanecer ligado ao pulmão. Se isso ocorrer, dissecar cuidadosamente coração longe de pulmões tendo o cuidado de recolher todos os cinco lóbulos (ver Figura 1 ).
   6. Lavar cuidadosamente com PBS para remover o excesso de sangue.
3. Gross avaliação do tecido pulmonar.
   1. Opção 1: in vivo de imagens.
      1. Para imagiologia de luciferase, ~ 10 minutos antes da imagem, os animais dar um 150 mg / kg de dose de luciferina por injecção intraperitoneal (ip). Pulmões de imagem in vivo em animais anestesiados, ou após a sua remoção após a dissecação (Figura 2) ^5.
   2. Opção 2: avaliação Gross.
      1. Examinar pulmões sob microscópio estéreo para visualizar nódulos tumorais. Nota: Se as células são GFP marcado, um estereomicroscópio capaz de fluorescência contendo um cubo de luz com os máximos de excitação / emissão adequados (por exemplo, perto de 470/510 nm) para detectar a GFP pode ser utilizado para examinar pulmões estereoscopicamente por fluorescência antes do processamento.
   3. Se os pulmões estão a ser analisadas imediatamente, vá para a seção 'RNA Isolation'. Caso contrário, encaixe tecido congelamento usando liquID de azoto ou gelo seco. Armazenar a -80 ° C.

2. Isolamento de ARN

Nota: Para a análise representativa, RNA foi isolado utilizando um kit de isolamento de RNA (ver Lista de Materiais). Embora a análise atual usa o produto de um fabricante específico, uma variedade de kits de isolamento estão disponíveis a partir de vários fornecedores de confiança. Além disso, métodos de centrifugação não baseados kit também são uma opção. ADNc deve também ser preparado a partir de uma amostra de ARN de controlo positivo, tal como uma linha celular ou de plasmídeo, por análise da curva padrão. Alternativamente, um controlo positivo específico para o conjunto de sonda cartilha podem ser adquiridos (ver Lista de Materiais).

1. Se estiver usando tecido previamente congelada, reunir tecido congelado em gelo seco.
2. Homogeneizar o tecido usando um dos seguintes métodos, tais como: almofariz e pilão moagem realizada por mão sobre gelo seco após tecido em nitrogênio líquido congelamento; homogeneizador de tecido ou dispositivo de dissociação mecânicapor sugestão do fabricante; sonicação, ou outro método preferido.
   Nota: Para a análise representativa, o método preferido de homogeneização é de sonicação.
   1. Para a análise apresentada na Figura 3, preparar tampão de lise (fornecido no kit de isolamento de ARN) e 2-mercaptoetanol a uma razão de 20 ul de 2-mercaptoetanol a cada 1 ml de tampão de lise. Tecido Ressuspender em 300 ul de tampão de lise, suplementado com 2-mercaptoetanol para cada 30 g de tecido e sonicado durante 10 seg com sonicador fixado em 30% de amplitude.
   2. Se estiver usando almofariz e pilão, tecido chão ressuspender em tampão de lise de 300 mL após a moagem.
3. Adicionar 10 ul de proteinase K para 590 ul de tampão TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; EDTA 1 mM). Adicionar 600 ul de solução de proteinase K a cada 300 ul (ou seja, para cada 30 mg) de tecido. Incubar durante 10 min à TA.
   Nota: O tempo de digestão pode variar.
4. Centrifugar as amostras a ≥13.000 g durante 10 min para remover os detritos.
5. Transferir o sobrenadante para tubos novos.
6. Adicionar 450 uL de etanol (96% -100%) para cada 900 ul de sobrenadante para precipitar o ARN.
7. Transferir 700 ul da mistura de ligado / etanol para a coluna.
8. Centrifugar as amostras a ≥13,000 g durante 1 minuto para ligar RNA para a coluna.
9. Descarte os resíduos líquidos e adicionar sobrenadante restante para a coluna e girar novamente.
10. Uma vez que todo o lisado é fiado através da coluna, adicionar 350 ul de tampão de lavagem 1 para a parte superior das amostras de coluna e centrifugar a ≥13,000 g durante 30 seg.
11. Descartar o líquido a partir da coluna e substituir parte superior.
12. Prepare ADNase por mistura de 5 unidades de ADNase I enzima com 5 ul de ADNase 10x e 40 ul de ADNase / ARNase isenta de água por amostra (volume total de 50 ul / amostra).
13. Adicionar 50 ul de DNase misturar a cada coluna e incuba-se durante 15 min à TA.
14. Adicionar 350 mL de tampão de lavagem 1 a coluna e centrifugar sampios em ≥13,000 g por 30 s.
15. Descartar o líquido a partir da coluna e substituir parte superior.
16. Adicionar 600 ul de tampão de lavagem 2 para a coluna e girar 30 seg a ≥13,000 g.
17. Descartar o líquido a partir da coluna e substituir parte superior.
18. Adicionar 250 ul de Tampão de Lavagem 2 e centrifuga-se durante 2 min a ≥13,000 g.
19. Coloque parte da coluna em um novo tubo de coleta e descarte tubo de recolha de idade.
20. Adicionar 50-100 ul de ARNase / ADNase isenta de água para a coluna e incuba-se durante 1 min.
21. Girar durante 1 min a ≥13,000 g.
22. Volte a executar eluato coletados por meio de coluna para aumentar o rendimento RNA.
23. Para uso imediato, manter as amostras em gelo e proceder à quantificação. Para uso posterior, pressão congelamento de gelo seco ou nitrogênio líquido. Armazenar a -80 ° C congelador até ser necessário.

3. First Strand Synthesis

Nota: Para a análise representativa, a reacção de transcriptase inversa (RT) realizou-se um Fkit de síntese de irst Strand cDNA projetado para QRT-PCR (ver Lista de Materiais).

1. Se as amostras foram coletadas anteriormente, descongelar tubos em gelo.
2. Medir a quantidade de ARN utilizando um espectrofotómetro.
3. Usando 0,5-2 ug de ARN total, realizar a síntese da primeira cadeia utilizando transcriptase reversa para gerar ADNc de estoque.
   1. Em estéreis, tubos de RNase / PCR isento de ADNase / placas, preparar a mistura de reacção (Tabela 1). Misture delicadamente e centrifugar. Programar uma máquina de PCR padrão (Tabela 2).
4. Diluir reação acabado de volume desejado (geralmente 50-100 ul) usando água livre de nuclease estéril.

4. PCR em tempo real

Nota: Para a análise representativa, verde SYBR foi usado. No entanto, qualquer método preferido pode ser substituído, a critério do usuário.

1. Usando um cDNA de controlo positivo, configurar uma curva padrão para cada conjunto de primers.
   1. Para a análise mostrada in Figura 3, preparar a curva padrão para HER2 humano usando o fabricante recomenda cDNA controle positivo (ver Lista de Materiais). Para GAPDH do rato, utilizar o ADNc de pulmão de controlo negativo para gerar uma curva padrão. Para cada teste, diluir em série do cDNA 1: 4 para gerar 5 padrões.
2. Calcular o número de amostras no total, o que deveria incluir a curva padrão e amostras experimentais.
   Nota: Para a análise aqui descrita, foram analisados ​​2-3 experiências em replicado por amostra. A análise da curva padrão foi feita para gerar um modelo de regressão linear simples que pode ser aplicado para determinar a quantidade relativa de HER2 e GAPDH por amostra para calcular a quantidade normalizada final. Esta análise irá também assegurar que a eficiência de iniciadores é o adequado para a análise à mão.
3. Em um, RNase tubo estéril / isenta de ADNase, preparar mix master (Tabela 3).
   1. Calcule mestre mix amount por amostra. Escala-se de mais de uma amostra. Usar uma mistura principal para cada gene experimental de interesse, bem como um controlo interno, tal como GAPDH. Use iniciadores para GAPDH, a uma concentração final de 200 nM.
      Nota: O controle interno é particularmente útil quando se tenta distinguir entre a origem de células humanas e mouse.
      Nota: concentração Primer para HER2 foi otimizado e determinado pelo fabricante.
4. Prepare a placa de teste contendo 1 ul ADNc correspondentes a cada amostra padrão ou experimental. Aloque pelo menos uma amostra de cDNA / bem para cada sonda primer. Adicionar 19 ul de mistura principal por poço para cada sonda primer.
   Nota: Para os dados representativos na Figura 3, as amostras de cDNA foram analisadas em duplicado para cada sonda de iniciador e representada graficamente como a média das duas amostras.
5. Reação executado em máquina QRT-PCR utilizando recomendada ou previamente testado protocolo de PCR. Ver Tabela 4 para o protocolo de PCR utilizado para os dados representativos na Figura 3 e na Figura 4.

Resultados

Além do tempo que demora a efectuar a inoculação inicial de células de tumor no animal experimental e de se realizar, na análise primária do tumor in vivo, a colheita de tecido, o isolamento do ARN e a análise qRT-PCR é um procedimento de 1-2 dias (Figura 1) .

Um exemplo de análise bruta é imagiologia bioluminescente para avaliar células tumorais dentro do tecido pulmonar. Aqui, um...

Discussão

Este protocolo descreve o uso de qRT-PCR para avaliar a metástase de células de tumor mamário de pulmão utilizando um modelo de xenoenxerto de ratinho. Reconhece-se que outras técnicas, incluindo a imagem de bioluminescência, estão disponíveis e também são eficazes para detectar metástase apesar de ter os seus próprios valores e limitações. Os dados apresentados sugerem que qRT-PCR proporciona uma medida eficaz de detecção de ARNm derivado de tumor dentro de tecido pulmonar para a quantificação de met?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Fisher	BP176-100
DNAse	Thermo Scientific	EN0521
GeneJet RNA Isolation Kit	Thermo Scientific	K0732
iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR	Bio-Rad	1708841
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121
PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human	Bio-Rad	100-25636
PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human	Bio-Rad	100-25716
gapdh Primer Sequence			For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG