정량 실시간 PCR에 의해 마우스 유방 종양 모델에서 폐 전이의 평가

요약

이 프로토콜은 마우스 폐 조직 내에서 전이를 나타내는 특정 종양 세포의 mRNA를 검출하도록 정량적 실시간 PCR (QRT-PCR)을 사용하는 방법을 설명한다.

초록

전이성 질환 먼 기관에 차 암 사이트에서 악성 종양 세포의 확산된다 암 관련 사망의 ¹ 차 원인이다. 전이성 확산의 일반적인 사이트는 폐, 림프절, 뇌, 뼈 ^(2)를 포함한다. 전이를 구동 메커니즘은 암 연구의 강렬한 영역입니다. 전이 먼 사이트는 암 연구를위한 수단이다에 따라서, 효과적인 분석은 전이성 부담을 측정합니다. 유방 종양 모델에서 폐 전이의 평가는 일반적으로 다음 해부 폐 조직의 육안 관찰에 의해 정성 행한다. 전이를 평가하는 정량적 방법은 현재 생체 외 및 사용자 정의 된 매개 변수를 필요로 생체 내 이미징 기반 기술에 제한됩니다. 이들 기술의 대부분은 오히려 세포 수준 ^3-6보다 전체 유기체 수준이다. 다 광자 현미경을 이용하여 새로운 이미징 방법 METAS을 평가할 수 있지만세포 수준에서 ⁷ TASIS이 매우 우아한 절차는 보급의 메커니즘보다는 전이성 부담의 정량적 평가를 평가에 더 적합하다. 여기에 정량적으로 전이를 평가하는 간단한 체외 방법이 제공된다. 정량 실시간 PCR을 사용하는 것은 (QRT-PCR), 특정 종양 세포의 mRNA는, 마우스 폐 조직 내에서 검출 될 수있다.

서문

QRT-PCR 분석은 종양 전이를 평가하는 방법으로서 제안되어있다. 이 방법은 전이를 평가 관련되지만, 생체 내 이미징 장치 또는 형광 할 입체경 특정 장비에 액세스 할 수없는 사용자를위한 대안으로 제시된다. 일반적으로 사용되는 방법의 논의는 QRT-PCR 분석은 별개로 또는 전이를 평가하는 방법에 동반하여 사용할 수있는 방법에 대한 데모 뒤에 제공된다. 이 절차는 전이성 부담의 정량 분석​​을 제공하는 잠재력을 가지고있다.

실체 현미경하에 폐의 시각화뿐만 아니라 헤 마톡 실린 및 에오신 다음 직렬 절편을 포함하여 총 분석의 표준 방법은 폐 조직의 (H & E) 염색, 정량화하지만 ^2-5 계산을위한 사용자 정의 된 매개 변수에 크게 의존하고있다. 실체 현미경을 사용하여 전체 폐를 평가할 때, 단지 큰 표면 전이는 VISI은BLE 및 분석은 전이성 병변을 구성하는 것을 결정하기 위해 폐 해부학 적 구조의 합리적인 지식을 가지고 조사를 필요로한다. 이러한 GFP 적절한 여기 / 방출 최대 (GFP 예 : 근처 510분의 470 ㎚)와 빛 큐브를 포함하는 입체 현미경의 사용과 같은 마커로 종양 세포의 형광 라벨은이 과정에서 지원,하지만 표면의 종양 결절은 탐지 가능 . 또한, GFP와 같은 매개 변수 아래에 표시되는 혈액의 오염에서 형광이 가능 전이성 병변의 거짓 식별 될 수 있습니다.

폐 전이를 시각화하기 위해 H & E 염색 한 다음 폐의 단면은 미세 전이와 면역 세포의 침윤을 포함한 다른 마이크로 프로세스를 평가하는 유용한 방법이지만 종종 파라핀 삽입, 절편 및 염색 절차는 전체 폐 조직의 사용을 필요로한다. 따라서, 다운 스트림 절차는이 운전 방식 다음과 같은 이상 없습니다디. 정량화하지만,이 과정은 분석이 폐의 전체 3 차원 구조를 차지하도록 동물 당 염색 폐 구간의 다수를 평가하는 조사원을 필요로한다. 결과적으로, 시험이 유형의 에러를 카운트로 이어질 수 있고, 시간 소모적이며, 분석은 연구자의 판단에 크게 의존한다.

(MRI는 PET, SPECT는 예) 현재 수행하거나 실험 쥐 모델 ⁸ 생물학적 과정을 테스트하는 데 사용되는 생체 내 이미징 기술의 몇 가지. 생체 내 생물 발광 영상은 전이 ^(9)의 총보기를 취득하는 데 사용되는 일반적인 방법입니다. 이 기술은 일반적으로 인해 종양 세포 주입 후 유선 및 자발적 전이시 폐 같은 특정의 장기에 상주하는 루시퍼 라제 반응 요소를 포함하도록 설계되는 종양 세포의 축적에 루시페라아제 리포터 활성의 존재를 평가하기 위해인가 ¹루시페라아제 리포터 활성의 0. 시각화는 루시페린 기판 (D-루시페린)의 존재에 의해 유도된다. 루시 페라 제는 생물 발광을 생성 oxyluciferin하는 D-루시페린의 산화 적 탈을 촉매. 정보 있지만,이 방법은 기판의 안정성 (즉, 짧은 반감기)이 실험 동물에 전달되는 방법에 따라 달라집니다 기판의 적절한 분배, 및 탐지 ^(9)의 낮은 감도 등 여러 가지 요인에 의해 제한됩니다. 이 기술에 주요 장점은, 비 침습적 인 살아있는 동물에서 수행 될 수 있고, 일반적으로 절개 ^9,10- 수확되지 않았을 수있는 다수의 기관에서 종양 세포의 전이의 검출을 초래할 수 있다는 것이다.

생체 영상 기술의 일 측면은 양성 폐 조직 파라핀 등에 매립 이차 절차 허용 흐트러 그대로 또는 여기 제시 QRT-PCR 분석한다는 것이다. 그러나, QRT-PCR은 theoretica이기 때문이다에서야 검출 더 민감한 법안은 총 평가는 폐에 존재하는 종양 세포의 낮은 숫자를 공개하지 않을 수 있습니다. 유용한 반면, 상기 이미징 기술은 치환 될 수 있거나, 현재 설명 QRT-PCR 방법으로 보충. QRT-PCR은 폐에서 종양 유래의 mRNA의 민감한 측정을 제공하는 잠재력을 가지고있다.

프로토콜

이 프로토콜은 가이드 라인과 사우스 캐롤라이나 (MUSC)과 기관 동물 관리 및 사용위원회의 의과 대학 (IACUC)의 동물 보호 기준을 따른다.

1. 폐 해부

1. 유방 종양 절제술 (선택 연구 목표 및 기본 종양 분석 또는 꼬리 정맥 주입이 수행 여부에 따라).
   1. IACUC 대학 규정에 따라 이소 플루 란 마취의 치사량을 사용하여 마우스를 안락사. 수술 전위에 의해 euthanization을 확인합니다.
   2. 폼 보드, 사지 확산의 뒷면에 마우스를 배치하여 해부 핀과 핀.
   3. 70 % 에탄올로 마우스 스프레이.
   4. 집게를 사용하여, 중심에서 동물의 하부를 파악.
   5. 가위를 사용하여, 마우스의 복강을 관통하지 않도록주의, 피부를 통해 목으로 상승 했네요.
   6. 종양 조직을 나타 내기 위해 사지에 피부를 다시 잘라.
   7. 종양 조직과 홍보를 해부하다추가 분석을 위해 (안이 프로토콜에 자세히 설명) 등의 동결 또는 고정으로, 선호하는 방법으로 eserve.
2. 폐 조직의 해부.
   1. 전술 한 바와 같이, 종양 조직을 수확하는 경우, 과잉의 피부 아래에 핀.
   2. 집게를 사용하여, 동물의 하단부를 잡고 복막 목의 기부를 향해 위쪽으로 절단 시작한다.
   3. 조심스럽게 흉강에 출혈 수있는 혈관을 절단되지 않도록주의하면서 흉곽의 왼쪽과 오른쪽 측면을 따라 잘라. 왼쪽과 오른쪽 흉곽의 횡격막과 상부를 절단하여 리브 뼈를 제거합니다.
   4. 집게를 사용하여 마우스의기도를 잡고 앞으로 잡아 당깁니다.
   5. 해부 가위로 기관을 절단 및 마우스에서 폐를 제거합니다.
      참고 : 핵심은 폐에 부착 남아있을 수 있습니다. 이 경우, 신중하게 다섯 로브를 수집주의하면서 폐에서 멀리 마음을 해부하다 (그림 1 참조 ).
   6. 여분의 혈액을 제거하는 PBS로 부드럽게 씻는다.
3. 폐 조직의 총 평가.
   1. 옵션 1 : 생체 내 이미징.
      1. 루시 페라 이미징 ~ 10 분 전에 이미지로, 동물에게 복강 내 (IP) 주사 루시페린의 150 ㎎ / ㎏ 용량을 제공합니다. 마취 된 동물 또는 절개 (그림 2) ⁵ 후 제거시 생체 내에서 이미지 폐.
   2. 옵션 2 : 총 평가.
      1. 종양 결절을 시각화 스테레오 현미경으로 폐를 검사합니다. 주 : 세포 표지 GFP 경우 GFP를 검출 (510분의 470 nm의 근처 예) 적절한 여기 / 발광 최대치와 광 큐브를 함유 형광 가능한 실체 처리에 앞서 형광 대해 입체적 폐를 조사하는데 사용될 수있다.
   3. 폐 즉시 분석 할 경우, 'RNA 분리'부분을 진행합니다. 그렇지 않으면, 액체 비누를 사용하여 동결 조직 스냅ID 질소 나 드라이 아이스. -80 ° C에서 보관하십시오.

2. RNA 분리

참고 : 대표 분석을 위해, RNA는 RNA 분리 키트 (자료 목록을 참조)를 사용하여 분리 하였다. 현재의 분석은 하나의 특정 제조 업체의 제품을 사용하는 동안, 분리 키트의 다양한 여러 유명 업체에서 사용할 수 있습니다. 또한, 비 기반 키트 원심 분리 방법이 또한 옵션이다. cDNA를 또한 표준 곡선 분석을위한 세포주 또는 플라스미드로, 양성 대조군 샘플로부터 RNA를 제조한다. 또한, 프라이머 프로브 세트에 대한 특정 양의 제어가 구입하실 수 있습니다 (자료 목록 참조).

1. 이전에 냉동 조직을 사용하는 경우, 드라이 아이스에 냉동 조직을 수집합니다.
2. 같은 다음 방법 중 하나를 사용하여 조직을 균질화 : 박격포와 유 봉 액체 질소에 조직을 동결 한 후 드라이 아이스를 통해 손에 의해 수행 연삭; 조직 균질 또는 기계적 분리 장치제조업체의 제안에 따라; 초음파, 또는 다른 선호하는 방법.
   참고 : 대표 분석을 위해, 균질화 선호하는 방법은 초음파이다.
   1. 도 3에 제시된 분석의 비율로 용해 (RNA 분리 키트로 제공) 버퍼 및 2- 메르 캅토 에탄올을 제조 20 ㎕의 2- 머 캅토 에탄올 용해 버퍼마다 1 ml의 용. 재현 탁 조직 300 ㎕의 용해 완충액 30 % 진폭으로 설정 초음파기 10 초 동안 초음파 처리하고 조직의 각 30g을 위해 2- 머 캅토 에탄올이 보충.
   2. 분쇄 한 후 300 μL 용해 버퍼에 재현 탁 지상 조직, 박격포와 유 봉을 사용하는 경우.
3. 590 μL TE 버퍼 (1 mM의 EDTA 10 mM 트리스 - 염산, pH를 8.0)에 10 μL의 단백질 분해 효소 K를 추가합니다. 조직의 (즉, 매 30 mg을 위해) 각 300 μL에 600 μL의 단백질 분해 효소 K 솔루션을 추가합니다. 실온에서 10 분 동안 품어.
   참고 : 소화 시간이 다를 수 있습니다.
4. ≥1 원심 분리기 샘플10 분 3,000 g의 이물질을 제거합니다.
5. 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다.
6. RNA를 침전 상층 액의 모든 900 μL, 450 μL 에탄올 (96 % -100 %)를 추가합니다.
7. 컬럼에 해물 / 에탄올 혼합 700 μl를 전송합니다.
8. 1 분 ≥13,000 G에서 원심 분리기 샘플은 열에 RNA를 결합합니다.
9. 액체 폐기물을 버리고 컬럼에 남아있는 상층 액을 추가하고 다시 스핀.
10. 모든 해물이 칼럼을 통해 방사되면 30 초 동안 ≥13,000 g에서 원심 분리 컬럼 샘플의 상부에 세척 완충제 (1)의 350 μL를 추가한다.
11. 열에서 액체를 취소하고 상부를 교체합니다.
12. 내가 10 배의 DNase의 5 μL 및 샘플 당 DNase를 /의 RNase없는 물 40 μL (50 μL / 샘플의 총 부피)와 효소의 DNase의 5 단위를 혼합하여 DNase의를 준비합니다.
13. DNase의 50 μL 각 열을 혼합하고 실온에서 15 분 동안 품어 추가합니다.
14. 열 및 원심 분리기 샘 워시 버퍼 1의 350 μl를 추가PLES 30 초 동안 ≥13,000 G에서.
15. 열에서 액체를 취소하고 상부를 교체합니다.
16. 컬럼에 워시 버퍼 2의 600 μl를 추가하고 ≥13,000 g에서 30 초 스핀.
17. 열에서 액체를 취소하고 상부를 교체합니다.
18. ≥13,000 g에서 2 분 동안 250 워시 버퍼 2 μL와 원심 분리기를 추가합니다.
19. 새 컬렉션 튜브에 열의 일부를 넣고 오래 수집 튜브를 폐기합니다.
20. 컬럼의 RNase / DNase를 무료로 물을 50 ~ 100 μl를 추가하고 1 분 동안 품어.
21. ≥13,000 g에서 1 분간 스핀.
22. 다시 실행 RNA 수율을 높이기 위해 칼럼을 통해 수집 된 용출액을.
23. 즉시 사용, 얼음에 샘플을 유지하고 정량를 진행합니다. 나중에 사용하기 위해, 드라이 아이스, 액체 질소에 동결 스냅. -80 ° C의 냉동고에서 보관이 필요할 때까지.

3. 첫 번째 가닥 합성

주 : 대표적인 분석을 위해, 역전사 효소 (RT) 반응을 수행 하였다 F(자료 목록 참조) QRT-PCR을 위해 설계 IRST 가닥 cDNA 합성 키트.

1. 샘플은 이전에 수집 된 경우, 얼음에 튜브를 해동.
2. 분광 광도계를 사용하여 RNA의 양을 측정한다.
3. 전체 RNA의 0.5 μg의 사용, cDNA의 주식을 생성하는 역전사 효소를 사용하여 첫 번째 가닥 합성을 수행합니다.
   1. 멸균 된 RNase / DNase의 프리 PCR 튜브 / 플레이트에서, 반응 혼합물 (표 1)을 제조 하였다. 부드럽게 원심 분리기 섞는다. 표준 PCR 기계 (표 2) 프로그램.
4. 멸균 뉴 클레아없는 물을 사용하여 원하는 볼륨 (일반적으로 50 ~ 100 μL)에 완성 된 반응을 희석.

4. 실시간 PCR

주 : 대표적인 분석을 위해, SYBR 그린을 이용 하였다. 그러나, 임의의 바람직한 방법은 사용자의 결정에 치환 될 수있다.

1. 양성 대조군의 cDNA를 사용하여 각 프라이머 세트에 대한 표준 곡선을 설정합니다.
   1. 분석 내가 보여 위해N 그림 3은, 양성 대조군의 cDNA를 추천 제조업체를 사용하여 인간의 HER2에 대한 표준 곡선을 준비 (자료 목록 참조). 마우스 GAPDH에 대해, 표준 곡선을 생성하는 음성 대조군 폐의 cDNA를 사용한다. 5 기준을 생성하는 4 : 각 프로브에 대해, 직렬의 cDNA 1 희석.
2. 표준 곡선 및 실험 샘플을 포함해야 총 샘플들의 수를 계산한다.
   참고 : 분석은 여기에 설명 된 내용은 샘플 당 2-3 실험 복제를 분석 하였다. 표준 곡선 분석은 최종 정규화 양을 계산하는 샘플 당 상대적 HER2의 양 및 GAPDH를 결정하도록 적용될 수있는 단순 회귀 분석 모델을 생성하기 위해 수행 하였다. 이 분석은 또한 프라이머 효율이 손의 분석에 적합한 지 확인합니다.
3. 멸균 된 RNase / DNase의 무료 관에서, 마스터 믹스 (표 3)를 준비합니다.
   1. 마스터 믹스 amoun을 계산샘플 당 T. 하나 이상의 샘플까지 확장 할 수 있습니다. 관심있는 각각의 실험 유전자뿐만 아니라, GAPDH 등의 내부 제어를 위해 마스터 믹스를 사용한다. 200 nm의 최종 농도 GAPDH에 대한 프라이머를 사용합니다.
      참고 : 인간 및 마우스 세포의 기원을 구별 할 때 내부 통제에 특히 유용하다.
      주 : HER2 프라이머 농도는 최적화 제조업체에 의해 결정 하였다.
4. 각 표준 또는 실험 샘플에 해당하는 1 μL의 cDNA를을 포함하는 테스트 판을 준비합니다. 각각의 프라이머 프로브 잘 적어도 1의 cDNA 샘플 /을 할당합니다. 각각의 프라이머 프로브 잘 당 마스터 믹스 19 μl를 추가합니다.
   참고 :도 3의 대표 데이터를 들어, cDNA를 시료는 각 프라이머 프로브 이중으로 분석하고, 두 개의 샘플의 평균으로 그래프.
5. QRT-PCR 시스템에서 실행 반응은 권장 또는 이전 PCR 프로토콜을 테스트하여. 표 4 참조 도 3 및도 4에 대표 데이터에 사용되는 PCR 프로토콜 trong>.

결과

시간을 초과가 실험 동물 내로하면 종양 세포의 초기 접종을 수행하는 데 걸리는 행하는, 생체 내 종양 분석, 조직 수확 RNA 분리 및 QRT-PCR 분석에 기본이 1-2 일 과정이다 (도 1) .

총 분석의 예는 폐 조직 내에서 종양 세포를 평가하기위한 생물 발광 이미징이다. 여기서, 유방 종양 실험은 ACT1라는 갭 정...

토론

이 프로토콜은 이종 이식 된 마우스 모델을 이용하여 폐에 유방 종양 세포 전이를 평가 QRT-PCR의 용도를 설명한다. 그것은 생물 발광 영상을 포함한 다른 기술, 사용할 수 있으며, 또한 자신의 가치와 한계에도 불구하고 전이를 검출하는 효과가 있음을 인정한다. 제시된 데이터는 QRT-PCR 총 전이 정량 폐 조직 내 종양 유래의 mRNA를 검출하는 효과적인 조치를 제공하는 것이 제안한다. 그것은 QRT-PCR 분...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Fisher	BP176-100
DNAse	Thermo Scientific	EN0521
GeneJet RNA Isolation Kit	Thermo Scientific	K0732
iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR	Bio-Rad	1708841
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121
PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human	Bio-Rad	100-25636
PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human	Bio-Rad	100-25716
gapdh Primer Sequence			For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG