Evaluación de pulmón metástasis en el ratón mamarias modelos tumorales mediante PCR cuantitativa en tiempo real

Resumen

Este protocolo describe cómo utilizar cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR) para detectar ARNm específicos de células tumorales que representan la metástasis en el tejido pulmonar de ratón.

Resumen

La enfermedad metastásica es la propagación de las células tumorales malignas desde el sitio del cáncer primario a un órgano distante y es la causa principal de muerte de cáncer asociado ^1. Los sitios comunes de diseminación metastásica incluyen pulmón, ganglios linfáticos, el cerebro y la médula ^2. Mecanismos que impulsan la metástasis son áreas intensas de la investigación del cáncer. En consecuencia, los ensayos eficaces para medir la carga metastásica en sitios distantes de las metástasis son instrumentales para la investigación del cáncer. Evaluación de metástasis de pulmón en modelos tumorales mamarias se realiza generalmente mediante la observación cualitativa bruto de tejido pulmonar después de la disección. Los métodos cuantitativos de evaluación de metástasis se limitan actualmente a ex vivo y en técnicas de imagen basadas vivo que requieren parámetros definidos por el usuario. Muchas de estas técnicas se encuentran en todo el nivel de organismo en lugar del nivel celular ^3-6. Aunque los métodos de imagen más recientes que utilizan microscopía de múltiples fotones son capaces de evaluar MetasTasis a nivel celular ^7, estos procedimientos altamente elegantes son más adecuadas para la evaluación de los mecanismos de difusión en lugar de la evaluación cuantitativa de la carga metastásica. Aquí, se presenta un método simple in vitro para evaluar cuantitativamente la metástasis. Usando cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR), el ARNm de células específicas de tumor se puede detectar en el tejido de pulmón de ratón.

Introducción

Análisis de QRT-PCR se propone como un método para evaluar la metástasis del tumor. Este método se propone como una alternativa para los usuarios que están interesados ​​en la evaluación de la metástasis, pero no pueden tener acceso a equipos específicos, como in vivo equipos de imagen o un estereoscopio capaz de fluorescencia. Una discusión de los métodos comúnmente utilizados se muestra seguido por una demostración de cómo el análisis de QRT-PCR se puede utilizar ya sea como un separado o como un método compañero para evaluar la metástasis. Este procedimiento tiene el potencial de proporcionar un análisis cuantitativo de la carga metastásica.

Los métodos estándar de análisis bruto, incluyendo la visualización de los pulmones bajo un microscopio estereoscópico, así como seccionamiento en serie seguida de hematoxilina y eosina (H & E) tinción del tejido pulmonar, son cuantificables, pero dependen en gran medida de los parámetros definidos por el usuario para el recuento de ^2-5. Al evaluar los pulmones enteros utilizando un microscopio estereoscópico, sólo las grandes metástasis superficiales son visible y análisis requiere que el investigador tenga conocimiento razonable de la estructura anatómica pulmonar para determinar lo que constituye una lesión metastásica. Etiquetado fluorescente de las células tumorales con un marcador tal como GFP y el uso de un microscopio estereoscópico que contiene un cubo de luz con los máximos apropiados de excitación / emisión (por ejemplo, cerca de 470/510 nm para GFP) ayuda en este proceso, pero sólo nódulos tumorales superficie son detectables . Además, la fluorescencia de la contaminación de la sangre, que es visible bajo los mismos parámetros que las buenas prácticas agrarias, puede conducir a la falsa identificación de posibles lesiones metastásicas.

Seccionamiento del pulmón seguido por tinción con H & E para visualizar metástasis de pulmón es un método útil para evaluar las micrometástasis y otros procesos microscópicos incluyendo infiltración de células inmunes, pero a menudo requiere el uso de todo el tejido pulmonar para inclusión en parafina, seccionando, y los procedimientos de tinción. Por lo tanto, los procedimientos posteriores no son ideales siguiendo ese methore. Aunque cuantificable, este procedimiento requiere que el investigador para evaluar un gran número de secciones de pulmón teñidas por animal para asegurar que el análisis representa toda la estructura 3D del pulmón. En consecuencia, este tipo de examen es mucho tiempo, puede conducir a error a contar, y el análisis se basa principalmente en la discreción del investigador.

Varias de las técnicas de imagen in vivo (por ejemplo, MRI, PET, SPECT) se utilizan actualmente para llevar a cabo o probar los procesos biológicos en modelos de roedores experimentales ^8. En bioluminiscente de imágenes in vivo es un método común utilizado para adquirir una visión bruto de metástasis ^9. Esta técnica se aplica generalmente para evaluar la presencia de actividad de informador de luciferasa debido a la acumulación de las células tumorales, que están diseñados para contener un elemento de respuesta de la luciferasa, que residen en órganos específicos, como la glándula mamaria después de la implantación de células tumorales y el pulmón a metástasis espontánea ¹0. La visualización de la actividad de informador de luciferasa se ​​induce por la presencia de sustrato de luciferina (D-luciferina). Luciferasa cataliza la descarboxilación oxidativa de D-luciferina a oxiluciferina la generación de bioluminiscencia. Aunque informativa, este método está limitado por varios factores, incluyendo la estabilidad del sustrato (es decir, la vida media corta), la distribución adecuada de sustrato que depende de cómo se entrega a los animales de experimentación, y la baja sensibilidad de detección ^9. Un mérito principal de esta técnica es que es no invasivo, se puede realizar en animales vivos, y puede conducir a la detección de metástasis de células tumorales en múltiples órganos que pueden no haber sido normalmente cosechadas en la disección ^9,10.

Un aspecto positivo de la in vivo las técnicas de imagen es que el tejido pulmonar no perturbado permitiendo procedimientos secundarios como la inclusión en parafina o como se presenta aquí, el análisis QRT-PCR. Sin embargo, debido QRT-PCR es theoreticaLLY una medida más sensible de detección, evaluación bruto no puede revelar un número bajo de células tumorales presentes en el pulmón. Si bien es útil, las técnicas de imagen descritos anteriormente pueden ser sustituidos o complementarse con el método de QRT-PCR descrito actualmente. QRT-PCR tiene el potencial de proporcionar una medida sensible de mRNA derivados del tumor dentro de un pulmón.

Protocolo

El protocolo sigue las directrices y normas de cuidado de los animales de la Universidad Médica de Carolina del Sur (MUSC) y su Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC).

1. Disección de pulmón

1. La disección del tumor mamario (opcional, dependiendo de los objetivos del estudio y si se realizó un análisis del tumor primario o vena de la cola de la inyección).
   1. La eutanasia del ratón utilizando una dosis letal de anestesia con isoflurano según IACUC y la regulación de la universidad. Confirme la eutanasia por dislocación quirúrgica.
   2. El tablero de la espuma, el pin con alfileres de disección mediante la colocación del ratón sobre la espalda con los miembros propagación.
   3. Pulverizar ratón con etanol al 70%.
   4. El uso de pinzas, sujete la parte inferior del animal en el centro.
   5. El uso de tijeras, corte hacia arriba, hacia el cuello a través de la piel, teniendo cuidado de no perforar la cavidad peritoneal del ratón.
   6. Reduzca la piel en las extremidades para revelar el tejido tumoral.
   7. Diseccionar tejido tumoral y preserva por método preferido, como la congelación o la fijación, para su posterior análisis (no se analiza en este protocolo).
2. Disección de tejido pulmonar.
   1. Si el tejido tumoral fue cosechada como se describe anteriormente, precisar cualquier exceso de piel.
   2. El uso de pinzas, sujete el peritoneo en el extremo inferior del animal y empezar a cortar hacia arriba, hacia la base del cuello.
   3. Cuidadosamente corte a lo largo de los lados izquierdo y derecho de la caja torácica teniendo cuidado de evitar la ruptura de cualquier vasos sanguíneos que pueden sangrar en la cavidad torácica. Quitar los huesos de las costillas por corte a la izquierda y derecha a través de las porciones de diafragma y superior de la caja torácica.
   4. Con unas pinzas captar la tráquea del ratón y tire hacia adelante.
   5. Sever la tráquea con tijeras de disección y quitar los pulmones del ratón.
      Nota: El corazón puede permanecer unido al pulmón. Si esto ocurre, diseccionar cuidadosamente corazón lejos de los pulmones teniendo cuidado de recoger todos los cinco lóbulos (véase la Figura 1 ).
   6. Lavar suavemente con PBS para eliminar el exceso de sangre.
3. Evaluación bruto del tejido pulmonar.
   1. Opción 1: En imágenes in vivo.
      1. Para imágenes de la luciferasa, ~ 10 min antes de la imagen, dar a los animales a / kg dosis 150 mg de luciferina por inyección intraperitoneal (ip). Pulmones de la imagen en vivo en animales anestesiados o si se retira después de la disección (Figura 2) ^5.
   2. Opción 2: Evaluación Bruto.
      1. Examinar los pulmones bajo microscopio estereoscópico para visualizar nódulos tumorales. Nota: Si las células son GFP marcado, un estereomicroscopio de fluorescencia capaz contiene un cubo de luz con los máximos de excitación / emisión apropiado (por ejemplo cerca de 470/510 nm) para detectar GFP puede ser utilizado para examinar los pulmones estereoscópica para la fluorescencia antes del procesamiento.
   3. Si los pulmones se van a analizar inmediatamente, proceda a la sección "Aislamiento de ARN '. De lo contrario, romper el tejido congelado usando jabón lIdentificación del nitrógeno o hielo seco. Almacenar a -80 ° C.

2. Aislamiento de ARN

Nota: Para el análisis representativo, el RNA se aisló utilizando un kit de aislamiento de ARN (ver Lista de Materiales). Mientras que el análisis actual utiliza productos de un fabricante específico, una variedad de kits de aislamiento están disponibles de varios proveedores de confianza. Además, los métodos de centrifugación no basados ​​en kit son también una opción. cDNA también debe prepararse a partir de una muestra positiva de ARN de control, tal como una línea celular o plásmido, por análisis de la curva estándar. Por otra parte, un control positivo específico para el conjunto de sonda cebador puede ser comprado (ver Lista de Materiales).

1. Si el uso de tejido previamente congelado, recopilar tejido congelado en hielo seco.
2. Homogeneizar tejido usando uno de los siguientes métodos tales como: mortero y una maja de molienda realizado por mano sobre hielo seco después de la congelación del tejido en nitrógeno líquido; homogeneizador de tejidos o dispositivo disociación mecánicapor sugerencia del fabricante; sonicación, u otro método preferido.
   Nota: Para el análisis representativo, el método preferido de homogeneización es sonicación.
   1. Para el análisis que se presenta en la Figura 3, preparar tampón de lisis (proporcionado en el kit de aislamiento de ARN) y 2-mercaptoetanol en una proporción de 20 l 2-mercaptoetanol por cada 1 ml de tampón de lisis. Tejido Resuspender en 300 l de tampón de lisis suplementado con 2-mercaptoetanol por cada 30 g de tejido y someter a ultrasonidos durante 10 s con sonicador fijado en 30% de la amplitud.
   2. Si el uso de mortero, tejido fundamental resuspende en tampón de lisis 300 l después de la molienda.
3. Añadir 10 l de proteinasa K a 590 l de tampón TE (Tris-HCl 10, pH 8,0; EDTA 1 mM). Añadir solución de 600 l de proteinasa K a cada 300 l (es decir, por cada 30 mg) de tejido. Incubar durante 10 min a TA.
   Nota: El tiempo de digestión puede variar.
4. Centrifugar las muestras en ≥13000 g durante 10 min para eliminar los residuos.
5. Transferir el sobrenadante a nuevos tubos.
6. Añadir 450 l de etanol (96% -100%) por cada 900 l de sobrenadante para precipitar el ARN.
7. Transferir 700 l de la mezcla de lisado / etanol a la columna.
8. Centrifugar las muestras en ≥13,000 g durante 1 minuto para unir ARN a la columna.
9. Deseche los residuos líquidos y añadir restante sobrenadante a la columna y girar de nuevo.
10. Una vez que todo el lisado se centrifuga a través de la columna, añadir 350 l de tampón de lavado 1 a la porción superior de las muestras de la columna y centrifugar a ≥13,000 g durante 30 seg.
11. Deseche el líquido de la columna y reemplazar parte superior.
12. Preparar DNasa mediante la mezcla de 5 unidades de DNasa I enzima con 5 l de 10x DNasa y 40 l de DNasa / RNasa libre de agua por muestra (volumen total de 50 l / muestra).
13. Añadir 50 l de DNasa mezclan a cada columna y se incuba durante 15 min a TA.
14. Añadir 350 l de tampón de lavado 1 a la columna y centrifugar samples en ≥13,000 g durante 30 segundos.
15. Deseche el líquido de la columna y reemplazar parte superior.
16. Añadir 600 l de tampón de lavado 2 a la columna y girar 30 segundos a ≥13,000 g.
17. Deseche el líquido de la columna y reemplazar parte superior.
18. Añadir 250 l de tampón de lavado 2 y centrifugar durante 2 minutos a ≥13,000 g.
19. Ponga parte de la columna en un nuevo tubo de recogida y desechar el tubo de recogida de edad.
20. Añadir 50-100 l de RNasa / DNasa agua libre a la columna y se incuba durante 1 min.
21. Haga girar durante 1 min a ≥13,000 g.
22. Vuelva a ejecutar eluato recogido a través de la columna para aumentar el rendimiento de ARN.
23. Para su uso inmediato, mantener las muestras en hielo y proceder a la cuantificación. Para su uso posterior, snap congelado en hielo seco o nitrógeno líquido. Conservar a -80 ° C congelador hasta que sea necesario.

3. Primer capítulo de síntesis

Nota: Para el análisis representativo, la transcriptasa inversa (RT) se llevó a cabo una reacción Fkit de síntesis de ADNc rimer Strand diseñado para QRT-PCR (véase la Lista de Materiales).

1. Si se recogieron muestras previamente, descongelar tubos en hielo.
2. Medir la cantidad de ARN usando un espectrofotómetro.
3. El uso de 0,5-2 g de ARN total, realice primera síntesis de la cadena utilizando transcriptasa inversa para generar ADNc de valores.
   1. En, tubos de RNasa / PCR libre de DNasa / placas estériles, preparar la mezcla de reacción (Tabla 1). Mezclar suavemente y centrifugar. Programar una máquina de PCR estándar (Tabla 2).
4. Diluir la reacción final de volumen deseado (generalmente 50 a 100 l) con agua libre de nucleasa estéril.

4.-PCR en tiempo real

Nota: Para el análisis representativo, se utilizó SYBR verde. Sin embargo, cualquier método preferido puede estar sustituido en la discreción del usuario.

1. El uso de un ADNc control positivo, configure una curva estándar para cada conjunto de cebadores.
   1. Para el análisis muestra in la figura 3, preparar la curva patrón para HER2 humano utilizando el fabricante recomienda ADNc control positivo (ver Lista de Materiales). Para GAPDH de ratón, utilice el ADNc de pulmón control negativo para generar una curva estándar. Para cada sonda, en serie diluir el ADNc de 1: 4 para generar 5 estándares.
2. Calcular el número de muestras en total, que debe incluir la curva estándar y las muestras experimentales.
   Nota: Para el análisis se describe aquí, se analizaron 2-3 repeticiones experimentales por muestra. Se realizó análisis de la curva estándar para generar un modelo de regresión lineal simple que se puede aplicar para determinar la cantidad relativa de HER2 y GAPDH por muestra para calcular la cantidad normalizada final. Este análisis también se asegurará de que la eficiencia de imprimación es adecuada para el análisis que nos ocupa.
3. En un / tubo estéril libre de DNasa, RNasa, preparar mezcla maestra (Tabla 3).
   1. Calcula master mix amount por muestra. Escala para más de una muestra. Utilice una mezcla maestra para cada gen de interés experimental, así como un control interno como GAPDH. Utilice cebadores para GAPDH a una concentración final de 200 nM.
      Nota: El control interno es particularmente útil cuando se trata de distinguir entre el origen de células humanas y de ratón.
      Nota: Concentración Primer para HER2 se optimizó y determinado por el fabricante.
4. Preparar la placa de ensayo que contiene 1 mu l cDNAs correspondientes a cada muestra estándar o experimental. Asigne al menos 1 cDNA muestra / pocillo para cada sonda de imprimación. Añadir 19 l de mezcla maestra por pozo para cada sonda de imprimación.
   Nota: Para los datos representativos en la figura 3, se analizaron las muestras de cDNA por duplicado para cada sonda de imprimación y se representan como la media de las dos muestras.
5. Reacción Ejecutar en máquina de QRT-PCR utilizando recomienda o previamente probado protocolo de PCR. Ver Tabla 4 para el protocolo de PCR utilizado para los datos representativos en la Figura 3 y la Figura 4.

Resultados

Más allá del tiempo necesario para realizar la inoculación inicial de las células tumorales en el animal experimental y, si la realización, el análisis primario del tumor in vivo, la cosecha de tejidos, aislamiento de ARN, y el análisis de QRT-PCR es un procedimiento en 1-2 día (Figura 1) .

Un ejemplo de análisis bruto es bioluminiscente de imágenes para evaluar las células tumoral...

Discusión

Este protocolo describe el uso de QRT-PCR para evaluar mamaria metástasis de células tumorales al pulmón utilizando un modelo de xenoinjerto de ratón. Se reconoce que otras técnicas, incluyendo bioluminiscente de imágenes, están disponibles y también son eficaces para la detección de metástasis a pesar de tener sus propios valores y limitaciones. Los datos presentados sugieren que QRT-PCR proporciona una medida eficaz de detectar mRNA derivadas de tumores en el tejido pulmonar para la cuantificación de la met...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Fisher	BP176-100
DNAse	Thermo Scientific	EN0521
GeneJet RNA Isolation Kit	Thermo Scientific	K0732
iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR	Bio-Rad	1708841
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121
PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human	Bio-Rad	100-25636
PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human	Bio-Rad	100-25716
gapdh Primer Sequence			For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG