Évaluation des métastases pulmonaires chez la souris tumeur mammaire modèles par PCR quantitative en temps réel

Résumé

Ce protocole décrit l'utilisation quantitative PCR en temps réel (QRT-PCR) pour détecter l'ARNm spécifique de cellules tumorales représentant métastase dans le tissu pulmonaire de souris.

Résumé

La maladie métastatique est la propagation des cellules tumorales malignes du site primaire du cancer à un organe éloigné et est la cause principale du cancer du décès associés ^1. Des sites communs de dissémination métastatique comprennent poumons, ganglions lymphatiques, le cerveau et la moelle ^2. Les mécanismes qui conduisent les métastases sont des zones intenses de recherche sur le cancer. Par conséquent, les dosages efficaces pour mesurer la charge métastatique dans des sites éloignés de métastases sont essentiels pour la recherche sur le cancer. Évaluation des métastases pulmonaires dans des modèles de tumeurs mammaires est généralement effectuée par l'observation qualitative brute de tissu pulmonaire après dissection. Les méthodes quantitatives d'évaluation des métastases sont actuellement limités à ex vivo et des techniques d'imagerie in vivo en fonction nécessitant des paramètres définis par l'utilisateur. Un grand nombre de ces techniques sont au niveau de l'organisme entier plutôt qu'au niveau cellulaire ^6.3. Bien que les nouvelles méthodes d'imagerie utilisant la microscopie multi-photons sont en mesure d'évaluer metasTASIS au niveau cellulaire ^7, ces procédures très élégantes sont plus adaptés à l'évaluation des mécanismes de diffusion plutôt que l'évaluation quantitative de la charge métastatique. Ici, une méthode in vitro simple d'évaluer quantitativement la métastase est présenté. Utilisation quantitative PCR en temps réel (QRT-PCR), de l'ARNm spécifique de cellules tumorales peut être détecté dans le tissu pulmonaire de souris.

Introduction

Analyse QRT-PCR est proposée comme méthode d'évaluation de la métastase tumorale. Cette méthode est proposé comme une alternative pour les utilisateurs qui sont intéressés à évaluer les métastases, mais peuvent ne pas avoir accès à des équipements spécifiques tels que les équipements d'imagerie in vivo ou un stéréoscope capable de fluorescence. Une discussion des méthodes couramment utilisées est présenté suivi d'une démonstration de la façon dont l'analyse QRT-PCR peut être utilisée soit comme distinct ou comme une méthode complémentaire pour évaluer les métastases. Cette procédure a le potentiel de fournir une analyse quantitative de la charge métastatique.

Les méthodes standard d'analyse brute, y compris la visualisation des poumons sous un stéréomicroscope ainsi que le sectionnement de série suivie par hématoxyline et l'éosine (H & E) coloration du tissu pulmonaire, sont quantifiables, mais dépendent fortement de paramètres définis par l'utilisateur pour compter ^2-5. Lors de l'évaluation poumons entiers en utilisant une loupe binoculaire, seules les grandes métastases de surface sont visiFIL et l'analyse nécessite l'enquêteur d'avoir une connaissance raisonnable des poumons structure anatomique pour déterminer ce qui constitue une lésion métastatique. Le marquage fluorescent des cellules tumorales avec un marqueur tel que la GFP et l'utilisation d'un microscope stéréoscopique qui contient un cube de lumière avec des maxima d'excitation / émission approprié (par exemple, près de 470/510 nm pour GFP) assiste dans ce processus, mais seulement nodules tumoraux de surface sont détectables . En outre, la fluorescence de la contamination du sang, qui est visible dans les mêmes paramètres que la GFP, peut conduire à une fausse identification de lésions métastatiques possibles.

Sectionnement du poumon, suivi par coloration H & E pour visualiser une métastase pulmonaire est une méthode utile pour évaluer les micrométastases et les autres processus microscopiques, y compris l'infiltration des cellules immunitaires, mais nécessite souvent l'utilisation du tissu du poumon entier pour inclusion dans la paraffine, de sectionnement, et des procédures de coloration. Par conséquent, les procédures en aval ne sont pas idéales suite de cette méthoré. Bien quantifiable, cette procédure nécessite l'enquêteur d'évaluer un grand nombre de sections pulmonaires colorées par animal pour assurer que les comptes de l'analyse de la structure du poumon 3D entier. Par conséquent, ce type d'examen est consommatrice de temps, peut conduire à des erreurs de comptage, et l'analyse repose largement sur la discrétion d'investigateur.

Plusieurs techniques d'imagerie in vivo (par exemple, IRM, PET, SPECT) sont actuellement utilisés pour effectuer ou de tester les processus biologiques dans des modèles rongeurs expérimentaux ^8. Dans l'imagerie bioluminescente in vivo est une méthode couramment utilisée pour acquérir une vision brute de métastases ^9. Cette technique est généralement appliquée pour évaluer la présence de l'activité de rapporteur de luciférase due à l'accumulation de cellules tumorales, qui sont conçus pour contenir un élément de réponse de la luciférase, qui résident dans des organes spécifiques tels que la glande mammaire après l'implantation des cellules tumorales et les poumons lors de métastase spontanée ¹0. La visualisation de l'activité rapporteur de la luciférase est induite par la présence du substrat de luciférine (D-luciférine). La luciférase catalyse la décarboxylation oxydative de D-luciférine pour générer oxyluciférine bioluminescence. Bien qu'il soit informatif, cette méthode est limitée par plusieurs facteurs, y compris la stabilité du substrat (c.-à demi-vie courte), la distribution adéquate de substrat qui dépend de la façon dont elle est livrée à des animaux de laboratoire, et une faible sensibilité de la détection ^9. Un mérite principal de cette technique est qu'il est non-invasif, peut être réalisée sur des animaux vivants, et peut conduire à la détection de métastases de cellules tumorales dans des organes multiples qui peuvent ne pas avoir été normalement récoltées à dissection ^9,10.

Un aspect positif de vivo techniques d'imagerie en est que le tissu pulmonaire est non perturbées permettant procédures secondaires comme inclusion dans la paraffine ou comme présenté ici, l'analyse QRT-PCR. Toutefois, en raison QRT-PCR est theoretically une mesure plus sensible de la détection, l'évaluation brute ne peut révéler un faible nombre de cellules tumorales présentes dans le poumon. Bien qu'utiles, les techniques d'imagerie décrites ci-dessus peuvent être substitués ou complétés par la méthode QRT-PCR actuellement décrit. QRT-PCR a le potentiel de fournir une mesure sensible de l'ARNm d'origine tumorale dans un poumon.

Protocole

Le protocole suit les lignes directrices et les normes de protection des animaux de l'Université médicale de Caroline du Sud (MUSC) et son institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité (IACUC).

1. Lung Dissection

1. Dissection de la tumeur mammaire (en option selon les objectifs de l'étude et si l'analyse de la tumeur primaire ou veine de la queue injection a été effectuée).
   1. Euthanasier la souris en utilisant une dose létale de l'isoflurane selon IACUC et la réglementation de l'université. Confirmez euthanasie par dislocation chirurgicale.
   2. Le panneau de mousse, broches avec broches de dissection en plaçant la souris sur son dos avec des membres propagation.
   3. Pulvériser souris avec 70% d'éthanol.
   4. En utilisant des pinces, saisir la partie inférieure de l'animal au centre.
   5. Utilisation de ciseaux, couper vers le haut vers le cou à travers la peau, en faisant attention de ne pas percer la cavité péritonéale de la souris.
   6. Coupez la peau sur les jambes pour révéler le tissu tumoral.
   7. Disséquer les tissus tumoraux et prÉSERVE par la méthode préférée, telles que le gel ou la fixation, pour une analyse ultérieure (pas discuté plus loin dans ce protocole).
2. Lung dissection des tissus.
   1. Si le tissu tumoral a été récolté comme décrit ci-dessus, cerner tout excès de peau.
   2. En utilisant des pinces, saisir péritoine à l'extrémité inférieure de l'animal et de commencer à couper vers le haut vers la base du cou.
   3. Découpez soigneusement le long des côtés gauche et droit de la cage thoracique en faisant attention d'éviter la rupture des vaisseaux sanguins qui peuvent saigner dans la cavité thoracique. Retirez les os des côtes en coupant à gauche et à droite à travers le diaphragme et supérieures des parties de la cage thoracique.
   4. En utilisant des pinces saisir la trachée de la souris et tirer vers l'avant.
   5. Couper la trachée avec des ciseaux de dissection et de supprimer les poumons de souris.
      Remarque: Le cœur peut rester attaché au poumon. Si cela se produit, disséquer soigneusement coeur loin des poumons en prenant soin de collecter toutes les cinq lobes (voir la figure 1 ).
   6. Lavez délicatement avec du PBS pour éliminer l'excès de sang.
3. Évaluation brute de tissu pulmonaire.
   1. Option 1: Dans l'imagerie in vivo.
      1. Pour l'imagerie de la luciférase, ~ 10 min avant l'imagerie, les animaux donner une dose de 150 mg / kg de la luciférine par intraperitoneale (ip) injection. Poumons de l'image in vivo chez des animaux anesthésiés ou lors de l'enlèvement après dissection (figure 2) ^5.
   2. Option 2: l'évaluation brute.
      1. Examiner les poumons sous microscope stéréo pour visualiser nodules tumoraux. Remarque: Si les cellules sont GFP étiqueté, un stéréomicroscope capable de fluorescence contenant un cube de lumière avec des maxima d'excitation / émission approprié (par exemple, près de 470/510 nm) pour détecter la GFP peut être utilisé pour examiner les poumons stéréoscopique pour la fluorescence avant le traitement.
   3. Si les poumons doivent être analysés immédiatement, passez à la section «RNA Isolation '. Sinon, snap tissus gel utilisant LIQUazote id ou de la glace sèche. Conserver à -80 ° C.

2. Isolement de l'ARN

Remarque: Pour l'analyse représentative, ARN a été isolé en utilisant un kit d'isolement d'ARN (voir liste des matières). Bien que l'analyse actuelle utilise le produit d'un fabricant spécifique, une variété de kits d'isolement sont disponibles auprès de plusieurs fournisseurs dignes de confiance. En outre, des procédés de centrifugation à base non-kit sont également une option. ADNc devrait également être préparé à partir d'un échantillon d'ARN témoin positif, par exemple une lignée cellulaire ou un plasmide, par analyse de la courbe étalon. Alternativement, un contrôle positif spécifique pour l'amorce sonde jeu peut être acheté (voir liste des matières).

1. Si vous utilisez un tissu préalablement congelé, recueillir des tissus congelés sur glace sèche.
2. Homogénéiser les tissus en utilisant l'une des méthodes suivantes telles que: mortier et un pilon de broyage effectué à la main sur de la glace sèche après le tissu dans de l'azote liquide de congélation; homogénéisateur de tissu ou dispositif de dissociation mécaniquepar la suggestion du fabricant; traitement aux ultrasons, ou toute autre méthode préférée.
   Remarque: Pour l'analyse représentative, la méthode préférée d'homogénéisation est sonication.
   1. Pour l'analyse présentée dans la figure 3, préparer un tampon de lyse (fourni dans le kit d'isolement d'ARN) et du 2-mercaptoéthanol à raison de 20 pl de 2-mercaptoéthanol pour chaque 1 ml de tampon de lyse. Tissu Remettre en suspension dans 300 pi de tampon de lyse supplémenté avec 2-mercaptoéthanol pour chaque 30 g de tissu et soniquer pendant 10 sec avec sonicator fixé à 30% d'amplitude.
   2. Si vous utilisez mortier et un pilon, tissu fondamental de remettre en suspension dans un tampon de lyse 300 pi après broyage.
3. Ajouter 10 pi de proteinase K à 590 ul de tampon TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA). Ajouter la solution K 600 pi de proteinase à tous les 300 pi (ie pour chaque 30 mg) de tissu. Incuber pendant 10 min à température ambiante.
   Note: Le temps de digestion peut varier.
4. Centrifuger les échantillons à ≥13000 g pendant 10 min pour éliminer les débris.
5. Transférer le surnageant dans des tubes neufs.
6. Ajouter 450 ul d'éthanol (96% -100%) pour chaque tranche de 900 ul de surnageant pour précipiter l'ARN.
7. Transférer 700 pl de mélange lysat / éthanol à la colonne.
8. Centrifuger les échantillons à ≥13,000 g pendant 1 min à ARN se lient à la colonne.
9. Jeter les déchets liquides et ajouter le reste du surnageant à la colonne et tourner à nouveau.
10. Une fois que tout le lysat est mis en rotation à travers la colonne, ajouter 350 ul de tampon de lavage 1 de la partie supérieure des échantillons de colonne et centrifuger à ≥13,000 g pendant 30 s.
11. Jeter le liquide de la colonne et de remplacer la partie supérieure.
12. Préparer DNase en mélangeant 5 unités de DNase I enzyme avec 5 pi de DNase 10x et 40 pi de DNase / RNase eau libre par échantillon (volume total de 50 pl / échantillon).
13. Ajouter 50 ul de DNase se mélangent à chaque colonne et incuber pendant 15 min à température ambiante.
14. Ajouter 350 pi de tampon de lavage 1 à la colonne et centrifuger samples à ≥13,000 g pendant 30 sec.
15. Jeter le liquide de la colonne et de remplacer la partie supérieure.
16. Ajouter 600 pi de tampon de lavage 2 à la colonne et tourner 30 secondes à ≥13,000 g.
17. Jeter le liquide de la colonne et de remplacer la partie supérieure.
18. Ajouter 250 pi de tampon de lavage 2 et centrifuger 2 min à ≥13,000 g.
19. Mettre une partie de colonne dans nouveau tube collecteur et jeter ancien tube collecteur.
20. Ajouter 50-100 ul de RNase / DNase eau libre à la colonne et incuber pendant 1 min.
21. Spin pendant 1 min à ≥13,000 g.
22. Re-exécuter éluat recueillies à travers la colonne pour augmenter le rendement de l'ARN.
23. Pour une utilisation immédiate, conserver des échantillons sur la glace et de procéder à la quantification. Pour une utilisation ultérieure, snap gel de la neige carbonique ou de l'azote liquide. Conserver à -80 ° C congélateur jusqu'à ce que nécessaire.

3. First Strand Synthesis

Remarque: Pour l'analyse représentative, la transcriptase inverse (RT) a été réalisée une réaction Fkit de synthèse IRST Strand ADNc conçu pour QRT-PCR (voir la liste des matériaux).

1. Si les échantillons ont déjà été prélevés, dégeler tubes sur la glace.
2. Mesurer la quantité d'ARN en utilisant un spectrophotomètre.
3. Utilisation de 0,5-2 ug d'ARN total, effectuez d'abord la synthèse du brin utilisant la transcriptase inverse pour générer des ADNc stock.
   1. Dans tubes / PCR sans DNase RNase / plaques stériles, préparer le mélange de réaction (Tableau 1). Mélanger délicatement et centrifuger. Programmer une machine de PCR standard (Tableau 2).
4. Diluer réaction fini au volume désiré (généralement 50-100 pi) avec de l'eau sans nucléase stérile.

4. PCR en temps réel

Remarque: Pour l'analyse représentative, SYBR verte a été utilisée. Cependant, toute méthode préférée peut être substitué à la discrétion de l'utilisateur.

1. Utilisation d'un ADNc de contrôle positif, mettre en place une courbe standard pour chaque jeu d'amorces.
   1. Pour l'analyse montre in Figure 3, préparer la courbe standard pour HER2 humain en utilisant recommandée par le fabricant ADNc de contrôle positif (voir liste des matières). Pour GAPDH de la souris, utiliser l'ADNc contrôle négatif du poumon pour générer une courbe standard. Pour chaque sonde, diluer en série l'ADNc 1: 4 pour générer 5 normes.
2. Calculer le nombre d'échantillons totaux, qui devrait inclure la courbe standard et échantillons expérimentaux.
   Remarque: Pour l'analyse décrite ici, 2-3 répétitions expérimentales par échantillon ont été analysés. Norme analyse de la courbe a été effectuée pour générer un modèle de régression linéaire simple qui peut être appliqué pour déterminer la quantité relative de HER2 et GAPDH par échantillon pour calculer la quantité normalisée finale. Cette analyse fera également en sorte que le rendement de l'amorce est adéquate pour l'analyse à portée de main.
3. Dans un / tube stérile, RNase DNase, préparer Master Mix (tableau 3).
   1. Calculer master mix Amount par échantillon. Redoubler d'efforts pour plus d'un échantillon. Utilisez un mélange maître pour chaque gène expérimentale d'intérêt, ainsi que d'un contrôle interne tels que GAPDH. Utilisation des amorces pour GAPDH à une concentration finale de 200 nM.
      Remarque: Le contrôle interne est particulièrement utile quand on essaie de faire la distinction entre l'origine des cellules humaines et de souris.
      Remarque: la concentration de la Reine pour HER2 a été optimisé et déterminée par le fabricant.
4. Préparer plaque d'essai contenant 1 pl des ADNc correspondant à chaque échantillon standard ou expérimentale. Allouer au moins 1 ADNc échantillon / puits pour chaque sonde primaire. Ajouter 19 pi de mélange maître par puits pour chaque sonde primaire.
   Remarque: Pour les données représentatives de la figure 3, les échantillons d'ADNc ont été analysés en double pour chaque sonde primaire et tracées à la moyenne des deux échantillons.
5. Exécutez réaction dans la machine QRT-PCR en utilisant recommandé ou déjà testé le protocole PCR. Voir le tableau 4 pour le protocole PCR utilisée pour les données représentatives de la figure 3 et la figure 4.

Résultats

Au-delà du temps nécessaire pour effectuer l'inoculation initiale des cellules tumorales dans l'animal expérimental et si la scène, primaire dans l'analyse de tumeur in vivo, la récolte des tissus, l'isolement de l'ARN et l'analyse QRT-PCR est un procédé de 1-2 jours (Figure 1) .

Un exemple d'analyse est l'imagerie bioluminescente brut pour évaluer les ...

Discussion

Ce protocole décrit l'utilisation de QRT-PCR pour évaluer mammaire métastatique des cellules tumorales dans le poumon en utilisant un modèle de xénogreffe de souris. Il est reconnu que d'autres techniques, y compris l'imagerie bioluminescente, sont disponibles et sont également efficaces pour détecter les métastases malgré leurs propres valeurs et limites. Les données présentées suggèrent que QRT-PCR fournit une mesure efficace de la détection de l'ARNm d'origine tumorale dans le tissu ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Fisher	BP176-100
DNAse	Thermo Scientific	EN0521
GeneJet RNA Isolation Kit	Thermo Scientific	K0732
iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR	Bio-Rad	1708841
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121
PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human	Bio-Rad	100-25636
PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human	Bio-Rad	100-25716
gapdh Primer Sequence			For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG