Оценка метастазов в легких у мыши опухоли молочной Модели количественными ПЦР в реальном времени

Резюме

Этот протокол описывает, как использовать количественную ПЦР в реальном времени (QRT-PCR) для обнаружения специфических мРНК опухолевых клеток, представляющих метастазы в пределах мыши легочной ткани.

Аннотация

Метастатического заболевания является распространение клеток злокачественных опухолей от первичного рака сайта на отдаленный орган и является основной причиной рака, связанного смерти ^1. Общие сайты метастазирования включают легкие, лимфатические узлы, мозг, кости и ^2. Механизмы, которые управляют метастазы интенсивные направления исследований рака. Следовательно, эффективные анализы для измерения метастатического бремя в отдаленные участки метастазирования способствуют для исследований рака. Оценка легочных метастазов в молочных моделях опухолей, как правило, выполняется по грубой качественной наблюдения легочной ткани следующим вскрытия. Количественные методы оценки метастазов в настоящее время ограничены экс естественных условиях и в естественных методов визуализации на основе, которые требуют определенных пользователем параметров. Многие из этих методов находятся на уровне целого организма, а не клеточном уровне ^3-6. Хотя новые методы визуализации, использующие многофотонное микроскопии способны оценить METASТАСИС на клеточном уровне ^7, эти высоко изящные процедуры больше подходят к оценке механизмов распространения, а не количественную оценку метастатического бремени. Здесь простой метод в пробирке, чтобы количественной оценки метастазов представлена. Используя количественный ПЦР в реальном времени (QRT-ПЦР), специфической мРНК опухолевых клеток могут быть обнаружены в мышиных легочной ткани.

Введение

Анализ QRT-ПЦР предложен в качестве метода оценки метастазов опухоли. Этот метод предлагается в качестве альтернативы для пользователей, которые заинтересованы в оценке метастазирования, но не могут иметь доступ к конкретному оборудованию, например, в естественных условиях съемочной аппаратуры или флуоресценции, способного стереоскоп. Обсуждение часто используемых методов представлена ​​последующим демонстрации для того, как анализ QRT-ПЦР может быть использован либо в качестве отдельного или в качестве метода оценки сопутствующей метастаз. Эта процедура имеет потенциал, чтобы обеспечить количественный анализ метастатического нагрузки.

Стандартные методы анализа валового, в том числе визуализации легких при помощи стереомикроскопа, а также последовательного секционирования с последующим гематоксилином и эозином (Н & Е) окрашивание ткани легкого, в количественной оценке, но в значительной степени зависят от определенных пользователем параметров для подсчета ^2-5. При оценке целые легкие с помощью стереомикроскопа, только крупные поверхностные метастазы VisiBLE и анализ требует от следователя есть достаточные знания легких анатомической структуры, чтобы определить, что представляет собой метастатического поражения. Флуоресцентные маркировки опухолевых клеток с маркером, таким как GFP и использование стереомикроскопа, который содержит световой куб с соответствующими возбуждения / испускания максимумов (например, вблизи 470/510 нм для GFP) оказывает помощь в этом процессе, но только узелки опухоли поверхность обнаруживаются , Кроме того, флуоресценция заражение крови, которая видна при тех же параметрах, как GFP, может привести к ложной идентификации возможных метастазов.

Секционирование легких с последующим H & E окрашивания визуализировать легких метастазы является полезным методом для оценки микрометастазы и другие микроскопические процессы, включая иммунной клеточной инфильтрацией, но часто требует использования всей легочной ткани для парафин, секционирование и процедур окрашивания. Таким образом, ниже по течению процедуры не являются идеальными после этого метод. Хотя количественно, эта процедура требует исследователю оценить большое количество окрашенных срезов легких каждого животного, чтобы обеспечить, что анализ составляет всего 3D структуры легких. Следовательно, этот тип исследования является трудоемким, может привести к подсчету ошибку, и анализ в значительной мере опирается на следователя усмотрению.

Несколько в естественных условиях методов визуализации (например, МРТ, ПЭТ, ОФЭКТ) в настоящее время используется для выполнения или тестирования биологических процессов в экспериментальных моделях грызунов ^8. В естественных условиях биолюминесценции изображений является распространенным методом, используемым для получения валовой вид метастазирования ^9. Этот метод обычно применяется для оценки присутствия репортера люциферазы активности вследствие накопления опухолевых клеток, которые сконструированы, чтобы содержать элемент ответа люциферазы, которые находятся в отдельных органах, таких как молочной железы после имплантации опухолевых клеток и легких при спонтанном метастазов ¹0. Визуализация люциферазы активности индуцируется присутствии субстрата люциферин (D-люциферин). Люциферазы катализирует окислительное декарбоксилирование D-люциферин на оксилюциферин генерации биолюминесценции. В то время как информативный, этот метод ограничен несколькими факторами, включая стабильность субстрата (т.е. короткий период жизни), адекватного распределения субстрата, которая зависит от того, как он будет доставлен в экспериментальных животных, и низкой чувствительности обнаружения ^9. Основным достоинством этого метода является то, что она является неинвазивным, может быть выполнена на живых животных, и это может привести к обнаружению опухолевых клеток метастазов в различных органах, которые не могут быть нормально собраны в рассечения ^9,10.

Одним из положительных аспектов в естественных условиях методов визуализации является то, что легочная ткань без помех позволяет вторичных процедур, как парафин или представлены здесь, QRT-ПЦР-анализ. Тем не менее, из-за QRT-ПЦР theoreticaLLY более чувствительной мерой обнаружения, валовой оценка не может выявить низкие количества опухолевых клеток, присутствующих в легких. В то время как полезно, что методы визуализации, описанные выше, могут быть замещены или дополнены с помощью метода ПЦР QRT-описанной в данный момент. QRT-ПЦР имеет потенциал, чтобы обеспечить чувствительной мерой опухолевых полученных мРНК в легких.

протокол

Протокол следует руководящие принципы и стандарты по уходу за животными Медицинского университета Южной Каролины (MUSC) и ее институциональных уходу и использованию животных комитета (IACUC).

1. Вскрытие легких

1. Молочная рассечение опухоли (дополнительно, в зависимости от целей исследования и первичный анализ ли опухоль или хвостовую вену инъекции проводили).
   1. Эвтаназии мышь, используя смертельную дозу анестезии ИФ в соответствии с IACUC и университетского регулирования. Подтвердите euthanization по хирургической дислокации.
   2. На пенополистирол, контактный штифтами рассечение путем размещения мыши на его спине с конечностей распространения.
   3. Спрей мышь с 70% этанола.
   4. Использование щипцов, держитесь нижнюю часть животного в центре.
   5. Использование ножницы, разрезать вверх к шее через кожу, стараясь не проколоть в брюшную полость мыши.
   6. Сократите кожи на конечностях, чтобы выявить опухоли тканей.
   7. Рассеките из опухолевой ткани и прeserve от предпочтительного способа, такого как замораживание или фиксации, для дальнейшего анализа (не обсуждаются в данном протоколе).
2. Легочная ткань рассечение.
   1. Если опухоль ткани собирали, как описано выше, придавить любую лишнюю кожу.
   2. Использование щипцов, понять брюшины в нижней части животного и начать резки вверх по направлению к основанию шеи.
   3. Осторожно разрезать вдоль левой и правой сторон грудной клетки будьте осторожны, чтобы избежать разрыва каких-либо кровеносных сосудов, которые могут кровоточить в грудной полости. Удалить кости ребер, сокращая слева и справа через диафрагму и верхних частях грудной клетки.
   4. Использование щипцов понять трахеи мыши и потяните вперед.
   5. Север трахеи с рассечение ножницами и удалить легкие от мыши.
      Примечание: Сердце может оставаться прикрепленной к легких. Если это происходит, тщательно препарировать сердце от легких будьте осторожны, чтобы собрать все пять лепестков (см рис 1 ).
   6. Вымойте осторожно PBS, чтобы удалить избыток крови.
3. Брутто оценка легочной ткани.
   1. Вариант 1: В естественных изображений.
      1. Для визуализации люциферазы, ~ 10 мин до визуализации, дать животным 150 мг / кг дозу люциферина интраперитонеальными (IP) инъекции. Легкие изображения в естественных условиях наркозом животных или при удалении после вскрытия (рис 2). ⁵
   2. Вариант 2: Полная оценка.
      1. Изучите легкие под стерео микроскоп для визуализации опухоли узелков. Примечание: Если клетки GFP помечены, флуоресцентный стереомикроскоп способны содержащий легкий куб с соответствующим максимумов возбуждения / испускания (например, рядом с 470/510 нм) для обнаружения GFP может быть использован для изучения легкие стереоскопически флуоресценции до обработки.
   3. Если легкие будут проанализированы немедленно, перейдите к разделу «Выделение РНК». В противном случае, оснастки заморозить ткань, используя жидкого мылаID азота или сухого льда. Хранить при -80 ° С.

2. Выделение РНК

Примечание: Для представительства анализа, РНК выделяли с использованием набора для выделения РНК (см список материалов). В то время как текущий анализ использует продукт одной конкретной производителя, разнообразие изоляции комплекты доступны из нескольких авторитетных поставщиков. Кроме того, не комплект методы центрифугирования, основанные также вариант. кДНК должны также быть получены из положительного контрольного образца РНК, таких как клеточной линии или плазмиды, в стандартном анализе кривой. Кроме того, положительный контроль, характерные для данного набора зондов праймеров могут быть приобретены (см список материалов).

1. При использовании ранее замороженных тканей, собирать замороженные ткани на сухом льду.
2. Однородный ткани, используя один из следующих способов, таких как: ступки и пестика измельчения выполнены вручную в течение сухого льда после замораживания ткани в жидком азоте; ткани гомогенизатор или механической диссоциации устройствоза предложение изготовителя; ультразвуком или другого предпочтительным методом.
   Примечание: Для анализа репрезентативной, предпочтительным способом гомогенизации ультразвуком.
   1. Для анализа, представленного на фиг.3, подготовки буфера для лизиса (представленную в набор для выделения РНК) и 2-меркаптоэтанол в соотношении 20 мкл 2-меркаптоэтанола на каждый 1 мл буфера для лизиса. Ресуспендируют ткани в 300 мкл лизирующего буфера с добавлением 2-меркаптоэтанола за каждые 30 г ткани и разрушать ультразвуком в течение 10 сек с ультразвуком, установленной на 30% амплитуды.
   2. При использовании ступку и пестик, ресуспендируют земля ткани в 300 мкл буфера для лизиса после измельчения.
3. Добавить 10 мкл протеиназы К 590 мкл на ТЕ-буфера (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0; 1 мМ ЭДТА). Добавить 600 мкл протеиназы K решение каждые 300 мкл (то есть для каждого 30 мг) ткани. Инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре.
   Примечание: Расщепление может меняться.
4. Центрифуга образцов при ≥13000 г в течение 10 мин для удаления остатков.
5. Передача супернатант в новые пробирки.
6. Добавить 450 мкл этанола (96% -100%) на каждые 900 мкл супернатанта для осаждения РНК.
7. Передача 700 мкл лизата / этанола смеси в колонну.
8. Центрифуга образцов при ≥13,000 г в течение 1 мин, чтобы связать РНК в колонну.
9. Откажитесь жидких отходов и добавить оставшееся супернатант в колонну и спина снова.
10. После того как все нити лизат через колонку, добавить 350 мкл промывочного буфера 1 к верхней части образцов столбцов и центрифуге при ≥13,000 г в течение 30 сек.
11. Откажитесь жидкости из колонны и заменить верхнюю часть.
12. Подготовьте ДНКазы путем смешивания 5 единиц фермента ДНКазы I с 5 мкл 10Х ДНКазы и 40 мкл ДНКазы / РНКазы свободной воды в образце (общий объем 50 мкл / образец).
13. Добавить 50 мкл ДНКазы смешать с каждого столбца и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре.
14. Добавить 350 мкл промывочного буфера 1 к колонке и центрифуги СэмаПлес на ≥13,000 г в течение 30 сек.
15. Откажитесь жидкости из колонны и заменить верхнюю часть.
16. Добавить 600 мкл промывочного буфера 2 на колонку и спина 30 сек при ≥13,000 г.
17. Откажитесь жидкости из колонны и заменить верхнюю часть.
18. Добавить 250 мкл промывочного буфера 2 и центрифуги в течение 2 мин при ≥13,000 г.
19. Положите часть колонны в новой коллекции трубки и отбросить старый пробирку.
20. Добавить 50-100 мкл РНКазы / ДНКазы воды в колонну и инкубируют в течение 1 мин.
21. Спин течение 1 мин при ≥13,000 г.
22. Повторно запустите собранную элюата через колонку для повышения урожайности РНК.
23. Для немедленного использования, держите образцы на льду и приступить к количественной. Для использования в последующем, оснастки замораживание сухим льдом или жидким азотом. Хранить при -80 ° C морозильнике до использования.

3. Первый Strand Синтез

Примечание: Для представительства анализа, реакция обратной транскриптазы (RT) была выполнена Fрежде цепи кДНК синтеза комплект предназначен для QRT-PCR (см список материалов).

1. Если образцы были предварительно собраны, оттаивают на льду трубы.
2. Измерение количества РНК с использованием спектрофотометра.
3. Использование 0,5-2 мкг тотальной РНК, синтез выполнения нити первого использованием обратной транскриптазы для генерации кДНК запас.
   1. В стерильных РНКазы / ДНКазы, свободной ПЦР пробирок / пластин, подготовить реакционной смеси (таблица 1). Осторожно перемешать и центрифуги. Программирование стандартную машину ПЦР (таблица 2).
4. Развести готовую реакцию на нужного объема (как правило, 50-100 мкл) с использованием стерильной нуклеазы без воды.

4. ПЦР в реальном времени

Примечание: Для представительства анализа использовался SYBR зеленый. Тем не менее, любой предпочтительный метод может быть заменен по усмотрению пользователя.

1. Использование положительного кДНК управления, создать стандартную кривую для каждого набором праймеров.
   1. Для анализа показали Iп Рисунок 3, готовят стандартную кривую человеческого HER2, используя рекомендованные производителем положительный кДНК управления (см список материалов). Для мыши GAPDH, используйте отрицательное кДНК управления легких для получения стандартной кривой. Для каждого зонда, последовательно разбавленной кДНК 1: 4 до 5 стандартов генерации.
2. Рассчитать общее количество образцов, которые должны включать стандартную кривую и экспериментальные образцы.
   Примечание: для анализа, описанный здесь, были проанализированы экспериментальные 2-3 дубликатов на образце. Стандартный анализ кривой была выполнена для создания простого линейную регрессионную модель, которая может применяться для определения относительного количества HER2 и GAPDH в образце, чтобы вычислить окончательное нормализованное количество. Этот анализ также будет гарантировать, что эффективность грунт является адекватным для анализа на руку.
3. В стерильной РНКазы ДНКазы / свободной трубы, подготовить мастер смеси (таблица 3).
   1. Рассчитать мастер микс Амонат в образце. Шкала для более чем одного образца. Используйте мастер смеси для каждой экспериментальной гена, а также в качестве внутреннего контроля, такие как GAPDH. Использование праймеров для GAPDH при конечной концентрации 200 нМ.
      Примечание: Внутренний контроль является особенно полезным при попытке различать человека и мыши клеток происхождения.
      Примечание: Грунтовка концентрация HER2 была оптимизирована и определяется производителем.
4. Подготовьте тестовый пластину, содержащую 1 мкл кДНК, соответствующие каждой стандартной или экспериментального образца. Выделяют по крайней мере 1 кДНК образец / и для каждого праймера зонда. Добавить 19 мкл мастер смеси на лунку для каждого праймера зонда.
   Примечание: Для репрезентативных данных на рисунке 3, образцы кДНК были проанализированы в двух экземплярах для каждого праймера и зонда графически как среднее двух образцов.
5. Запуск реакции в QRT-PCR машины с использованием рекомендуется или предварительно протестирован протокол ПЦР. Смотрите таблицу 4 для протокола ПЦР используется для репрезентативных данных на рисунке 3 и рисунке 4.

Результаты

За время, которое требуется, чтобы выполнить начальную прививку опухолевых клеток в экспериментальных животных, и если выполнять, первичный анализ в опухолевой естественных, урожая ткани, выделения РНК и анализ QRT-PCR процедура 1-2 день (Рисунок 1) ,

Обсуждение

Этот протокол описывает использование QRT-PCR для оценки молочной метастазы опухолевых клеток в легких, используя модель ксенотрансплантата мыши. Он признал, что другие методы, в том числе биолюминесценции визуализации, имеются в наличии и также эффективен для обнаружения метастазов, не...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Fisher	BP176-100
DNAse	Thermo Scientific	EN0521
GeneJet RNA Isolation Kit	Thermo Scientific	K0732
iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR	Bio-Rad	1708841
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121
PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human	Bio-Rad	100-25636
PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human	Bio-Rad	100-25716
gapdh Primer Sequence			For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG