High-throughput CRISPR Vector Konstruktion und Charakterisierung von DNA-Modifikationen durch Erzeugung von Tomaten Hairy Roots

Zusammenfassung

Verwendung von DNA-Baugruppe können mehrere CRISPR Vektoren parallel in einem einzigen Reaktions Klonierung konstruiert werden, wodurch die Konstruktion einer großen Anzahl von CRISPR Vektoren eine einfache Aufgabe. Tomato Haarwurzeln sind ein ausgezeichnetes Modellsystem CRISPR Vektoren zu validieren und mutierten Materialien erzeugen.

Zusammenfassung

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Einleitung

Die Möglichkeit, gezielte DNA-Modifikationen mit CRISPR zu erzeugen / Cas9 hat ein großes Potenzial für funktionelle Genomik Studien. Es gibt zwei Komponenten des CRISPR / Cas9 Systems; die Cas9 Nuklease, abgeleitet von Staphylococcus pyogenes und einer etwa 100-nt Führungs RNA (gRNA) Molekül , das Cas9 die gezielte DNA - Stelle (n) ¹ leitet. Zielerkennung wird durch den ersten übertragenen ~ 20-nt der gRNA, die für Hochdurchsatzproduktion von Targeting - Vektoren ^2,3 ermöglicht. Die meisten Organismen , die so konstruiert werden können, bereits mit CRISPR / Cas9 Technologie ^4,5 haben.

In Pflanzen, konstitutive Promotoren, wie den CaMV 35S - Promotor, werden üblicherweise zum Antrieb der Expression der Nuklease Cas9 ⁶ verwendet. Die gRNAs exprimiert werden, die RNA-Polymerase III U6 oder U3 Promotoren, die die erste Basis des gRNA schränkt entweder ein G, für U6 oder A für U3, für eine effiziente Transkription. Allerdings prom RNA-Polymerase IIOters, die frei von diesen Beschränkungen sind, wurden ebenfalls ^7,8 verwendet.

Verschiedene gRNAs DNA-Mutationen mit unterschiedlichen Effizienzen, induzieren und so kann es wichtig sein, um erste CRISPR Vektoren validieren, bevor in Ganzpflanzentransformationen zu investieren oder umfangreiche phänotypische Bildschirme einrichten. Transiente Expression von CRISPR - Konstrukte in Pflanzen durch Agroinfiltration beispielsweise unter Verwendung, führt im allgemeinen zu einer niedrigeren Frequenz Modifikations DNA im Vergleich zu stabilen Pflanzen ^6, was den Nachweis von Mutationen schwieriger und phänotypischen Assays unpraktisch mit solchen Ansätzen. Sogenannte Haarwurzeln sind eine bequeme, alternative System, da eine große Anzahl von unabhängigen, stabil transformierte Materialien können innerhalb von Wochen erzeugt werden, wie für eine stabile Pflanzen Monate gegenüber. CRISPR Vektoren sind sehr effektiv DNA - Mutationen in Haarwurzeln ^9,10 bei der Induktion.

DNA-Montageverfahren abzubinden effizient DNA-Fragmente enthalten, überlastapping Enden ^11. Ein wesentlicher Vorteil einiger DNA Montageverfahren ist die Fähigkeit , ssDNA (dh Oligos) in die zusammengesetzten Produkte einzuarbeiten. Da gRNAs nur ~ 20-nt lang und neue Ziele sind mit synthetisierten Oligos hergestellt werden, sind diese DNA-Montageverfahren gut zu CRISPR Klonen geeignet. Die Protokolle werden hier beschrieben auf der P201 - Reihe von CRISPR Vektoren basieren , die ¹⁰ Sojabohnen-, Pappel ¹² erfolgreich eingesetzt wurde und nun Tomate. Das Klonierungsverfahren präsentiert bietet mehrere Vorteile gegenüber dem aktuellen Klonmethode ^10. Nämlich voll funktionsfähige Vektoren können in einem einzigen Reaktions Klonierung in einem einzigen Tag erzeugt werden. Vektorkonstruktion kann auch mehrere CRISPR Vektoren parallel weiter zu reduzieren Handhabungszeit und Materialkosten zu erzeugen gepoolt werden. Wir stellen auch ein Protokoll für die Erzeugung von Tomatenhaarwurzeln als eine effiziente Methode transgenen Materialien mit Zielgen Deletionen zu erzeugen. Hairy Wurzeln sind gültig verwendetaßen die CRISPR Vektoren und liefern Material für nachfolgende Experimente.

Protokoll

1. Leitfaden RNA Entwurf und Vektorkonstruktion

1. Identifizieren Sie Zielsequenzen für die Gene von Interesse. Es gibt eine Vielzahl von Online - CRISPR Zielfindungsprogramme geeignet für diesen Schritt ^13,14.
   HINWEIS: Hier verwenden wir den GN ₂₀ GG Zielmotiv, aber andere Konstruktionen geeignet sein können , abhängig von der Anwendung oder Vektorsystem verwendet wird .
2. Design 60-mer gRNA Oligos der GN ₁₉ Teil der Zielmotive von 5 'und 3' 20-nt - Sequenzen flankiert umfassen , die für die DNA - Anordnung erforderlich sind. Das endgültige 60-mer - Motiv ist: 5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN ₁₉ -GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3 '.
   HINWEIS: Standard, entsalzt Primer funktionieren.
3. Bereiten Sie die vier DNAs für die Montage (Figur 1). Siehe ergänzende Datei für DNA-Sequenzen.
   1. Digest von 1 bis 5 & mgr; g p201N: Cas9 ¹⁰ Plasmid mit dem Restriktionsenzym Spe I in 1x Puffer 4 bei 37 ° C für 2 Stunden. Column-reinigen die eine verdauenL aut den Anweisungen des Herstellers. Resuspendieren in ~ 15 & mgr; l 10 mM Tris-HCl, und Quantifizierung durch UV-Spektrophotometrie.
   2. Durchführen einer zweiten mit dem Restriktionsenzym Swa I in 1x Puffer 3,1 bei 25 ° C für 2 Stunden zu verdauen. Überprüfen 100-200 ng auf einem 0,8% Agarosegel vollständige Verdauung zu bestätigen.
      HINWEIS: Ein richtig verdaute Plasmid wird bei 14.313 bp eine einzelne Bande haben. Anmerkung: Die Hitzeinaktivierung des Enzyms und Dephosphorylierung sind nicht erforderlich. Verdauten Plasmid kann bei -20 ° C gelagert werden.
   3. PCR - Amplifikation der Medicago truncatula (Mt) U6 - Promotor und Gerüst DNAs aus dem pUC gRNA Shuttle ¹⁰ - Plasmid der Primer Swa I_MtU6F / MtU6R und ScaffoldF / Spe I_ScaffoldR jeweils unter Verwendung. Verwenden, um eine High-Fidelity-Polymerase mit den PCR-Bedingungen: 95 ° C für 3 min; 31 Zyklen (98 ° C für 20 sec, 60 ° C für 15 sec, 72 ° C für 30 sec); und 72 ° C für 5 min.
      1. Visualisieren ~ 3 ul Aliquots der PCR-products auf einem 1% Agarosegel der Amplifikation zu bestätigen. Die MtU6 Amplikon beträgt 377 bp und das Gerüst Amplikon beträgt 106 bp. Column-reinigen die verbleibenden PCR-Produkte gemäß den Anweisungen des Herstellers, zu quantifizieren durch UV-Spektrometrie und bei -20 ° C.
   4. Resuspendieren das gesamte Rohr von gRNA Oligos bis 100 & mgr; M in Laborqualität Wasser. 1 ul 100 uM Oligo 500 ul 1x Buffer 2.1. Gut mischen. Wenn mehrere Oligos Pooling, fügen 1 ul jeder 100 & mgr; M Oligo zum 1x Buffer 2.1 Rohr. Verwässertes Oligos können bei -20 ° C gelagert werden.
4. Programmieren Sie einen Thermocycler bei 50 ° C zu halten, einen beheizten Deckel verwenden. Kombinieren von 100 ng (0,011 pmol) des linearisierten Vektor, 50 ng (0,2 pMol) von MtU6 Promotor, 12 ng (0,2 pMol) des Gerüsts, 1 ul (0,2 pmol) verdünntes gRNA oligo (n) und Wasser auf ein Volumen von 5 & ​​mgr; l. In 5 ul 2x High-Fidelity DNA Montage Master-Mix, gut mischen und Spin-down. Inkubieren Reaktion für 60 min in der50 ° C Thermocycler. Dann legen Sie die Reaktion auf Eis.
   Hinweis: Die Reaktionsvolumina erhöht werden niedrige DNA-Ausbeuten zu werden.
5. Transformieren 2 & mgr; l der Reaktion in kompetente E. coli - Zellen unter Verwendung von Standardtechniken und Platte auf LB , ergänzt mit 50 mg L ^-1 Kanamycin (Kan _50). Wachsen kontaktierten Zellen bei 37 ° C über Nacht. Speichern Sie die verbleibende DNA Montage Reaktion bei -20 ° C.
6. Colony Bildschirm durch PCR der Primer StUbi3P218R und ISceIR verwenden. Einen aliquoten der verbleibenden DNA-Baugruppe Reaktion mit Wasser 1: 5. Verwenden Sie 1 ul als positive Kontrolle für die Kolonie-Bildschirm und 1 ng Kreis p201N: Cas9 Plasmid als no-Insert Kontrolle.
   1. PCR amplifizieren unter den Bedingungen; 95 ° C für 3 min; 31 Zyklen (95 ° C für 30 sec, 58 ° C für 30 sec, 72 ° C für 30 sec); und bei 72 ° C für 5 min. Visualisieren PCR-Produkte auf einem 1% Agarosegel. Stellen Sie sicher, dass die korrekte Einfügungen haben eine Bande bei 725 bp und Vektoren Witzhout Einsätze (zB ungeschnittenen Vektor) wird eine 310-bp - Bande.
7. Wachsen positive Kolonien in LB Kan ₅₀ Flüssigkulturen über Nacht bei 37 ° C und reinigen Plasmide gemäß den Anweisungen des Herstellers. Sanger-Sequenz Plasmide mit dem StUbi3P218R Primer und richten Chromatogramme zu den MtU6 Promotor, Ziel und Gerüstsequenzen keine Fehler zu gewährleisten, wurden während der Klonierung.
8. Führen Sie Diagnose ein verdauen durch ~ 1 ug Plasmid Verdauen mit Eco RV und Sty I. Visualisierung auf einem 0,8% Agarosegel. Fragmente (in bp) sind: 4192, 2001, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318 und 174.
9. Verwenden DNA Montagevektoren zu konstruieren, mit mehreren gRNAs.
   1. Um einen Vektor mit zwei Kassetten gRNA konstruieren, verstärken die erste PCR-Position gRNA mit den Primern Swa I_MtU6F / UNS1_ScaffoldR und die zweite Position gRNA mit den Primern UNS1_MtU6F / Spe I_ScaffoldR von 1 ng von jedem der jeweiligen1.8 - Plasmide in den Schritten 1.1 aufgebaut. Verwenden Sie die PCR-Bedingungen in Schritt 1.3.3. Visualisieren ~ 3 & mgr; l-Aliquote der PCR-Produkte auf einem 1% Agarosegel der Amplifikation zu bestätigen. Amplicons sind ~ 500 bp.
   2. Kombinieren und un-gereinigte PCR-Produkte in einem 200 ul Röhrchen mischen etwa gleiche Mengen an (in der Regel 3 bis 4 & mgr; l von jedem). Zur Montage fügen 1 ul PCR - Produkte kombiniert, 50 ng Swa I und Spe I linearisiert p201N: Cas9, Laborqualität Wasser zu 2,5 ul und 2,5 ul 2x High-Fidelity - Master - Mix DNA - Montage. Inkubieren in einem 50 ° C-Thermocycler für 15 min.
      Hinweis: Die DNA-Montageanleitungen eine 2 15 min Inkubation empfiehlt - 3 Fragmente.
   3. Verwandeln Sie 1 bis 2 & mgr; l in kompetente E. coli - Zellen und Platte auf LB Kan _50. Wachsen ausplattierten Zellen bei 37 ° C über Nacht. Speichern Sie die restlichen Reaktion bei -20 ° C.
   4. Colony Bildschirm durch PCR mit Primern StUbi3P218R und ISceIR mit den gleichen Bedingungen wie in Schritt 1.6. Richtig cLones wird ein 1200 bp Amplikon haben. Wachsen positive Kolonien in LB Kan ₅₀ Flüssigkulturen über Nacht und reinigen Plasmide.
   5. Sanger-Sequenz Plasmide mit den Primern StUbi3P218R (deckt erster Position gRNA) und p201R (deckt zweiter Position gRNA). Richten Sie Chromatogramme zu den MtU6 Promotor, Ziel und Gerüstsequenzen. Diagnose verdauen mit Eco RV und Sty I in den folgenden Fragmente (in bp) führen wird: 4192, 2476, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, 174. Bolded Fragment der zweite gRNA enthält.
10. Nach Erfüllung aller Qualitätskontrolle Erwartungen, verwandeln Plasmide in Agrobacterium ¹⁵ Stamm ARqua1 rhizogenes. 1 ul der Plasmid-prep bis 50 & mgr; l elektrokompetente Zellen und elektroporieren in einem 1 mm Küvette mit den Einstellungen: 2,4 kV, 25 & mgr; F und 200 Ω. Recover Zellen in ~ 500 ul SOC und schütteln bei 28 ° C für 2 Stunden. Platte auf LB Kan ₅₀ und gZeile bei 28 ° C für 2 Tage. Führen Kolonie Bildschirm der gleichen Primer und PCR-Bedingungen als 1.3.3 verwenden. Machen Glycerin Aktien aus positiven Klonen.

2. Haarwurzel Transformation

1. Sterilisieren Tomatensamen in 20% Haushaltsbleiche für 15 min unter konstantem Mischen. In einer Laminar-Flow-Haube, entfernen Sie das Bleichmittel und waschen in sterilen Labor-grade Wasser 3 mal.
2. Die Platte 30 Samen in einem GA-7 - Box mit ½ MS - Medium (2,22 g L ^-1 MS - Salze + Gamborg Vitamine, 10 g L ^-1 Saccharose, 3 g L ^-1 Gellangummi, pH - Wert 5,8). Keimen für ~ 2 Tage im Dunkeln, dann bewegen GA-7-Boxen zum Vorschein. Wachsen Sämlinge für ca. 4 Tage im Licht.
3. Der Tag vor der Transformation, Streifen aus A. rhizogenes Kulturen auf festem LB Kan ₅₀ und wachsen über Nacht bei 28 ° C.
4. Tag der Transformation, in der Laminar-Flow-Haube montieren sterilen Materialien: 12 ml Kulturröhrchen, 50 ml konischen Röhrchen, ½ MS Flüssigkeit (kein Gellan gmgr; m), 200 uM Acetosyringons, Filterpapier, Petrischalen, Pinzetten und Skalpell, Pipetten und Pipettenspitzen. Zugeben von 25 & mgr; l Acetosyringon zu 50 ml ½ MS und gieße ~ 6 ml in jedes Kulturröhrchen.
5. Verwenden Sie einen gebogenen 200 ul Spitze A. zu kratzen rhizogenes Zellen von der Platte und resuspendieren in den 6 ml ½ MS Flüssigkeit. Vortex das Rohr um die Zellen zu resuspendieren vollständig. Nach Resuspendieren Zellen aus jedem Vektor, messen die optische Dichte (OD) von 1 ml Zellen bei einer festen Wellenlänge von 600 nM. Sicherzustellen OD zwischen 0,2 und 0,4; verdünnen oder mehr Zellen als nötig hinzuzufügen. Wiederholen Sie dies für jedes Konstrukt.
6. In ~ 2 ml ½ MS Flüssigkeit in eine Petrischale mit einem sterilen Filterpapier. Excise Cotyledonen aus den Keimlingen und auf den angefeuchteten Filterpapier. Sobald alle Kotyledonen gesammelt worden ist, schneiden die distalen ~ 1 cm aus der Keimblätter, die sich in cotyledon Stücke mit zwei Schnittenden. In Explantate auf A. rhizogenes Lösungen, Mischung und Inkubation für 20 minmit gelegentlichen Invertierung.
   Anmerkung: Etwa 12 Explantaten pro Konstrukt werden routinemäßig verwendet, obwohl so viel wie 80 Explantate in 6 ml A. inokuliert wurden rhizogenes Lösung.
7. Während der A. rhizogenes Inkubation Filterpapier auf Petrischalen hinzufügen, eine pro Konstrukt transformiert. Auch setzen ½ MS feste Medien, keine Antibiotika, in der Laminar-Flow-Haube, um zu trocknen.
8. Scoop Cotyledonen aus A. rhizogenes Lösung mit einer sterilen Pinzette und auf trockenes Filterpapier. Deckel mit Petri Deckel Gewebe, um sicherzustellen, nicht austrocknen, während auf die nächste Transformation fortfahren. Blot Kotyledonen auf dem Filterpapier und Transfer, abaxial Seite nach oben, MS Medien auf ½. Wrap-Platten mit chirurgischen Band und Co-kultivieren im Dunkeln bei Raumtemperatur für 2 Tage.
9. Nach der Co-Kultivierung, Transfer Kotyledonen bis abaxial Seite mit MS - Medien mit 300 mg L ^-1 Ticarcillin / Clavulansäure (Tim _300, ergänzt ½ das Wachstum von resid zu verhindernual A. rhizogenes) und Kan ₅₀ (für die Pflanzenauswahl) und wickeln mit chirurgischen Band. Pflegen Kulturen unter Leuchtstofflampen bei Raumtemperatur mit einer 16-Stunden-Photoperiode.
10. Nach ~ 1,5-2 Wochen Wurzeln mindestens 2 cm Länge werden aus den Cotyledonen Verwendung einer sterilen Pinzette herausgeschnitten und mit einem Skalpell und an MS Kan ₅₀ Tim ₃₀₀ media ½. Übertragen Sie 10 bis 15 Wurzeln auf einer einzigen Platte. Markieren Sie die Position der Wurzelspitzen mit einem Marker, wickeln mit chirurgischen Band, und halten in Kulturraum.
11. Nach einer Woche werden transformierte Wurzeln wachsen auf selektiven Medien gesehen. Ernten Sie eine Teilstichprobe von transformierten Wurzeln zur DNA-Extraktion die bevorzugte DNA-Extraktionsverfahren. Hinweis: Die Platten mit Kotyledonen kann für 2 gehalten werden - 3 wöchentliche Ernten, wonach die Wurzeln in einem wirren Durcheinander wachsen zeigen und sind schwer zu isolieren. Nicht geernteten Wurzelgewebe kann auf unbestimmte Zeit aufrechterhalten werden. Eine Vielzahl von Tests kann auf dem isolierten DNA-Probe durchgeführt werden,s auf DNA-Mutation Häufigkeit und Art bestimmen. Ergebnisse von einigen solchen Assays werden unten beschrieben.

Ergebnisse

CRISPR Vektorkonstruktion mit DNA-Baugruppe erzeugt typischerweise Dutzende bis Hunderte von unabhängigen Klonen. Colony Screening durch PCR identifiziert leicht korrekte Klone und kann zwischen Plasmide mit und ohne Einlagen (2A) unterscheiden , die für die Fehlersuche nützlich ist. Typischerweise enthalten alle Klone ein Insert und ein Benutzer entscheiden kann, die Kolonie-Screening Schritte ganz zu überspringen. Diagnostische Digests (2B) und San...

Diskussion

Since DNA assembly is used to recombine any overlapping DNA sequences, this cloning method can be applied to any CRISPR vector construction. Most CRISPR cloning schemes use either gene synthesis of the gRNA, type IIS restriction enzymes^17,18, or overlap-extension PCR¹⁹. Each of these techniques has inherent advantages and disadvantages, but they typically require multiple hands-on cloning steps. The primary advantage of the cloning method presented here is that the entire process occurs in a single,...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
NEBuilder® (HiFi DNA assembly mix)	New England Biolabs	E5520
p201N:Cas9	Addgene	59175	The p201H:Cas9 plasmid (59176) is also compatible with the reported overlaps and enzymes.
pUC gRNA Shuttle	Addgene	47024
SwaI	New England Biolabs	R0604S
SpeI	New England Biolabs	R0133S
Zymo clean and concentrator-5 column purification	Zymo Research	D4003
NEB Buffer 2.1	New England Biolabs	B7202S
NEB CutSmart (Buffer 4)	New England Biolabs	B7204S
NEB Buffer 3.1	New England Biolabs	B7203S
EconoSpin Mini Spin Column (plasmid prep)	Epoch Life Sciences	1910-050/250
EcoRV-HF®	New England Biolabs	R3195S
StyI-HF®	New England Biolabs	R3500S
MS Salts + Gamborg Vitamins	Phytotechnology Laboratories	M404
Phytagel™ (gellan gum)	Sigma Aldrich	P8169
GA-7 Boxes	Sigma Aldrich	V8505
Micropore™ surgical tape	3M	1535-0
Timentin® (Ticarcillin/Clavulanic acid)	Various	0029-6571-26
Primers 5' → 3'
SwaI_MtU6F	GATATTAATCTCTTCGATGA AATTTATGCCTATCTTATAT GATCAATGAGG
MtU6R	AAGCCTACTGGTTCGCTTG AAG
ScaffoldF	GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTT
SpeI_Scaffold R	GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG
StUbi3P218R	ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT
ISceIR	GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG	Cannot be used for Sanger sequencing since there is a second binding site on the plasmid
UNS1_Scaffold R	GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG
UNS1_MtU6 F	CATTACTCGCATCCATTCTCAT GCCTATCTTATATGATCAATGAGG
p201R	CGCGCCGAATTCTAGTGATCG
Bolded sequences denote 20-nt overlaps with linearized p201N:Cas9.