Haut-débit CRISPR Vector Construction et caractérisation de l'ADN Modifications par génération de tomate Poilu Roots

Résumé

Utilisation de l'assemblage de l'ADN, de multiples vecteurs de CRISPR peuvent être construits en parallèle dans une réaction de clonage unique, ce qui rend la construction d'un grand nombre de vecteurs CRISPR une tâche simple. Tomate racines chevelues sont un excellent modèle pour valider des vecteurs CRISPR et de générer des matériaux mutantes.

Résumé

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Introduction

La capacité de générer des modifications d'ADN ciblées avec CRISPR / cas9 a un grand potentiel pour les études de génomique fonctionnelle. Il y a deux composantes du système CRISPR / cas9; la nucléase cas9, provenant de Staphylococcus pyogenes et d'environ 100 nt ARN guide (ARNg) molécule qui dirige cas9 vers le site d'ADN cible (s) ^1. Reconnaissance cible est conférée par la première ~ 20 nt de l'gARN, ce qui permet une production à haut débit de vecteurs de ciblage ^2,3. La plupart des organismes qui peuvent être conçus, ont déjà été avec CRISPR technologie / cas9 ^4,5.

Dans les plantes, des promoteurs constitutifs tels que le promoteur CaMV 35S, sont couramment utilisés pour diriger l'expression de la nucléase cas9 ^6. Les ARNg sont exprimés en utilisant les ARN polymérase III U6 ou U3 promoteurs qui restreint la première base du gARN soit un G, pour U6, ou A pour U3, pour une transcription efficace. Cependant l'ARN polymérase II promoteurs, qui sont exempts de ces restrictions, ont également été utilisés ^7,8.

Différents ARNg induisent des mutations d'ADN avec des efficacités différentes, et ainsi il peut être important d'abord de valider les vecteurs CRISPR avant d'investir dans des transformations de plantes entières ou de la mise en place de vastes écrans phénotypiques. L' expression transitoire de constructions CRISPR chez les plantes, à l'aide agroinfiltration par exemple, se traduit généralement par une fréquence inférieure de la modification de l' ADN par rapport à des plantes stables ^6, ce qui rend difficile la détection de mutations et des analyses phénotypiques peu pratique avec de telles approches. Les soi-disant racines chevelues sont, d'un autre système commode étant donné qu'un grand nombre de matériaux indépendants, transformées de manière stable peuvent être générés en quelques semaines, au lieu de mois pour les plantes stables. Vecteurs CRISPR sont très efficaces pour induire des mutations de l' ADN dans les racines velues ^9,10.

les méthodes d'assemblage d'ADN ligaturer efficacement des fragments d'ADN contenant Surpressionapping ¹¹ se termine. Un avantage majeur de certains procédés d'assemblage d'ADN est la capacité d'incorporer ADNss (c. -à- oligos) dans les produits assemblés. Etant donné que ARNg ne sont ~ 20 nt de long et de nouvelles cibles peuvent être réalisées avec des oligos de synthèse, ces procédés d'assemblage d'ADN sont bien adaptés pour le clonage CRISPR. Les protocoles décrits ici sont basés sur la série de vecteurs p201 CRISPR qui a été utilisé avec succès dans ¹⁰ le soja, le peuplier ¹² et maintenant la tomate. La procédure de clonage présente plusieurs avantages par rapport au procédé ¹⁰ de clonage courant. À savoir, des vecteurs totalement fonctionnels peuvent être générés dans une réaction de clonage unique en une seule journée. La construction du vecteur peut également être mis en commun pour générer de multiples vecteurs CRISPR en parallèle, réduisant encore les mains sur les coûts de temps et de matériel. Nous présentons également un protocole pour la production de tomates racines velues comme une méthode efficace pour produire des matériaux transgéniques avec des délétions de gènes ciblés. racines poilues sont utilisés pour validermangé les vecteurs CRISPR et fournir du matériel pour les expériences ultérieures.

Protocole

1. Guide ARN Conception et Vector Construction

1. Identifier les séquences cibles pour des gènes d'intérêt. Il existe une variété de programmes cibles d'enquête CRISPR en ligne appropriés pour cette étape ^13,14.
   NOTE: Ici , nous utilisons le GG motif GN ₂₀ cible, mais d' autres modèles peuvent être adaptés en fonction du système d'application ou vecteur utilisé.
2. Conception 60-mer oligos gARN pour inclure la partie GN ₁₉ des motifs cibles flanquées 5 'et 3' des séquences 20-nt qui sont nécessaires pour l' assemblage d'ADN. Le dernier motif 60-mer est: 5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN ₁₉ -GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3 '.
   NOTE: Standard, amorces dessalées fonctionnent très bien.
3. Préparer les quatre ADN pour l' assemblage (figure 1). Voir le fichier supplémentaire pour des séquences d'ADN.
   1. Digest : 1 - 5 ug de p201N: cas9 ¹⁰ plasmide avec l'enzyme de restriction Spe I dans 1 x tampon de 4 à 37 ° C pendant 2 heures. Colonne-purifier le digérerelon les instructions du fabricant. Remettre en suspension dans environ 15 ul de 10 mM de Tris-HCl, et à quantifier par spectrophotométrie UV.
   2. Effectuer une deuxième digérer avec l'enzyme de restriction Swa I 1x tampon 3.1 à 25 ° C pendant 2 heures. Vérifiez 100 - 200 ng sur un gel d'agarose à 0,8% pour confirmer la digestion complète.
      NOTE: Un plasmide correctement digéré aura une seule bande à 14313 pb. Remarque: L'inactivation thermique de l'enzyme et la déphosphorylation sont pas nécessaires. plasmide digérées peut être conservé à -20 ° C.
   3. PCR amplifier le truncatula Medicago (Mt) promoteur U6 et échafaudage ADNs du pUC gARN navette ¹⁰ plasmide en utilisant les amorces Swa I_MtU6F / MtU6R et ScaffoldF / Spe I_ScaffoldR, respectivement. En utilisant une polymerase haute fidélité avec les conditions de PCR: 95 ° C pendant 3 min; 31 cycles (98 ° C pendant 20 s, 60 ° C pendant 15 s, 72 ° C pendant 30 secondes); et 72 ° C pendant 5 min.
      1. Visualisez ~ 3 aliquotes de pr PCRoduits sur un gel d'agarose 1% pour confirmer l'amplification. L'amplicon MtU6 est 377 pb et le amplicon d'échafaudage est de 106 pb. Colonne-purifier les produits de PCR restants selon les instructions du fabricant, quantifier par spectrophotométrie UV et conserver à -20 ° C.
   4. Reprendre le tube entier de oligos gARN à 100 uM dans l'eau de qualité laboratoire. Ajouter 1 pi de 100 uM à oligo 500 pi de tampon 1x 2.1. Bien mélanger. Si la mise en commun de multiples oligos, ajouter 1 pl de chaque oligo 100 uM au 1x tampon 2.1 tube. oligos dilués peuvent être conservés à -20 ° C.
4. Programmer un cycleur thermique pour maintenir à 50 ° C, à l'aide d'un couvercle chauffant. Combinez 100 ng (0,011 pmol) du vecteur linéarisé, 50 ng (0,2 pmol) de MtU6 promoteur, 12 ng (0,2 pmol) d'échafaudage, 1 pi (0,2 pmol) de diluée oligo gARN (s), et de l'eau à un volume de 5 ul. Ajouter 5 ul de 2x haute fidélité assemblage d'ADN mélange maître, bien mélanger et centrifuger. Laisser incuber la réaction pendant 60 minutes dans le50 ° C thermocycleur. Placez ensuite la réaction sur la glace.
   Nota: Les volumes de réaction peut être augmentée pour tenir compte des rendements d'ADN faibles.
5. Transformer 2 pi de la réaction dans E. compétente coli cellules en utilisant des techniques standard et plaque sur LB additionné de 50 mg L ^-1 kanamycine (Kan _50). Cultivez-cellules étalées à 37 ° C pendant la nuit. Enregistrez le reste réaction d'assemblage d'ADN à -20 ° C.
6. écran de colonie par PCR en utilisant les amorces StUbi3P218R et ISceIR. Diluer une aliquote de la réaction restant d'assemblage d'ADN avec de l'eau 1: 5. Utilisez 1 pi comme témoin positif pour l'écran de la colonie et 1 ng de p201N circulaire: cas9 plasmidique comme témoin sans insert.
   1. Amplifier par PCR avec les conditions; 95 ° C pendant 3 min; 31 cycles (95 ° C pendant 30 secondes, 58 ° C pendant 30 secondes, 72 ° C pendant 30 secondes); et à 72 ° C pendant 5 min. Visualiser les produits de PCR sur un gel d'agarose à 1%. Veiller à ce que les insertions correctes ont une bande à 725 pb et vecteurs witinserts hout (par exemple, vecteur uncut) auront une bande de 310 pb.
7. Cultiver les colonies positives dans du milieu LB ₅₀ Kan culture liquide pendant une nuit à 37 ° C et purification des plasmides selon les instructions du fabricant. séquence Sanger plasmides avec l'amorce StUbi3P218R et alignez chromatogrammes au promoteur MtU6, cible, et des séquences d'échafaudage pour assurer qu'aucune erreur n'a été introduit pendant le clonage.
8. Effectuer un diagnostic de digestion par digestion ~ 1 pg de plasmide avec Eco RV et Sty I. Visualiser sur un gel d'agarose à 0,8%. Fragments (en pb) sont les suivants: 4192, 2001, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, et 174.
9. Utilisez l'assemblage d'ADN pour construire des vecteurs avec plusieurs ARNg.
   1. Pour construire un vecteur avec deux cassettes gARN, PCR amplifient la première position gARN avec les amorces Swa I_MtU6F / UNS1_ScaffoldR et la seconde position gARN avec les amorces UNS1_MtU6F / Spe I_ScaffoldR de 1 ng de chacun des respectifsles plasmides construits dans les étapes 1.1 - 1.8. Utiliser les conditions de PCR à l'étape 1.3.3. Visualiser ~ 3 aliquotes des produits de PCR sur un gel d'agarose à 1% pour confirmer l'amplification. Amplicons sont ~ 500 pb.
   2. Combiner et mélanger des quantités approximativement égales de produits de PCR purifiés dans un-tube 200 ul (typiquement 3 - 4 ul de chaque fois). Pour le montage, ajouter 1 pl combinés produits de PCR, 50 ng de Swa I et Spe I linéarisé p201N: cas9, eau de qualité laboratoire à 2,5 pi et 2,5 pi de 2x haute fidélité assemblage d'ADN mélange maître. Incuber dans un cycleur thermique à 50 ° C pendant 15 min.
      Remarque: Les manuels d'assemblage d'ADN recommande une incubation de 15 min pour 2 - 3 fragments.
   3. Transformer 1 - 2 pi dans E. compétente cellules de E. coli et de la plaque sur LB Kan _50. Cultiver les cellules ensemencées à 37 ° C pendant une nuit. Enregistrez la réaction restant à -20 ° C.
   4. écran de colonie par PCR avec des amorces StUbi3P218R et ISceIR avec les mêmes conditions que l'étape 1.6. correct cLones auront un amplicon de 1200 pb. Cultiver les colonies positives dans du LB Kan ₅₀ cultures liquides pendant une nuit et la purification des plasmides.
   5. plasmides de séquences Sanger avec les amorces StUbi3P218R (couvre la première position gARN) et p201R (couvre la deuxième position gARN). Alignez chromatogrammes aux séquences promoteur, cibles et échafaudage MtU6. Diagnostic digérer avec Eco RV et Sty I se traduira par les fragments suivants (en pb): 4192, 2476, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, 174. fragment contient en caractères gras le second gARN.
10. Après avoir rencontré toutes les attentes de contrôle de qualité, transformer les plasmides dans Agrobacterium rhizogenes souche ARqua1 ^15. Ajouter 1 pl de la préparation de plasmide à 50 ul de cellules électrocompétentes et électroporation dans un 1 mm cuvette avec les paramètres: 2,4 kV, 25 pF, et 200 Ω. Récupérer les cellules dans ~ 500 pi de SOC et agiter à 28 ° C pendant 2 heures. Plaque sur LB Kan et ₅₀ grangée à 28 ° C pendant 2 jours. Effectuer écran de colonie en utilisant les mêmes amorces et conditions de PCR comme 1.3.3. Faire des stocks de glycérol à partir de clones positifs.

2. Hairy Racine Transformation

1. Stériliser les graines de tomates dans 20% d'eau de Javel pendant 15 min, en mélangeant constamment. Dans une hotte à flux laminaire, retirer l'eau de Javel et laver à l'eau stérile de qualité laboratoire 3 fois.
2. Plate 30 graines dans une boîte GA-7 contenant les médias ½ MS (2,22 g L ^-1 MS sels + Gamborg Vitamines, 10 g L ^-1 de saccharose, 3 g L ^-1 gomme gellane, pH 5,8). Germer pour ~ 2 jours dans l'obscurité, puis déplacez GA-7 boîtes à lumière. Cultiver des plants pour ~ 4 jours de plus à la lumière.
3. Le jour avant la transformation, série sur A. rhizogenes cultures sur LB solide Kan ₅₀ et croître à 28 ° C pendant la nuit.
4. Jour de la transformation, dans la hotte à flux laminaire assembler des matériaux stériles: 12 ml tubes de culture, 50 ml tube conique de ½ liquide MS (pas gellane gum), 200 uM acétosyringone, papier filtre, des boîtes de Pétri, pinces et scalpel, pipettes et embouts de pipette. Ajouter 25 pi de acétosyringone à 50 ml de ½ MS et versez ~ 6 ml dans chaque tube de culture.
5. Utilisez une pointe de 200 pi plié pour gratter A. rhizogenes cellules de la plaque et les remettre en suspension dans 6 ml de liquide ½ MS. Vortex le tube pour remettre en suspension complètement les cellules. Après la remise en suspension des cellules de chaque vecteur, mesurer la densité optique (DO) de 1 ml de cellules à une longueur d'onde fixe de 600 nM. Veiller à ce diamètre extérieur est compris entre 0,2 et 0,4; diluer ou ajouter plus de cellules que nécessaire. Répétez l'opération pour chaque construction.
6. Ajouter ~ 2 ml de liquide ½ MS à une boîte de Pétri avec un papier filtre stérile. cotylédons d'accise des semis et les placer sur le papier filtre humidifié. Une fois que tous les cotylédons ont été recueillies, couper les distales ~ 1 cm au large des cotylédons, résultant en morceaux de cotylédons avec deux extrémités coupées. Ajouter explants à A. solutions rhizogenes, mélanger et incuber pendant 20 minavec inversion occasionnelle.
   Note: Environ 12 explants par construction sont couramment utilisés, bien que jusqu'à 80 explants ont été inoculés dans 6 ml de A. solution rhizogenes.
7. Au cours de la R. rhizogenes incubation, ajouter du papier filtre pour boîtes de Pétri, un par construction transformé. Également mis en ½ MS milieu solide, pas d'antibiotiques, dans la hotte à flux laminaire pour sécher.
8. Scoop cotylédons sur A. solution rhizogenes avec des pinces stériles et les placer sur un papier filtre sec. Couvrir Petri pour assurer les tissus ne sèchent pas en procédant à la transformation suivante. cotylédons blot sur le papier filtre et le transfert, côté abaxial up, à ½ milieu MS. Envelopper les plaques avec du ruban adhésif chirurgical et co-cultiver dans l'obscurité à la température ambiante pendant 2 jours.
9. Après la co-culture, cotylédons de transfert, côté abaxial up, ½ milieu MS additionné de 300 mg L ^-1 acide ticarcilline / acide clavulanique (Tim _300, pour empêcher la croissance de résiduel A. rhizogenes) et Kan ₅₀ (pour la sélection des plantes) et envelopper avec du ruban adhésif chirurgical. Maintenir les cultures sous un éclairage fluorescent à la température ambiante avec une photopériode de 16 heures.
10. Après ~ 1,5 - 2 semaines racines au moins 2 cm de longueur sont excisés des cotylédons à l' aide de pinces stériles et un scalpel et transférés à ½ MS Kan ₅₀ Tim ₃₀₀ médias. Transfert de 10 à 15 racines à une seule plaque. Marquer la position des pointes des racines avec un marqueur, envelopper avec du ruban adhésif chirurgical, et maintenir dans la chambre de culture.
11. Au bout d'une semaine, les racines transformées apparaissent de plus en plus sur le milieu sélectif. Récolter un sous-échantillon de racines transformées pour l'extraction d'ADN en utilisant la méthode de l'ADN-extraction préféré. Note: Plaques avec cotylédons peuvent être conservés pendant 2 - 3 récoltes hebdomadaires, après quoi pointent les racines poussent dans un fouillis et sont difficiles à isoler. tissus non racines récoltées peuvent être maintenues indéfiniment. Une variété d'essais peut être effectuée sur l'échantillon d'ADN isolé,s pour déterminer la fréquence de mutation de l'ADN et le type. Les résultats de quelques tels essais sont décrits ci-dessous.

Résultats

construction de vecteur de CRISPR avec l'assemblage d'ADN génère généralement des dizaines à des centaines de clones indépendants. Colony dépistage par PCR identifie facilement clones corrects et peut distinguer entre les plasmides avec et sans inserts (figure 2A) qui est utile pour le dépannage. En règle générale, tous les clones contiennent un insert et un utilisateur peut choisir de sauter les étapes de criblage des colonies tout à fait. Digests d...

Discussion

Since DNA assembly is used to recombine any overlapping DNA sequences, this cloning method can be applied to any CRISPR vector construction. Most CRISPR cloning schemes use either gene synthesis of the gRNA, type IIS restriction enzymes^17,18, or overlap-extension PCR¹⁹. Each of these techniques has inherent advantages and disadvantages, but they typically require multiple hands-on cloning steps. The primary advantage of the cloning method presented here is that the entire process occurs in a single,...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
NEBuilder® (HiFi DNA assembly mix)	New England Biolabs	E5520
p201N:Cas9	Addgene	59175	The p201H:Cas9 plasmid (59176) is also compatible with the reported overlaps and enzymes.
pUC gRNA Shuttle	Addgene	47024
SwaI	New England Biolabs	R0604S
SpeI	New England Biolabs	R0133S
Zymo clean and concentrator-5 column purification	Zymo Research	D4003
NEB Buffer 2.1	New England Biolabs	B7202S
NEB CutSmart (Buffer 4)	New England Biolabs	B7204S
NEB Buffer 3.1	New England Biolabs	B7203S
EconoSpin Mini Spin Column (plasmid prep)	Epoch Life Sciences	1910-050/250
EcoRV-HF®	New England Biolabs	R3195S
StyI-HF®	New England Biolabs	R3500S
MS Salts + Gamborg Vitamins	Phytotechnology Laboratories	M404
Phytagel™ (gellan gum)	Sigma Aldrich	P8169
GA-7 Boxes	Sigma Aldrich	V8505
Micropore™ surgical tape	3M	1535-0
Timentin® (Ticarcillin/Clavulanic acid)	Various	0029-6571-26
Primers 5' → 3'
SwaI_MtU6F	GATATTAATCTCTTCGATGA AATTTATGCCTATCTTATAT GATCAATGAGG
MtU6R	AAGCCTACTGGTTCGCTTG AAG
ScaffoldF	GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTT
SpeI_Scaffold R	GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG
StUbi3P218R	ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT
ISceIR	GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG	Cannot be used for Sanger sequencing since there is a second binding site on the plasmid
UNS1_Scaffold R	GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG
UNS1_MtU6 F	CATTACTCGCATCCATTCTCAT GCCTATCTTATATGATCAATGAGG
p201R	CGCGCCGAATTCTAGTGATCG
Bolded sequences denote 20-nt overlaps with linearized p201N:Cas9.