High-throughput CRISPR vettore Costruzione e caratterizzazione di modifiche del DNA da Generazione di Roots pomodoro Peloso

Riepilogo

Utilizzando assemblaggio DNA, vettori multipli CRISPR possono essere costruiti in parallelo in una singola reazione clonazione, rendendo la costruzione di un gran numero di CRISPR vettori un compito semplice. Pomodoro radici pelose sono un sistema eccellente modello per convalidare vettori CRISPR e generare materiali mutanti.

Abstract

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Introduzione

La capacità di generare le modifiche del DNA mirati con CRISPR / Cas9 ha un grande potenziale per gli studi di genomica funzionale. Ci sono due componenti del sistema CRISPR / Cas9; la nucleasi Cas9, derivata da pyogenes Staphylococcus e una molecola di circa 100 nt guida RNA (gRNA) che dirige Cas9 al sito DNA bersaglio (s) ^1. Obiettivo riconoscimento è conferito dal primo ~ 20-nt del gRNA, che consente la produzione di high-throughput di targeting vettori ^2,3. La maggior parte degli organismi che possono essere progettati, già sono stati con CRISPR tecnologia / Cas9 ^4,5.

Nelle piante, promotori costitutivi, come il promotore CaMV 35S, sono comunemente utilizzati per guidare l'espressione della nucleasi Cas9 ^6. I gRNAs sono espressi utilizzando le RNA polimerasi III U6 o U3 promotori che limita la prima base del gRNA, o un G, per la U6, o A per U3, per la trascrizione efficiente. Tuttavia prom RNA polimerasi IIoters, che sono liberi di queste restrizioni, sono stati utilizzati ^7,8.

Diversi gRNAs inducono mutazioni del DNA con diverse efficienze, e quindi può essere importante per convalidare prima vettori CRISPR prima di investire nelle trasformazioni intero impianto o la creazione di ampi schermi fenotipici. Espressione transiente di CRISPR costruisce nelle piante, utilizzando agroinfiltration per esempio, comporta generalmente una minore frequenza di modifica DNA rispetto agli impianti stabili ^6, rendendo il rilevamento di mutazioni difficili e saggi fenotipici impraticabili con tali approcci. Le cosiddette radici pelose sono una comoda, sistema alternativo poiché un gran numero di materiali stabilmente trasformate indipendenti può essere generato all'interno settimane, anziché mesi per impianti stabili. Vettori CRISPR sono molto efficaci a indurre mutazioni del DNA nelle radici pelose ^9,10.

metodi di assemblaggio DNA legare in modo efficiente frammenti di DNA contenenti overlANALITICI finisce ^11. Un vantaggio importante di alcuni metodi di assemblaggio DNA è la capacità di incorporare ssDNA (cioè oligonucleotidi) nei prodotti assemblati. Dal momento che gRNAs sono solo ~ 20-nt lunga e nuovi obiettivi possono essere realizzati con oligonucleotidi sintetizzati, questi metodi di assemblaggio del DNA sono adatti per CRISPR clonazione. I protocolli descritti qui sono basate sulla serie P201 di vettori CRISPR che è stato usato con successo nella soia ^10, pioppo ¹² e ora pomodoro. La procedura di clonazione presentato offre diversi vantaggi rispetto al metodo di clonazione corrente ^10. Vale a dire, vettori completamente funzionali possono essere generati in una singola reazione clonazione in un solo giorno. costruzione del vettore può anche essere raggruppati per generare più vettori CRISPR in parallelo, riducendo ulteriormente hands-on costi di tempo e materiali. Presentiamo anche un protocollo per la generazione di pomodoro radici pelose come un metodo efficiente per la produzione di materiali transgenici con delezioni geniche mirate. radici pelose sono utilizzati per validemangiato i vettori CRISPR e fornire materiale per esperimenti successivi.

Protocollo

1. Guida RNA Progettazione e Costruzione di vettore

1. Identificare sequenze bersaglio per i geni di interesse. Ci sono una varietà di programmi di destinazione conoscitiva CRISPR in linea adatte per questo passo ^13,14.
   NOTA: Qui usiamo il GG motivo bersaglio GN _20, ma altri disegni possono essere adatti a seconda del sistema di applicazione o il vettore utilizzato.
2. Progettazione 60-mer oligonucleotidi gRNA per includere la porzione GN ₁₉ dei motivi di destinazione affiancato da 5 'e 3' sequenze di 20-nt che sono necessari per il montaggio del DNA. Il motivo finale 60-mer è: 5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN ₁₉ -GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3 '.
   NOTA: Standard, primer dissalati funzionano bene.
3. Preparare i quattro DNA per il montaggio (Figura 1). Vedere file supplementare per sequenze di DNA.
   1. Digest: 1 - 5 mg di p201N: Cas9 ¹⁰ plasmide con l'enzima di restrizione Spe I in 1x tampone 4 a 37 ° C per 2 ore. Colonna-purificare il digest unecondo le istruzioni del produttore. Risospendere in ~ 15 ml di 10 mM Tris-HCl, e quantificare mediante spettrofotometria UV.
   2. Eseguire una seconda digerire con l'enzima di restrizione SWA I in 1x tampone 3.1 a 25 ° C per 2 ore. Controllo di 100 - 200 ng su un gel di agarosio 0,8% per confermare completa digestione.
      NOTA: Un plasmide correttamente digerito avrà una singola banda a 14.313 bp. Nota: inattivazione termica dell'enzima e defosforilazione non sono richiesti. plasmide digerito può essere conservato a -20 ° C.
   3. PCR amplifica il truncatula Medicago (Mt) U6 promotore e impalcature DNA dal PUC gRNA navetta ¹⁰ plasmide utilizzando i primer Swa I_MtU6F / MtU6R e ScaffoldF / Spe I_ScaffoldR, rispettivamente. Utilizzare una polimerasi ad alta fedeltà con le condizioni di PCR: 95 ° C per 3 min; 31 cicli (98 ° C per 20 sec, 60 ° C per 15 sec, 72 ° C per 30 sec); e 72 ° C per 5 min.
      1. Visualizza ~ 3 aliquote microlitri di PCR products su un gel di agarosio 1% per confermare l'amplificazione. L'amplicone MtU6 è 377 bp e l'amplicone patibolo è di 106 bp. Colonna-purificare i restanti prodotti di PCR in base alle istruzioni del produttore, quantificare mediante spettrofotometria UV e conservare a -20 ° C.
   4. Risospendere l'intero tubetto di oligonucleotidi gRNA a 100 micron di acqua di laboratorio di grado. Aggiungere 1 ml di 100 mM oligo a 500 ml di 1x tampone 2.1. Mescolare bene. Se il pool più oligonucleotidi, aggiungere 1 ml di ogni oligo 100 micron al 2,1 tubo 1x tampone. oligo diluiti possono essere conservati a -20 ° C.
4. Programmare un termociclatore di tenere a 50 ° C, utilizzando un coperchio riscaldato. Combinare 100 ng (0,011 pmol) del vettore linearizzato, 50 ng (0,2 pmol) di MtU6 promoter, 12 ng (0,2 pmol) dell'impalcatura, 1 ml (0,2 pmol) di diluito oligo gRNA (s), e acqua ad un volume di 5 ml. Aggiungere 5 ml di 2x ad alta fedeltà assemblaggio DNA master mix, mescolare bene e spin down. Incubare la reazione per 60 min in50 ° C termociclatore. Poi posizionare la reazione in ghiaccio.
   Nota: i volumi di reazione può essere aumentata per ospitare basse rese di DNA.
5. Trasforma 2 ml di reazione in E. competente coli cellule utilizzando tecniche standard e piastra su LB integrato con 50 mg ^L-1 kanamicina (Kan _50). Crescere cellule placcato a 37 ° C durante la notte. Salvare la reazione di assemblaggio DNA rimanente a -20 ° C.
6. schermo Colony mediante PCR utilizzando il StUbi3P218R primer e ISceIR. Diluire un'aliquota della reazione complesso DNA residuo con acqua 1: 5. Usare 1 ml come controllo positivo per lo schermo colonia e 1 ng di p201N circolare: Cas9 plasmide come un controllo non-insert.
   1. PCR amplifica le condizioni; 95 ° C per 3 min; 31 cicli (95 ° C per 30 sec, 58 ° C per 30 sec, 72 ° C per 30 sec); ed a 72 ° C per 5 min. Visualizzare prodotti di PCR su un gel di agarosio 1%. Assicurarsi che gli inserimenti corretti hanno una banda a 725 bp e vettori ingegnoInserti Hout (ad esempio, non tagliato vettore) avranno una banda di 310 bp.
7. Crescere colonie positive in LB Kan ₅₀ colture liquide durante la notte a 37 ° C e purificare plasmidi secondo le istruzioni del produttore. Sequenza Sanger plasmidi con il primer StUbi3P218R e allineare cromatogrammi alle MtU6 promotore, target, e le sequenze ponteggio per garantire l'assenza di errori sono stati introdotti durante la clonazione.
8. Eseguire una diagnosi digest da digerire ~ 1 mg di plasmide con Eco e RV porcile I. Visualizzare su un gel di agarosio 0,8%. Frammenti (in punti base) sono: 4192, 2001, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, e 174.
9. Utilizzare il montaggio del DNA per costruire vettori con più gRNAs.
   1. Per costruire un vettore con due cassette gRNA, PCR amplifica la prima posizione gRNA con i primer Swa I_MtU6F / UNS1_ScaffoldR e la seconda posizione di gRNA con i primer UNS1_MtU6F / Spe I_ScaffoldR da 1 ng di ciascuno dei rispettiviplasmidi costruiti in passi 1.1 - 1.8. Utilizzare le condizioni di PCR nella fase 1.3.3. Visualizzare ~ 3 aliquote microlitri di prodotti di PCR su un gel di agarosio 1% per confermare l'amplificazione. Gli ampliconi sono ~ 500 bp.
   2. Unire e miscelare circa la stessa quantità di prodotti di PCR non-purificata in tubo da 200 ml (di solito 3 - 4 ml di ciascuno). Per il montaggio, aggiungere 1 ml combinati prodotti di PCR, 50 ng di Swa I e Spe I linearizzato p201N: Cas9, acqua di laboratorio di grado a 2,5 ml e 2,5 ml di 2x ad alta fedeltà assemblaggio DNA master mix. Incubare in un termociclatore a 50 ° C per 15 min.
      Nota: I manuali di montaggio DNA raccomanda 15 minuti di incubazione per 2 - 3 frammenti.
   3. Trasforma 1 - 2 ml in E. competente coli e piatto su LB Kan _50. Crescere le cellule placcato a 37 ° C durante la notte. Salvare la reazione rimanente a -20 ° C.
   4. schermo Colony mediante PCR con primer StUbi3P218R e ISceIR con le stesse condizioni passo 1.6. corretto cLones avranno un amplicone 1.200 bp. Crescere colonie positive in LB Kan ₅₀ colture liquide durante la notte e purificare plasmidi.
   5. Sanger plasmidi sequenza con il primer StUbi3P218R (buste primo posizione gRNA) e p201R (copre la seconda posizione gRNA). Allineare cromatogrammi alle MtU6 sequenze promotore, di destinazione, e ponteggi. Diagnostic digerire con Eco e RV porcile mi darà luogo ai seguenti frammenti (in bp): 4192, 2476, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, 174. frammento Bolded contiene la seconda gRNA.
10. Dopo aver incontrato tutte le aspettative di controllo della qualità, di trasformare i plasmidi in Agrobacterium rhizogenes ceppo ARqua1 ^15. Aggiungere 1 ml di preparazione plasmide di 50 ml di cellule electrocompetent e l'elettroporazione in una provetta 1 mm con le impostazioni: 2.4 kV, 25 uF, e 200 Ω. Recuperare le cellule a ~ 500 ml di SOC e agitare a 28 ° C per 2 ore. Piastra su LB Kan ₅₀ e gfila a 28 ° C per 2 giorni. Eseguire schermo colonia utilizzando gli stessi primer e condizioni di PCR come 1.3.3. Fare scorte glicerolo da cloni positivi.

Trasformazione 2. Peloso Root

1. Sterilizzare semi di pomodoro a 20% candeggina per uso domestico per 15 min, con una costante miscelazione. In una cappa a flusso laminare, rimuovere la candeggina e lavare in acqua da laboratorio-grado sterile 3 volte.
2. Piastra 30 semi in una scatola GA-7 contenenti supporti ½ MS (2,22 g L ^-1 MS sali + Gamborg vitamine, 10 g L ^-1 di saccarosio, 3 g L ^-1 gellano, pH 5,8). Germini per ~ 2 giorni al buio, quindi spostare GA-7 scatole di luce. Crescere piantine per ~ 4 più giorni alla luce.
3. Il giorno prima trasformazione, striscia fuori A. rhizogenes culture in solido LB Kan ₅₀ e crescere a 28 ° C durante la notte.
4. Giorno di trasformazione, nella cappa a flusso laminare assemblare materiali sterili: 12 ml provette di coltura, tubo da 50 ml, ½ MS liquido (non gellano gum), 200 micron acetosyringone, carta da filtro, piastre di Petri, pinze e bisturi, pipette e puntali per pipette. Aggiungere 25 ml di acetosyringone a 50 ml di ½ MS e versare ~ 6 ml in ciascuna provetta cultura.
5. Utilizzare una punta piegata 200 pl per raschiare A. cellule rhizogenes dalla piastra e risospendere in 6 ml di ½ MS liquido. Vortex la provetta per risospendere completamente le cellule. Dopo risospendere le cellule da ciascun vettore, misurare la densità ottica (OD) di 1 ml di cellule ad una lunghezza d'onda fissa di 600 nM. Assicurarsi OD è compresa tra 0,2 e 0,4; diluire o aggiungere più celle, se necessario. Ripetere per ogni costrutto.
6. Aggiungere ~ 2 ml di ½ MS liquido ad una capsula di Petri con una carta da filtro sterile. cotiledoni accise dalle piantine e posto sulla carta da filtro inumidita. Una volta che tutti i cotiledoni sono stati raccolti, tagliare i distali ~ 1 cm fuori dei cotiledoni, con conseguente pezzi cotiledone con due estremità tagliate. Aggiungere espianti ad A. soluzioni rhizogenes, si mescolano, e incubare per 20 mincon inversione occasionale.
   Nota: circa 12 espianti al costrutto sono abitualmente utilizzati, anche se, come ben 80 espianti sono stati inoculati in 6 ml di A. soluzione rhizogenes.
7. Durante la A. rhizogenes incubazione, aggiungere carta da filtro a piastre di Petri, uno per ogni costrutto trasformato. Impostare anche ½ terreni solidi MS, antibiotici, nella cappa a flusso laminare ad asciugare.
8. Scoop cotiledoni di A. soluzione rhizogenes con pinza sterile e posto su carta da filtro asciutta. Coprire con il coperchio Petri per garantire i tessuti non seccano mentre si procede alla successiva trasformazione. cotiledoni macchia sulla carta da filtro e il trasferimento, lato abaxial up, a ½ supporto MS. Avvolgere piastre con nastro chirurgico e co-coltivazione al buio a temperatura ambiente per 2 giorni.
9. Dopo aver co-coltivazione, cotiledoni di trasferimento, lato abaxial up, a ½ supporti MS integrati con 300 mg ^L-1 ticarcillina / acido clavulanico (Tim _300, per impedire la crescita di residUAL A. rhizogenes) e Kan ₅₀ (per la selezione delle piante) e avvolgere con nastro adesivo chirurgico. Mantenere culture sotto luci fluorescenti a temperatura ambiente con un fotoperiodo di 16 ore.
10. Dopo ~ 1,5 - 2 settimane radici di almeno 2 cm di lunghezza sono asportati dai cotiledoni con pinza sterile e un bisturi e trasferiti a ½ MS Kan ₅₀ Tim ₃₀₀ mezzi. Trasferire 10 a 15 radici di una singola lastra. Segnare la posizione degli apici radicali con un pennarello, avvolgere con nastro adesivo chirurgico, e mantenere in camera cultura.
11. Dopo una settimana, radici trasformate sono visti crescono sul terreno selettivo. Raccolto un sottocampione di radici trasformate per l'estrazione del DNA utilizzando il metodo del DNA di estrazione preferito. Nota: Piastre con cotiledoni possono essere conservati per 2 - 3 raccolti settimanalmente, dopo che indicano le radici crescono in un pasticcio aggrovigliato e sono difficili da isolare. tessuti radicali non raccolte possono essere mantenuti a tempo indeterminato. Una varietà di saggi può essere eseguita sul campione di DNA isolatas per determinare il DNA mutazione frequenza e tipo. I risultati di un paio di tali dosaggi sono descritti di seguito.

Risultati

CRISPR vettore costruzione con assemblaggio DNA genera tipicamente decine a centinaia di cloni indipendenti. Lo screening mediante PCR Colony identifica facilmente cloni corretti e in grado di distinguere tra i plasmidi con e senza inserti (Figura 2a) che è utile per la risoluzione dei problemi. Tipicamente, tutti i cloni contengono un inserto e un utente può scegliere di ignorare i passaggi di screening colonia del tutto. Digest diagnostici (Figura 2b)

Discussione

Since DNA assembly is used to recombine any overlapping DNA sequences, this cloning method can be applied to any CRISPR vector construction. Most CRISPR cloning schemes use either gene synthesis of the gRNA, type IIS restriction enzymes^17,18, or overlap-extension PCR¹⁹. Each of these techniques has inherent advantages and disadvantages, but they typically require multiple hands-on cloning steps. The primary advantage of the cloning method presented here is that the entire process occurs in a single,...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
NEBuilder® (HiFi DNA assembly mix)	New England Biolabs	E5520
p201N:Cas9	Addgene	59175	The p201H:Cas9 plasmid (59176) is also compatible with the reported overlaps and enzymes.
pUC gRNA Shuttle	Addgene	47024
SwaI	New England Biolabs	R0604S
SpeI	New England Biolabs	R0133S
Zymo clean and concentrator-5 column purification	Zymo Research	D4003
NEB Buffer 2.1	New England Biolabs	B7202S
NEB CutSmart (Buffer 4)	New England Biolabs	B7204S
NEB Buffer 3.1	New England Biolabs	B7203S
EconoSpin Mini Spin Column (plasmid prep)	Epoch Life Sciences	1910-050/250
EcoRV-HF®	New England Biolabs	R3195S
StyI-HF®	New England Biolabs	R3500S
MS Salts + Gamborg Vitamins	Phytotechnology Laboratories	M404
Phytagel™ (gellan gum)	Sigma Aldrich	P8169
GA-7 Boxes	Sigma Aldrich	V8505
Micropore™ surgical tape	3M	1535-0
Timentin® (Ticarcillin/Clavulanic acid)	Various	0029-6571-26
Primers 5' → 3'
SwaI_MtU6F	GATATTAATCTCTTCGATGA AATTTATGCCTATCTTATAT GATCAATGAGG
MtU6R	AAGCCTACTGGTTCGCTTG AAG
ScaffoldF	GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTT
SpeI_Scaffold R	GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG
StUbi3P218R	ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT
ISceIR	GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG	Cannot be used for Sanger sequencing since there is a second binding site on the plasmid
UNS1_Scaffold R	GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG
UNS1_MtU6 F	CATTACTCGCATCCATTCTCAT GCCTATCTTATATGATCAATGAGG
p201R	CGCGCCGAATTCTAGTGATCG
Bolded sequences denote 20-nt overlaps with linearized p201N:Cas9.