De alto rendimento CRISPR Vector construção e caracterização de DNA Modificações pela geração de raízes de tomateiro Cabeludo

Resumo

Usando o conjunto de DNA, vectores de múltiplos CRISPR podem ser construídos em paralelo numa única reacção de clonagem, tornando a construção de um grande número de vectores CRISPR uma tarefa simples. Tomate raízes peludas são um excelente sistema modelo para validar vetores CRISPR e gerar materiais mutantes.

Resumo

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Introdução

A capacidade de gerar modificações no DNA orientadas e dotadas de CRISPR / Cas9 tem um grande potencial para estudos de genômica funcional. Existem dois componentes do sistema CRISPR / Cas9; a nuclease Cas9, derivada de Staphylococcus pyogenes e um 100-nt ARN guia (gRNA) de aproximadamente molécula que dirige Cas9 ao local de ADN alvo (s) ^1. Reconhecimento do alvo é conferido pelo primeiro ~ 20 nt do gRNA, que permite a produção de alto rendimento de segmentação vetores ^2,3. A maioria dos organismos que podem ser modificadas, já esteve com CRISPR tecnologia / Cas9 ^4,5.

Em plantas, os promotores constitutivos, tais como o promotor CaMV 35S, são vulgarmente utilizados para dirigir a expressão da nuclease Cas9 ^6. Os gRNAs são expressas usando a polimerase III U6 ou U3 promotores de ARN, o que limita a primeira base do gRNA, quer um G, para U6, ou R para U3, para a transcrição eficiente. No entanto prom RNA polimerase IIoters, que são livres de tais restrições, também têm sido utilizados ^7,8.

Diferentes gRNAs induzir mutações de DNA com eficiências diferentes, e por isso pode ser importante para o primeiro validar vetores CRISPR antes de investir em transformações de toda a planta ou a criação de amplas telas fenotípicas. A expressão transiente de construções de CRISPR em plantas, utilizando agroinfiltração por exemplo, geralmente resulta em uma menor frequência de modificação do ADN, em comparação com as plantas estáveis ^​​6, tornando a detecção de mutações difíceis e ensaios fenotípicos impraticáveis ​​com tais abordagens. Os chamados raízes peludas são um sistema conveniente, alternativa uma vez que grande número de elementos independentes, transformadas de forma estável podem ser gerados dentro de algumas semanas, ao contrário de meses para plantas estáveis. Vectores CRISPR são muito eficazes na indução de mutações de ADN nas raízes ^9,10.

métodos de montagem de ADN eficiente ligar fragmentos de ADN contendo Overlapping extremidades ^11. Uma grande vantagem de alguns métodos de montagem de ADN é a capacidade de incorporar ADNcs (isto é, os oligos) para os produtos montados. Desde gRNAs são apenas ~ 20 nt de comprimento e novos alvos pode ser feita com os oligos sintetizados, estes métodos de montagem de ADN são bem adequados para a clonagem de CRISPR. Os protocolos aqui descritos baseiam-se na série de vectores de p201 CRISPR que tem sido utilizado com sucesso em plantas de soja ^{10, 12} e choupo agora tomate. O procedimento de clonagem apresentado oferece várias vantagens sobre o método de clonagem de corrente ^10. Nomeadamente, os vectores totalmente funcionais podem ser gerados numa única reacção de clonagem num único dia. construção do vector também podem ser agrupados para gerar múltiplos vetores CRISPR em paralelo, reduzindo ainda mais hands-on tempo e custos de materiais. Nós também apresentamos um protocolo para a geração de tomate raízes peludas como um método eficiente para a produção de materiais transgênicos com deleções de genes-alvo. raízes peludas são usados ​​para válidacomeu os vetores CRISPR e fornecer material para experimentos posteriores.

Protocolo

1. Guia de RNA Concepção e Construção Vector

1. Identificar sequências alvo para os genes de interesse. Há uma variedade de programas de encontrar alvo CRISPR linha adequados para este passo ^13,14.
   NOTA: Aqui usamos o GN ₂₀ GG motivo alvo, mas outros desenhos podem ser adequadas, dependendo do sistema de aplicação ou vector usado.
2. Design 60-mer oligonucleótidos gRNA para incluir a porção GN ₁₉ dos motivos alvo flanqueado em 5 'e 3' as sequências de 20 nt que são necessárias para a montagem de ADN. O motivo final de 60-mer é: 5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN ₁₉ -GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3 '.
   NOTA: Padrão, primers já dessalgado funcionar bem.
3. Prepare os quatro DNAs de montagem (Figura 1). Veja arquivo suplementar para sequências de ADN.
   1. Digerir 1-5 ug de p201N: ¹⁰ Cas9 plasmídeo com a enzima de restrição Spe ​​I em 1X tampão de 4 a 37 ° C durante 2 h. Coluna-purificar a digerir umaegundo as instruções do fabricante. Ressuspender em ~ 15 ul de Tris-HCl a 10, e quantificar por espectrofotometria de UV.
   2. Executar uma segunda digestão com a enzima de restrição Swa I em 1X tampão de 3,1 a 25 ° C durante 2 h. Verificar 100-200 ng sobre um gel de agarose a 0,8% para confirmar a digestão completa.
      NOTA: Um plasmídeo correctamente digerido terá uma única banda a 14313 pb. Nota: a inactivação térmica da enzima e desfosforilação não são necessários. plasmídeo digerido podem ser armazenadas a -20 ° C.
   3. PCR amplificar o truncatula Medicago (Mt) de promotor U6 e andaime DNAs pela PUC gRNA Shuttle ¹⁰ plasmídeo utilizando os primers Swa I_MtU6F / MtU6R e ScaffoldF / Spe I_ScaffoldR, respectivamente. Usar uma polimerase de alta fidelidade com as condições de PCR: 95 ° C durante 3 min; 31 ciclos (98 ° C durante 20 seg, 60 ° C durante 15 seg, 72 ° C durante 30 seg); e 72 ° C durante 5 min.
      1. Visualize ~ 3 mL alíquotas de pr PCRodutos sobre um gel de agarose a 1% para confirmar a amplificação. O amplicon MtU6 é 377 pb e o fragmento amplificado andaime é de 106 pb. Coluna-purificar os produtos de PCR restantes de acordo com as instruções do fabricante, quantificar por espectrofotometria de UV e armazenar a -20 ° C.
   4. Ressuspender todo o tubo de oligos gRNA 100 mM em água de grau de laboratório. Adicionar 1 ml de oligo 100 uM a 500 ul de 1x tampão de 2,1. Misture bem. Se pooling múltiplos oligos, adicionar 1 ul de cada oligo 100 uM para o tubo do tampão 1x 2.1. oligos diluído pode ser armazenado a -20 ° C.
4. Programar um termociclador para manter a 50 ° C, usando uma tampa aquecida. Combinar 100 ng (0,011 pmol) de vector linearizado, 50 ng (0,2 pmol) de promotor MtU6, 12 ng (0,2 pmol) de andaime, 1 ul (0,2 pmol) de oligo diluída gRNA (s), e água até um volume de 5 ul. Adicionar 5 ul de 2x de alta fidelidade montagem DNA mistura principal, misture bem e girar para baixo. Incubar de reacção durante 60 min no50 ° C termociclador. Em seguida, coloque a reação no gelo.
   Nota: Os volumes de reacção pode ser aumentada para acomodar os rendimentos baixos de ADN.
5. Transformar 2 ul da reacção em E. competente células de E. coli, utilizando técnicas padrão e placa em placas de LB suplementadas com 50 mg ^L-1 de canamicina (Kan _50). Crescer as células plaqueadas a 37 ° C durante a noite. Guardar a reacção montagem ADN remanescente à temperatura de -20 ° C.
6. tela Colony por PCR utilizando o StUbi3P218R primers e ISceIR. Dilui-se uma alíquota da reacção de montagem ADN remanescente com água 1: 5. Use 1 ml como um controle positivo para a tela da colônia e 1 ng de p201N circular: plasmídeo Cas9 como um controle não-inserção.
   1. Amplificar por PCR com as condições; 95 ° C durante 3 min; 31 ciclos (95 ° C durante 30 seg, 58 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 30 seg); e a 72 ° C durante 5 min. Visualizar os produtos de PCR num gel de agarose a 1%. Certifique-se de que as inserções correctas têm uma banda de 725 pb e vetores witinserções hout (por exemplo, vetor sem cortes) terá uma banda de 310 pb.
7. Crescer colónias positivas em LB Kan ₅₀ culturas líquidas durante a noite a 37 ° C e purificar plasmideos de acordo com as instruções do fabricante. sequência Sanger plasmídeos com o primer StUbi3P218R e alinhar cromatogramas ao promotor MtU6, alvo, e sequências de andaime para garantir que não haja erros foram introduzidas durante a clonagem.
8. Realizar um diagnóstico digerir por digestão ~ 1 ug de plasmídeo com Eco RV e Sty I. Visualizar num gel de agarose a 0,8%. Fragments (em pb) são: 4192, 2001, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318 e 174.
9. Use montagem DNA para construir vectores com vários gRNAs.
   1. Para construir um vector com duas cassetes gRNA, amplificar por PCR a primeira posição gRNA com os iniciadores Swa I_MtU6F / UNS1_ScaffoldR e a segunda posição gRNA com os iniciadores UNS1_MtU6F / Spe I_ScaffoldR de 1 ng de cada um dos respectivosplasmídeos construídos nos passos 1.1 - 1.8. Use as condições de PCR no passo 1.3.3. Visualizar ~ 3 aliquotas ul de produtos de PCR num gel de agarose a 1% para confirmar a amplificação. Amplicons são ~ 500 pb.
   2. Combinar e misturar quantidades aproximadamente iguais dos produtos de PCR purificados em un num tubo de 200 ul (tipicamente 3-4 mL de cada). Para a montagem, adicionar 1 ul de produtos de PCR combinados, 50 ng de Swa I e Spe I linearizado p201N: Cas9, água de grau laboratorial e 2,5 uL e 2,5 uL de 2x de alta fidelidade de ADN montagem mistura principal. Incubar em um termociclador a 50 ° C durante 15 min.
      Nota: Os manuais de montagem de DNA recomenda a 15 min de incubação por 2 - 3 fragmentos.
   3. Transformação 1 - 2 ul em E. competente coli e placa em LB Kan _50. Cultivar células plaqueadas a 37 ° C durante a noite. Guardar a reacção restante à temperatura de -20 ° C.
   4. tela Colony por PCR com primers StUbi3P218R e ISceIR com as mesmas condições que o passo 1.6. correcta clones terá um amplicon 1.200 pb. Crescer colónias positivas em LB Kan ₅₀ culturas líquidas durante a noite e purificar plasmídeos.
   5. Sanger plasmídeos sequência com o StUbi3P218R iniciadores (cobre primeira posição gRNA) e p201R (cobre-segunda posição gRNA). Alinhar cromatogramas para as sequências de promotor, de destino e de andaime MtU6. Diagnóstico digerir com Eco RV e Sty I irá resultar nos seguintes fragmentos (em pb): 4192, 2476, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, 174. fragmento em negrito contém a segunda gRNA.
10. Após a reunião todas as expectativas de controle de qualidade, transformar plasmídeos em Agrobacterium rhizogenes estirpe ARqua1 ^15. Adicionar 1 ul da preparação de plasmídeo a 50 ul de células electrocompetentes e electroporar numa cuvete de um milímetro com as definições: 2,4 kV, 25 uF, 200 e Ω. Recuperar células em ~ 500 mL de SOC e agitar a 28 ° C durante 2 h. Placa em LB Kan ₅₀ e glinha a 28 ° C durante 2 dias. tela colónia executar usando os mesmos iniciadores e condições de PCR como 1.3.3. Adicione estoques de glicerol a partir de clones positivos.

Transformação 2. Hairy Root

1. Esterilizar sementes de tomate em água sanitária de 20% para 15 min, com mistura constante. Em uma capela de fluxo laminar, retire a água sanitária e lave em água de grau de laboratório estéril 3 vezes.
2. Placa 30 sementes em uma caixa GA-7 contendo meio ½ MS (2,22 g L ^-1 MS sais + Gamborg vitaminas, 10 g L ^{-1 de} sacarose, 3 g L ^-1 goma de gel, pH 5,8). Germinar para ~ 2 dias no escuro, em seguida, passar GA-7 caixas de luz. A produção de mudas para ~ 4 mais dias na luz.
3. No dia antes da transformação, raia fora A. rhizogenes culturas acesa LB Kan ₅₀ e crescer a 28 ° C durante a noite.
4. Dia da transformação, na capela de fluxo laminar montar materiais estéreis: 12 ml tubos de cultura, tubo de 50 ml, ½ MS líquido (sem gelana gum), 200? M acetoseringona, papel de filtro, placas de Petri, pinça e bisturi, pipetas e ponteiras. Adicionar 25 ul de acetossiringona a 50 ml de ½ MS e despeje ~ 6 ml em cada tubo de cultura.
5. Use uma inclinação ponta de 200 mL para raspar A. rhizogenes células da placa e os ressuspender em 6 ml de ½ MS líquido. Vortex do tubo para voltar a suspender as células. Após ressuspender as células de cada vector, medir a densidade óptica (OD) de 1 ml de células a um comprimento de onda fixo de 600 nm. Certifique-se de OD é entre 0,2 e 0,4; diluir ou adicionar mais células como necessário. Repita o procedimento para cada construção.
6. Adicionar 2 ml de ~ ½ MS líquido para uma placa de Petri com papel de filtro estéril. cotilédones especiais sobre o consumo de mudas e coloque sobre o papel de filtro umedecido. Uma vez que todos os cotilédones foram recolhidos, cortar as distais ~ 1 cm fora dos cotilédones, resultando em peças de cotilédones, com duas extremidades cortadas. Adicionar explantes com A. soluções rhizogenes, misturar e incubar por 20 mincom inversão ocasional.
   Nota: Cerca de 12 explantes por construção são rotineiramente utilizados, embora até 80 explantes foram inoculados em 6 ml de A. solução rhizogenes.
7. Durante a A. rhizogenes incubação, adicionar papel de filtro para placas de Petri, um por construto transformado. Também definir ½ MS meios sólidos, sem antibióticos, na capela de fluxo laminar para secar.
8. Colher cotilédones de A. solução rhizogenes com uma pinça estéril e coloque sobre papel de filtro seco. Cubra com Petri tampa para garantir tecidos não sequem enquanto prosseguir para a próxima transformação. cotilédones mancha no papel de filtro e transferência, com o lado abaxial para cima, a ½ meio MS. Enrole placas com fita cirúrgica e co-cultivar no escuro à temperatura ambiente durante 2 dias.
9. Após o co-cultivo, cotilédones de transferência, com o lado abaxial para cima, para meio de cultura MS suplementado com 300 mg ^L-1 ticarcilina / ácido clavulânico (Tm _300, para impedir o crescimento de residual A. rhizogenes) e Kan ₅₀ (para seleção de plantas) e enrole com fita cirúrgica. Manter culturas sob luzes fluorescentes à temperatura ambiente com um fotoperíodo de 16 horas.
10. Depois de ~ 1,5 - 2 semanas raízes, pelo menos, 2 cm de comprimento são excisados ​​a partir dos cotilédones, utilizando fórceps estéreis e um bisturi e transferidos para meio MS Kan _{50 300} Tm meios. Transferir 10 a 15 raízes de uma única placa. Marcar a posição das pontas de raiz com um marcador, enrole com fita cirúrgica, e manter na sala de cultura.
11. Após uma semana, as raízes transformadas são vistas crescer nos meios selectivos. Colher uma subamostra de raízes transformadas para extração de DNA utilizando o método de DNA de extracção preferido. Nota: Placas com cotilédones pode ser mantido por 2 - 3 colheitas semanais, após o que apontam as raízes crescem em um emaranhado e são difíceis de isolar. tecidos da raiz não colhidas pode ser mantida indefinidamente. Uma variedade de ensaios pode ser realizado na amostra de DNA isolados para determinar a freqüência mutação do DNA e tipo. Os resultados de algumas dessas análises estão descritos a seguir.

Resultados

construção CRISPR vector com montagem de DNA normalmente gera dezenas a centenas de clones independentes. Triagem Colony por PCR facilmente identifica clones corretos e pode distinguir entre plasmídeos com e sem inserções (Figura 2A) que é útil para solução de problemas. Normalmente, todos os clones contêm uma inserção e um usuário pode optar por ignorar as etapas de triagem colónia completamente. Digestões de diagnóstico (Figura 2B) e Sa...

Discussão

Since DNA assembly is used to recombine any overlapping DNA sequences, this cloning method can be applied to any CRISPR vector construction. Most CRISPR cloning schemes use either gene synthesis of the gRNA, type IIS restriction enzymes^17,18, or overlap-extension PCR¹⁹. Each of these techniques has inherent advantages and disadvantages, but they typically require multiple hands-on cloning steps. The primary advantage of the cloning method presented here is that the entire process occurs in a single,...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
NEBuilder® (HiFi DNA assembly mix)	New England Biolabs	E5520
p201N:Cas9	Addgene	59175	The p201H:Cas9 plasmid (59176) is also compatible with the reported overlaps and enzymes.
pUC gRNA Shuttle	Addgene	47024
SwaI	New England Biolabs	R0604S
SpeI	New England Biolabs	R0133S
Zymo clean and concentrator-5 column purification	Zymo Research	D4003
NEB Buffer 2.1	New England Biolabs	B7202S
NEB CutSmart (Buffer 4)	New England Biolabs	B7204S
NEB Buffer 3.1	New England Biolabs	B7203S
EconoSpin Mini Spin Column (plasmid prep)	Epoch Life Sciences	1910-050/250
EcoRV-HF®	New England Biolabs	R3195S
StyI-HF®	New England Biolabs	R3500S
MS Salts + Gamborg Vitamins	Phytotechnology Laboratories	M404
Phytagel™ (gellan gum)	Sigma Aldrich	P8169
GA-7 Boxes	Sigma Aldrich	V8505
Micropore™ surgical tape	3M	1535-0
Timentin® (Ticarcillin/Clavulanic acid)	Various	0029-6571-26
Primers 5' → 3'
SwaI_MtU6F	GATATTAATCTCTTCGATGA AATTTATGCCTATCTTATAT GATCAATGAGG
MtU6R	AAGCCTACTGGTTCGCTTG AAG
ScaffoldF	GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTT
SpeI_Scaffold R	GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG
StUbi3P218R	ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT
ISceIR	GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG	Cannot be used for Sanger sequencing since there is a second binding site on the plasmid
UNS1_Scaffold R	GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG
UNS1_MtU6 F	CATTACTCGCATCCATTCTCAT GCCTATCTTATATGATCAATGAGG
p201R	CGCGCCGAATTCTAGTGATCG
Bolded sequences denote 20-nt overlaps with linearized p201N:Cas9.