JoVE Logo
Autoren
Kontakt

Anmelden

Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

Zusammenfassung

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

Einleitung

Eine vorgeburtliche Diagnostik ist ein wichtiges klinisches Werkzeug , um genetische Krankheiten zu bewerten (dh Chromosomenaberrationen, monogenetische oder polygenetische / multifaktoriellen Erkrankungen) und angeborene Fehlbildungen (zB Zwerchfellhernie, zystische Lungenläsionen, Exomphalos, gastroschisis). Nachwasser (AF) Zellen sind einfach von routinemäßig geplanten Prozeduren während des zweiten Trimesters der Schwangerschaft (dh Amniozentese und amnioreduction) oder Kaiserschnitte 1, 2 zu erhalten. Die Verfügbarkeit von AF - Zellen aus der pränatalen oder Neugeborenen Patienten bietet die Möglichkeit , diese Quelle für die regenerative Medizin und mehrere Forscher untersuchten die Möglichkeit , verschiedene Gewebeschäden oder Krankheiten zu behandeln , um eine Stammzellpopulation mit getrennt von AF 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. Die Möglichkeit, leicht AF-Zellen aus erkrankten Patienten erhalten wird, in einem Zeitfenster, in dem die Krankheit oft stationär ist, öffnet den Weg für die Idee der Verwendung dieser Zellquelle für eine Neuprogrammierung Zwecke. Tatsächlich induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) aus AF - Zellen abgeleiteten Zellen könnten für in vitro Drogentests oder für das Tissue Engineering Ansätze in den Zellen von Interesse unterschieden werden, um eine ausreichende patientenspezifischen Therapie vor der Geburt vorzubereiten. Viele Studien haben bereits die Fähigkeit der AF - Zellen nachgewiesen , in einem weiten Bereich von Zelltypen 13, 14, 15, 16, 17 und umprogrammiert zu unterscheiden </ sup>, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.

Seit der Entdeckung von Takahashi und Yamanaka 28 reprogrammierter somatischen Zellen durch die erzwungene Expression von vier Transkriptionsfaktoren (Oct4, Sox2, cMyc und Klf4) wurden Fortschritte auf dem Gebiet der Reprogrammierung gemacht. die verschiedenen Methoden unter Berücksichtigung, können wir zwischen viralen und nicht-viralen Methoden unterscheiden. Die erste erwartet, dass die Verwendung von viralen Vektoren (Retroviren und Lentiviren), die einen hohen Wirkungsgrad besitzen, aber in der Regel unvollständige silencing des retroviralen Transgen, sowohl mit der Folge einer teilweise umprogrammiert Zelllinie und das Risiko vonInsertionsmutagenese 29, 30, 31. Die nicht-virale Verfahren verwendet verschiedene Strategien: dh Plasmide, Vektoren, mRNA, Protein, Transposons. Die Ableitung von iPS-Zellen frei von transgenen Sequenzen zielt darauf ab, die potenziell schädlichen Auswirkungen von undichten Transgen-Expression und Insertionsmutagenese zu umgehen. Unter all den oben genannten nicht-viralen Strategien, die PiggyBac (PB) Transposon / Transposase System benötigt nur die invertierten terminalen Wiederholungen ein Transgen und eine transiente Expression der Transposase - Enzym flankieren 32 Insertion oder Exzision Ereignisse zu katalysieren. Der Vorteil in Transposons gegenüber anderen Verfahren für iPS Zellgeneration Verwendung ist die Möglichkeit des Erhalts vektorfreien iPS-Zellen mit einem nicht-viralen Vektor Ansatz, der die gleiche Effizienz von retroviralen Vektoren zeigt. Dies ist möglich durch die Spur-less Exzision des integrierten Transposons Codierung für die reprogramming Faktoren nach einer neuen transiente Expression der Transposase in den iPS - Zellen 33. Da PB in verschiedenen Zelltypen effizient 34, 35, 36, 37, ist besser geeignet für einen klinischen Ansatz bezüglich viraler Vektoren und erlaubt die Herstellung von xeno freien iPS - Zellen im Gegensatz zu derzeitigen Protokolle virale Produktion , die xenobiotischen verwenden Bedingungen wird dieses System verwendet iPS-Zellen aus Maus-AF zu erhalten.

Hier schlagen wir ein detailliertes Protokoll folgende bereits veröffentlichten Arbeiten die Herstellung von pluripotenten iPS - Klone zu zeigen , von der Maus AF - Zellen (iPS-AF - Zellen) 38.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem italienischen Gesetz. Murine AF-Proben wurden von schwangeren Mäusen bei 13,5 Tage nach coitum (DPC) von C57BL / 6-Tg (UBC-GFP) 30Scha / J-Mäuse genannt GFP geerntet.

1. Transposon Produktion

HINWEIS: Transposon-Expressionsvektoren wurden unter Verwendung von Standard-Klonierungsverfahren erzeugt. Die Plasmid-DNA für Maus AF-Zellen Transfektion wurde mit kommerziellen Kits bereit.

  1. Mischungs 10 ng der Plasmid-DNA mit 50 ul DH5a Bakterien in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Inkubieren Sie die Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis für 20 min.
  2. Hitzeschock bei 42 ° C für 40 sec.
  3. Legen Sie Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis für 2 min.
  4. Nach Eintragen von 250 & mgr; l vorgewärmtes (37 ° C) LB-Medium (LB) Brühe. Schütteln (300 rpm) bei 37 ° C für 30 min.
  5. Verbreiten 30 ul jeder Transformation auf LB-Platten mit 0,1 mg / ml Ampicillin. Platten erlauben zu trocknen und inkubieren bei 37 ° C ov invertierternight.
  6. Am nächsten Tag, am Nachmittag, Pick 3 Kolonien mit sterilen 200 ul-Tipps, von jeder Transformation und Übertragung auf 0,1 mg / ml LB amp.
  7. Schütteln (300 rpm) Bakterien über Nacht bei 37 ° C.
  8. Für Plasmidaufreinigung kommerzielle Kits verwenden. Stock Plasmiden bei -20 ° C.

2. Maus embryonale Fibroblasten (MEF) Kultur

  1. Die Beschichtung der 6-Well - Platten mit 0,1% Gelatine
    1. Coat Platten unter der Haube Zugabe von 1 ml steriler 0,1% Gelatine auf jede der sechs Bohrungen. Lassen Sie die Gelatine auf dem Inkubator (37 ° C) für 1 h polymerisieren.
    2. Entsorgen Sie das überschüssige, und trocknen Sie die Platten für 1 Stunde.
    3. Verwenden Parafilm abgedichtet und Speicherplatten bei Raumtemperatur.
  2. Die Inaktivierung von MEF mit Mitomycin C
    1. Tauen Sie ein Fläschchen mit 4 x 10 6 MEF - Zellen ein 37 ° C - Bad verwenden.
    2. Seed MEF in der Haube auf einer Petrischale (150 mm) mit MEF Medium.
    3. Kultivieren Zellen , bei 37 ° C und 5% CO 2.
    4. (Vorsicht) hinzufügen Mitomycin C (5 mg / ml), wenn die Zellen konfluent sind.
    5. Ortszellen in einen Inkubator (37 ° C und 5% CO 2) für 3 h.
    6. Entfernen Mittel mit Mitomycin C. Wasche die Zellen dreimal mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
    7. 2 ml der kommerziellen Trypsin und Ortszellen in das 37 ° C-Inkubator für 5 min. Nach dem Fügen Sie 18 ml Medium der Blockierung der Trypsin Reaktion zu stoppen.
    8. Zähle die Zellen mit einem Burker-Kammer unter Verwendung von nach dem Protokoll des Herstellers.
    9. Zentrifuge Zellen bei 145 xg für 5 min. Überstand verwerfen.
    10. Seed 60.000 Zellen / cm 2 von inaktivierten MEF auf 0,1% Gelatine beschichtete Platten.
    11. Kultivieren Zellen für 24 h bei 37 ° C und 5% CO 2, vor der Aussaat AF und / oder iPS-AF - Zellen.

3. Maus AF Zellisolierung

  1. Richten Sie timed Paarungen und prüfen vaginale plugs nach 24 h co-Gehäuse.
  2. Beachten Sie, bis 13,5 dpc und Opfer schwanger Damm durch Genickbruch.
  3. Reinigen Sie die Bauchdecke des Tieres unter Verwendung von 70% igem Ethanol.
  4. Mit einer Schere, führen Sie eine Mittellinie Laparotomie die Länge der Bauchdecke Einschneiden Zugang in die Bauchhöhle zu gewinnen.
  5. Setzen Sie die Gebärmutter mit einer Pinzette. Entfernen Sie die Gebärmutter Schere und Transfer in eine 100 mm Petrischale mit gefüllt mit sterilem 1x PBS auf Eis gestellt.
  6. Verwenden Sie ein Stereomikroskop die AF bei 10-facher Vergrößerung zu sammeln.
  7. Halten Sie die Gebärmutter mit einer Zange und entfernen Sie die Gebärmutterwand mit einer Schere. Seien Sie vorsichtig, um eine Beschädigung der fötalen Membranen und damit Fruchtwasser Leckage zu vermeiden.
  8. Sammeln Sie Föten in eine 100 mm Petrischale gefüllt mit sterilem 1x PBS und auf Eis.
  9. Fassen Sie die Plazenta eines Fötus mit einer feinen Spitze Zange und in einem sauberen 100 mm Petrischale.
  10. Entfernen Sie den Dottersack feinen Spitze einer Pinzette.
  11. Disrupt die Eihaut feinen Spitze einer Pinzette und für jeden Fötus 30 ul AF sammeln eine Insulin-Spritze in einem 15 ml konischen Fläschchen mit.
  12. Nach AF Sammlung, wasche jeden Fetus mit sterilem 1x PBS, ergänzt mit 1% fötalem Rinderserum (FBS) und zu sammeln in die 15 ml konischen Röhrchen die AF enthält.
  13. Zentrifuge AF bei 145 xg für 5 min. Entfernen Sie den Überstand unter der Haube und das Seeding von pelletierten AF-Zellen.

4. Maus AF Zellkultur

  1. Seeding von Maus - AF - Zellen
    1. Einen Tag vor der Aussaat vorbereiten eine 0,1% Gelatine beschichtete 6-Well-Platte mit Mitomycin C-behandelten MEF.
    2. Nach dem AF - Sammlung, Samen , die von einer Amniozentese gewonnenen Zellen auf die mitotisch inaktivierten MEF unter Verwendung von AF - Kulturmedium (etwa 1 x 10 7 Zellen aus 6 Föten gewonnen).
    3. Kultivieren Zellen , bei 37 ° C und 5% CO 2, Ändern des Mediums jeden zweiten Tag.
    4. Nach 7 Tagen Kultur, transfekt AF-Zellen nach dem unten beschriebenen Verfahren.

5. Transfektion, iPS-AF Zellgeneration und Kultur

HINWEIS: Mouse AF-Zellen wurden mit dem PB-tetO2-IRES-OKMS Transposon-Plasmid transfiziert, in Verbindung mit einem Transposase-Expressionsplasmid (mPBase) und mit dem Rückwärts Tetracyclin-Transaktivator (PB-CAG-rtTA) Transposon-Plasmid. Alle Plasmide wurden von Professor Andras Nagy 33 zur Verfügung gestellt.

  1. Mix 1 & mgr; g PB-tetO2-IRES-OKMS mit 0,5 ug mPBase und 0,5 & mgr; g PB-CAG-rtTA (Gesamt DNA: 2 & mgr; g) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
  2. Verdünne die DNA auf 100 & mgr; l mit serumfreiem Medium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium - DMEM).
  3. Aus 8 & mgr; l des Transfektionsreagenz (zB Fugene) (im Verhältnis von Plasmid - DNA: Transfektionsmittel von 2 & mgr; g (DNA) bis 8 & mgr; l Transfektionsmittel) in die 1,5 ml - Mikrozentrifugenröhrchen , das DNA.
  4. Inkubieren Transfektionsreagenz / DNA Gemisch 15 min bei Raumtemperatur.
  5. Tropfenweise 100 ul des Transfektionsreagenz / DNA-Gemisch pro Vertiefung einer 6-Well-Platte mit AF-Zellen der Maus und verteilen leicht schwenken, mit einem Gesamtvolumen von 2 ml / Vertiefung. Lassen Sie für 24 Stunden.
  6. Am Tag danach induzieren die Expression des Yamanaka Faktoren (Oct4, Klf4, cMyc, Sox2), indem die Zellen mit frischem iPS-AF-Medium mit 1,5 ug / ml Doxycyclin (2 ml Medium für jede Vertiefung) ergänzt Fütterung.
  7. Feed-Zellen jeden Tag, ohne Durchgang, mit frischen Dox-haltiges Medium (halten Zellen in Medien, ergänzt mit Doxycyclin, bis der Punkt 5.13).
  8. Beobachten Zellen innerhalb von 24 h für mCherry Expression und täglich für die Koloniebildung (Kolonien erscheinen typischerweise zwischen 20 und 30 Tage nach der Transfektion).
  9. Einen Tag vor der Kolonie Kommissionierung, bereiten eine 96-Well-Gewebekulturplatte mit Mitomycin C-behandelten MEF.
  10. Wählen Sie einzelne Kolonien in 50 ul Volumen usinga 200 ul Pipette, und übertragen sie nacheinander in eine 96-Well-Platte in den einzelnen Vertiefungen.
  11. Am Tag nach distanzieren jede Kolonie in einzelne Zellen von 50 & mgr; l des kommerziellen Trypsin Zugabe und für 5 min bei 37 ° C inkubiert.
  12. Pipette nach oben und unten die Kolonie aufzuschlüsseln.
  13. Transfer 50 ul des Trypsins das dissoziierte Kolonie in eine neue gut mit inaktivierten MEF auf einem 0,1% Gelatine 96 Well-Platte mit 100 & mgr; l frischem iPS-AF-Medium, ergänzt mit Doxycyclin gefüllt beschichtet enthält.
  14. Wenn die Zellen 60-70% Konfluenz erreichen, aufgeteilt in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte.
  15. Wenn die Zellen 60-70% Konfluenz erreichen, geteilt 1: 2 bis zwei Brunnen, eine mit Doxycyclin und das andere ohne Doxycyclin, um zu überprüfen, ob Kolonien auch in dem Zustand ohne Doxycyclin erscheinen.
  16. Weiter iPS-AF-Klone zu erhalten, Doxycyclin unabhängig, auf inaktivierten MEF in der iPS-AF Medium.
  17. Kultivieren Zellen , bei 37 ° C und 5% CO 2, CHtäglich Anging Medium.

6. Alkalische Phosphatase-Färbung

  1. Führen alkalischen Phosphatase-Färbung gemäß dem Protokoll des Herstellers, wenn es das Auftreten von Doxycyclin unabhängigen iPS-AF-Zellen ist.

7. Immunofluoreszenz

  1. Immer , wenn es das Auftreten von Doxycyclin unabhängigen iPS-AF - Zellen, 150.000 Zellen / cm 2 auf eine Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen mit inaktivierten MEF Samen und wachsen Zellen für 48 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2.
  2. (Vorsicht) Befestigen Sie die Zellen durch Zugabe von 300 & mgr; l pro Vertiefung von 4% Paraformaldehyd (PFA) für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
  3. Hinzufügen von 300 ul 0,1% NP-40-Zellen zu permeabilisieren.
  4. Spülen Sie die Zellen mit 300 ul 0,1% PBS-Tween 20.
  5. Hinzufügen von 300 & mgr; l Blockierungspuffer (10% Pferdeserum in 1x PBS) für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
  6. Verwenden Sie die folgenden primären Antikörper: Oct4 (1:80), Sox2 (1:80), Klf4 (1:80), Nanog (1:100) und SSEA1 (1:80). Verdünnte SSEA1 mit 1% Rinderserumalbumin (BSA), 10% normales Ziegenserum, 0,3 M Glycin in 0,1% PBS-Tween-20. Verdünne alle anderen Antikörper mit 10% Pferdeserum in 1x PBS.
  7. Antikörper über Nacht bei 4 ° C inkubieren.
  8. Spülen Sie mit 300 ul 0,1% PBS-Tween-20.
  9. Verwenden Sie die Sekundär in 10% Pferdeserum verdünnt Antikörper in 1x PBS: Alexa594-konjugierten Ziege-anti-Maus-IgG (1: 200), Alexa594-konjugierten Huhn anti-Ziege IgG (1: 200), Alexa594-konjugierten Huhn anti-Kaninchen-IgG (1: 200), Alexa568-konjugiertem Ziege-anti-Maus-IgM (1: 200). Inkubieren für 2 Stunden bei Raumtemperatur.
  10. Spülen Sie mit 1x PBS.
  11. Stain Kerne mit Hoechst-Lösung (1: 10.000) in 1x PBS.

8. In - vitro - Zelldifferenzierung

  1. hängenden Tropfen Embryoidkörpern (EVG) zu bilden, einzelne Tropfen (2000 Zellen / 20 ul) auf den Deckel der Petrischalen, mit dem Differenzierungsmedium kultivieren.
  2. Inkubieren Sie die Gerichte bei 37 ° Cund 5% CO 2 für 4 Tage.
  3. Übertragen EBs in 100 mm Bakterien-Grade-Gerichte in der Suspensionskultur für 3 Tage in Differenzierungsmedium.
  4. Platte EBs in 24-Well-Platten mit Basalmembranmatrix beschichtet (1:10 verdünnt in DMEM) für weitere 14 Tage.
  5. Für die Immunfluoreszenzanalysen verwenden primäre Antikörper: T (1: 100), αfp (1: 200) und Tubb3 (1: 500) 37.

9. In Vivo Teratoma Formation

  1. Injizieren von 100 & mgr; l 1x PBS , enthaltend 1 x 10 6 iPS-AF - Zellen in den Muskel der Hinterlauf von Rag2 - / - yc - / - Mäusen.
  2. Sacrifice Mäuse durch Genickbruch 6 Wochen nach der Zellinjektion.
  3. Entfernen Sie die Tumormassen, die sich durch ihre Größe von der hinteren Gliedmaßen der Mäuse für die folgenden Analysen.
  4. Schneiden Sie 7-10 um dicke Querschnitte des Isopentan gefrorenen Tumor unter Verwendung eines Kryostats.
  5. Für Hämatoxylin eind Eosin (HE) Stain:
    1. Fleck mit HE das Tumorgewebe Zusammensetzung zu bewerten, nach dem Protokoll des Herstellers.
  6. Für Immunperoxidase Stain:
    1. Fix Teratom Abschnitte mit 4% PFA für 15 min bei Raumtemperatur.
    2. Permeabilisieren mit 0,1% Triton X-100.
  7. Inkubieren mit den folgenden Antikörpern: Tubb3 (1: 100), αfp (1:50) und αSMA (1: 100) in 1x PBS in 1% BSA verdünnt. Inkubieren für 1 Stunde bei 37 ° C (für Tubb3) oder über Nacht bei 4 ° C (für die anderen Antikörper).
  8. Block-Peroxidase unter Verwendung von 100% Methanol für 20 min.
  9. Inkubieren für 45 min bei 37 ° C mit sekundären Antikörper anti-Maus-HRP-konjugiertem (1: 150).
  10. Spülen Sie mit 1x PBS.
  11. Inkubieren mit Peroxidase (HRP) -Substrat (siehe Materialien Table) für 5 min.
  12. Spülen mit Leitungswasser für 5 min.
  13. Fleck mit Hämatoxylin QS für 9 Sek.
  14. Spülen mit Leitungswasser.

10. RNA-Extraktion aus Zellen

  1. Verwenden Sie einen kommerziellen RNA-Extraktions-Kits gemäß der empfohlenen Protokoll des Herstellers.

11. RNA-Extraktion aus Teratoma

  1. Homogenisieren teratoma einen Stößel und Mörser und flüssigem Stickstoff unter Verwendung der Probe zu vermeiden Auftauen.
  2. Wiegen 25 mg Gewebe.
  3. 1 ml handelsüblicher Reagenzien zur RNA-Extraktion und 200 & mgr; l Chloroform.
  4. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min.
  5. Zentrifuge bei 13.000 xg und 4 ° C für 15 min.
  6. Übertragung der geklärte Überstand in ein neues Röhrchen.
  7. Zur Reinigung verwenden Sie die RNA eine kommerzielle RNA-Extraktions-Kits gemäß dem Protokoll des Herstellers.

12. Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion-Analyse

  1. Synthetisieren der Erststrang-cDNA, die eine reverse Transkriptase für die reverse Transkription (RT) -Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Oligo (dT) unter Verwendung according dem Protokoll des Herstellers, 50 ng / & mgr; l cDNA zu erhalten. Verdünnte cDNA mit RNase-freiem Wasser bei einer Konzentration von 10 ng / & mgr; l.
  2. Führen RT-PCR unter Verwendung der DNA-Polymerase nach Herstellerprotokoll unter Verwendung von 1 ng / & mgr; l cDNA.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Zur Auswertung wurden die Kapazität der Reprogrammierung, Maus AF-Zellen aus Föten von GFP-Mäusen gesammelt. Zellen wurden mit dem kreisförmigen Transposon-Plasmid PB-tetO2-IRES-OKMS, transfiziert, die die Yamanaka Faktoren (Oct4, Sox2, cMyc und Klf4) drückt auf die mCherry fluoreszierendes Protein gebunden in einer Doxycyclin-induzierbaren Weise und Tetracyclin-Transaktivator-reverse (PB- CAG-rtTA) Plasmide zusammen mit dem Transposaseexpression Plasmid (mPBase). Maus - AF - Zellen...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

Die gewählte Methode, die Induktion von Pluripotenz zu erhalten, ist relevant für die Zell klinische Sicherheit in Bezug auf langfristige Transplantation. Heutzutage gibt es mehrere Verfahren geeignet für die Umprogrammierung. Unter den nicht-integrative Verfahren wird die virale Sendai (SeV) Vektor ist ein RNA - Virus , das große Mengen an Protein 40 ohne die Integration in den Zellkern der infizierten Zellen produzieren kann und könnte eine Strategie sein , um iPS - Zellen erhalten. SeV-Ve...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

This work was supported by CARIPARO Foundation Grant number 13/04 and Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza Grant number 10/02. Martina Piccoli, Chiara Franzin and Michela Pozzobon are funded by Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza. Enrica Bertin is funded by CARIPARO Foundation Grant number 13/04. Paolo De Coppi is funded by Great Ormond Street Hospital Children's Charity.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm Bacterial-grade Petri Dishes BD Falcon351029For in vitro differentiation
2-mercaptoethanol SigmaM6250For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Alexa568-conjugated goat anti-mouse IgM Thermo Fisher ScientificA21043Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated chicken anti-goat IgG Thermo Fisher ScientificA21468Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated chicken anti-rabbit IgG Thermo Fisher ScientificA21442Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated goat anti-mouse IgG Thermo Fisher ScientificA11005Secondary antibody (immunofluorescence)
Alkaline Phosphatase kit Sigma85L1Alkaline Phosphatase  staining
AmpicillinSigmaA0166For bacterial selection
Bovine Serum Albumin SigmaA7906BSA, for blocking solution. Diluted in PBS 1x
ChloroformSigmaC2432For RNA extraction
DH5α cellsThermo Fisher Scientific18265-017Bacteria for cloning procedure
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific41965039For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Doxycycline SigmaD9891For exogenous factors expression
Microcentrifuge tubes (1.5 ml) Sarstedt 72.706For PB production 
ES FBS Thermo Fisher Scientific10439024For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
FBS Thermo Fisher Scientific10270106For MEF medium
Fine point forcepsF.S.TDumont #5 AF isolation
GelatinJ.T.Baker131Used 0.1%, diluted in PBS 1x
GlycineBio-Rad161-0718For blocking solution. Diluted in PBS 1x
Haematoxylin QSVector LaboratoriesH3404Nuclei detection
HE Bio-Optica04-061010Histological analysis of teratoma
Hoechst Thermo Fisher ScientificH3570Nuclei detection
Horse Serum Thermo Fisher Scientific16050-122For blocking solution
HRP-conjugated goat anti-mouse IgGSantaCruzsc2005Secondary antibody (immunoperoxidase)
ImmPACT NovaRED Vector LaboratoriesSK4805Peroxidase substrate
Insulin syringe with needle (25 G)TerumoSS+01H25161Amniocentesis procedure
Klf4 SantaCruzsc-20691Rabbit polyclonal IgG
L-glutamine Thermo Fisher Scientific25030For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
LB broth (Lennox)SigmaL3022For bacterial growth
LIF SigmaL5158For mouse AF and iPS-AF cells medium
Matrigel BD354234For in vitro differentiation. Diluted 1:10 in DMEM
MethanolSigma32213Peroxidase blocking
MULTIWELL 24 well plateBD Falcon353047For in vitro differentiation
MULTIWELL 6 well plateBD Falcon353046For MEF, mouse AF and iPS-AF cells culture
Nanog ReproCELLRCAB0002P-FRabbit polyclonal IgG
Non-essential amino acids SigmaM7145For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Normal Goat SerumVector LaboratoriesS2000For blocking solution. Diluted in PBS 1x
NP-40Sigma12087-87-0For cell permeabilization. Diluted in PBS 1x
Oct4SantaCruzsc-5279Mouse monoclonal IgG2b
Oligo (dT) Thermo Fisher Scientific18418012For RT-PCR
Paraformaldehyde (solution)Sigma441244PFA, fixative, diluted in PBS
PBS 10xThermo Fisher Scientific14200-067D-PBS, free of Ca2+/Mg2+. Diluted with sterile water to obtain PBS 1x
Penicillin - Streptomycin Thermo Fisher Scientific15070063For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Petri Dish (150 mm)BD Falcon353025For MEF culture, tissue culture
PiggyBac transposase expression plasmid Provided by professor Andras Nagy laboratory-mPBase
PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS transposon plasmidProvided by professor Andras Nagy laboratory-PB-tetO2-IRES-OKMS
QIAprep Spin Maxiprep KitQiagen12663For plasmids purification
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106For plasmids purification
Reverse tetracycline transactivator transposon plasmid Provided by professor Andras Nagy laboratory-rtTA
RNeasy Mini Kit Qiagen74134For RNA extraction
Sox2 SantaCruzsc-17320Goat polyclonal IgG
SSEA1 Abcamab16285Mouse monoclonal IgM
SuperScript II Reverse Transcriptase Thermo Fisher Scientific18064-014For RT-PCR
T Abcamab20680Rabbit polyclonal IgG
Taq DNA PolymeraseThermo Fisher Scientific10342020PCR
Trypsin Thermo Fisher Scientific25300-054Cell culture passaging
Triton X-100Bio-Rad161-047For cell permeabilization, diluted in PBS 1x
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific15596-026For RNA extraction
Tubb3  Promega G712AMouse monoclonal IgG1
TWEEN-20SigmaP1379For cell permeabilization, diluted in PBS 1x
αfp   R&D SystemsMAB1368Mouse Monoclonal IgG1
αSMA Abcamab7817Mouse Monoclonal IgG2a
Transfection Reagent (FuGENE HD)Promega E2311For AF cells transfection
StereomicroscopeNikonSM2645To perform amniocentesis 
200 μl tipsSarstedt 70.760012To pick bacteria colonies
ScissorF.S.T14094-11 stainless 25UTo perform amniocentesis 
EthanolSigma2860To clean the abdominal wall of the pregnant dam
Tissue culture petri dish (150 mm) BD Falcon353025For MEF expansion
Mitomycin CSigmaM4287-2MGFor MEF inactivation
MULTIWELL 96 well plateBD Falcon353071For iPS-AF culture

Referenzen

  1. You, Q., et al. Isolation of human mesenchymal stem cells from third-trimester amniotic fluid. Int J Gynaecol Obstet. 103 (2), 149-152 (2008).
  2. Prusa, A. R., Hengstschlager, M. Amniotic fluid cells and human stem cell research: a new connection. Med Sci Monit. 8 (11), RA253-RA257 (2002).
  3. Ditadi, A., et al. Human and murine amniotic fluid c-Kit+ Lin- cells display hematopoietic activity. Blood. 113 (17), 3953-3960 (2009).
  4. Piccoli, M., et al. Amniotic fluid stem cells restore the muscle cell niche in a HSA-Cre, Smn(F7/F7) mouse model. Stem Cells. 30 (8), 1675-1684 (2012).
  5. Zani, A., et al. Amniotic fluid stem cells improve survival and enhance repair of damaged intestine in necrotising enterocolitis via a COX-2 dependent mechanism. Gut. 63 (2), 300-309 (2014).
  6. Rota, C., et al. Human amniotic fluid stem cell preconditioning improves their regenerative potential. Stem Cells Dev. 21 (11), 1911-1923 (2012).
  7. Mirabella, T., et al. Pro-angiogenic soluble factors from Amniotic Fluid Stem Cells mediate the recruitment of endothelial progenitors in a model of ischemic fasciocutaneous flap. Stem Cells Dev. 21 (12), 2179-2188 (2012).
  8. Mirabella, T., Cili, M., Carlone, S., Cancedda, R., Gentili, C. Amniotic liquid derived stem cells as reservoir of secreted angiogenic factors capable of stimulating neo-arteriogenesis in an ischemic model. Biomaterials. 32 (15), 3689-3699 (2011).
  9. Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
  10. Kim, J. A., et al. MYOD mediates skeletal myogenic differentiation of human amniotic fluid stem cells and regeneration of muscle injury. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 147(2013).
  11. Vadasz, S., et al. Second and third trimester amniotic fluid mesenchymal stem cells can repopulate a de-cellularized lung scaffold and express lung markers. J Pediatr Surg. 49 (11), 1554-1563 (2014).
  12. Turner, C. G., et al. Preclinical regulatory validation of an engineered diaphragmatic tendon made with amniotic mesenchymal stem cells. J Pediatr Surg. 46 (1), 57-61 (2011).
  13. Galende, E., et al. Amniotic Fluid Cells Are More Efficiently Reprogrammed to Pluripotency Than Adult Cells. Cloning Stem Cells. 12 (2), 117-125 (2009).
  14. Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Hum Mol Genet. 18 (22), 4340-4349 (2009).
  15. Ye, L., et al. Induced pluripotent stem cells offer new approach to therapy in thalassemia and sickle cell anemia and option in prenatal diagnosis in genetic diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (24), 9826-9830 (2009).
  16. Wolfrum, K., et al. The LARGE Principle of Cellular Reprogramming: Lost, Acquired and Retained Gene Expression in Foreskin and Amniotic Fluid-Derived Human iPS Cells. PLoS ONE. 5 (10), 137-138 (2010).
  17. Ye, L., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using site-specific integration with phage integrase. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19467-19472 (2010).
  18. Lu, H. E., et al. Selection of alkaline phosphatase-positive induced pluripotent stem cells from human amniotic fluid-derived cells by feeder-free system. Exp Cell Res. 317 (13), 1895-1903 (2011).
  19. Lu, H. E., et al. Modeling Neurogenesis Impairment in Down Syndrome with Induced Pluripotent Stem Cells from Trisomy 21 Amniotic Fluid Cells. Exp Cell Res. 319 (4), 498-505 (2012).
  20. Kobari, L., et al. Human induced pluripotent stem cells can reach complete terminal maturation: in vivo and in vitro evidence in the erythropoietic differentiation model. Haematologica. 97 (12), 1795-1803 (2012).
  21. Li, Q., Fan, Y., Sun, X., Yu, Y. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Amniotic Fluid Cells by Reprogramming with Two Factors in Feeder-free Conditions. J Reprod Dev. 59 (1), 72-77 (2012).
  22. Fan, Y., Luo, Y., Chen, X., Li, Q., Sun, X. Generation of Human β-thalassemia Induced Pluripotent Stem Cells from Amniotic Fluid Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette. J Reprod Dev. 58 (4), 404-409 (2012).
  23. Liu, T., et al. High efficiency of reprogramming CD34+ cells derived from human amniotic fluid into induced pluripotent stem cells with Oct4. Stem Cells Dev. 21 (12), 2322-2332 (2012).
  24. Jiang, G., et al. Human transgene-free amniotic-fluid-derived induced pluripotent stem cells for autologous cell therapy. Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).
  25. Drozd, A. M., et al. Generation of human iPSC from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system. Stem Cell Res Ther. 6 (122), (2015).
  26. Moschidou, D., et al. Human mid-trimester amniotic fluid stem cells cultured under embryonic stem cell conditions with Valproic acid acquire pluripotent characteristics. Stem Cells Dev. 22 (3), 444-458 (2012).
  27. Moschidou, D., et al. Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach. Mol Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).
  28. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  29. Mikkelsen, T. S., et al. Dissecting direct reprogramming through integrative genomic analysis. Nature. 454 (7200), 49-55 (2008).
  30. Sridharan, R., et al. Role of the murine reprogramming factors in the induction of pluripotency. Cell. 136 (2), 364-377 (2009).
  31. Knight, S., Collins, M., Takeuchi, Y. Insertional mutagenesis by retroviral vectors: current concepts and methods of analysis. Curr Gene Ther. 13 (3), 211-227 (2013).
  32. Fraser, M. J., Ciszczon, T., Elick, T., Bauser, C. Precise excision of TTAA-specific lepidopteran transposons piggyBac (IFP2) and tagalong (TFP3) from the baculovirus genome in cell lines from two species of Lepidoptera. Insect Mol Biol. 5 (2), 141-151 (1996).
  33. Woltjen, K., Kim, S. I., Nagy, A. The PiggyBac Transposon as a Platform Technology for Somatic Cell Reprogramming Studies in Mouse. Methods Mol Biol. 1357, 1-22 (2015).
  34. Wu, S. C., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (41), 15008-15013 (2006).
  35. Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
  36. Wang, W., et al. Chromosomal transposition of PiggyBac in mouse embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27), 9290-9295 (2008).
  37. Cadiñanos, J., Bradley, A. Generation of an inducible and optimized PiggyBac transposon system. Nucleic Acids Res. 35 (12), e87(2007).
  38. Bertin, E., et al. Reprogramming of mouse amniotic fluid cells using a PiggyBac transposon system. Stem Cell Research. 15 (3), 510-513 (2015).
  39. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  40. Fusaki, N., et al. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
  41. Nishishita, N., et al. Generation of virus-free induced pluripotent stem cell clones on a synthetic matrix via a single cell subcloning in the naive state. PLoS One. 7 (9), e38389(2012).
  42. Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PLoS One. 7 (8), e42855(2012).
  43. Yant, S. R., et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Mol Cell Biol. 25 (6), 2085-2094 (2005).
  44. Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. PiggyBac transposon-mediated gene transfer in human cells. Mol Ther. 15 (1), 139-145 (2007).
  45. Galvan, D. L., et al. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J Immunother. 32 (8), 837-844 (2009).
  46. Huang, X., et al. Gene transfer efficiency and genome-wide integration profiling of Sleeping Beauty, Tol2, and piggyBac transposons in human primary T cells. Mol Ther. 18 (10), 1803-1813 (2010).
  47. Meir, Y. J., et al. Genome-wide target profiling of PiggyBac and Tol2 in HEK 293: pros and cons for gene discovery and gene therapy. BMC Biotechnol. 11 (28), (2011).
  48. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  49. Filareto, A., et al. An ex vivo gene therapy approach to treat muscular dystrophy using inducible pluripotent stem cells. Nat Commun. 4 (1549), (2013).
  50. Darabi, R., et al. Human ES- and iPS-derived myogenic progenitors restore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophic mice. Cell Stem Cell. 10 (5), 610-619 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Weitere Artikel entdecken

EntwicklungsbiologieHeft 120Nachwasser Zelleninduzierte pluripotente StammzellenPiggyBac Transposonregenerative MedizinNeuprogrammierungMaus

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Kontakt

BIBLIOTHEKS-EMPFEHLUNG

JoVE-Newsletter

Forschung

Lehre

Autoren

Bibliothekare

ÜBER JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten