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Resumen

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

Resumen

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

Introducción

El diagnóstico prenatal es una importante herramienta clínica para evaluar enfermedades genéticas (es decir, aberraciones cromosómicas, enfermedades monogénicas o poligenéticos / multifactorial) y malformaciones congénitas (hernia diafragmática congénita es decir, lesiones pulmonares quísticas, onfalocele, gastrosquisis). El líquido amniótico (AF) las células son fáciles de obtener de forma rutinaria los procedimientos programados durante el segundo trimestre del embarazo (es decir, la amniocentesis y amniorreducción) o cesáreas 1, 2. La disponibilidad de las células AF de pacientes prenatales o neonatales ofrece la posibilidad de utilizar esta fuente para la medicina regenerativa, y varios investigadores investigó la posibilidad de tratar diferentes daños de tejidos o enfermedades utilizando una población de células madre aisladas de AF 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. La posibilidad de obtener fácilmente células AF de pacientes enfermos, en una ventana de tiempo en el que la enfermedad es a menudo estacionario, abre el camino a la idea de utilizar esta fuente de células para los propósitos de reprogramación. De hecho, las células madre pluripotentes inducidas (iPS) derivadas de células AF podrían diferenciarse en las células de interés para las pruebas de fármacos in vitro o para los enfoques de ingeniería de tejidos, con el fin de preparar una terapia adecuada específica del paciente antes del parto. Muchos estudios ya han demostrado la capacidad de las células AF para ser reprogramado y diferenciarse en una amplia gama de tipos de células 13, 14, 15, 16, 17 </ sup>, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.

Desde el descubrimiento por Takahashi y Yamanaka 28 de células somáticas reprogramadas a través de la expresión forzada de cuatro factores de transcripción (Oct4, Sox2, Klf4 y CMYC), se han hecho progresos en el campo de la reprogramación. Teniendo en cuenta los diferentes métodos, podemos distinguir entre los enfoques virales y no virales. La primera espera que el uso de vectores virales (retrovirus y lentivirus), que tienen una alta eficiencia, pero silenciamiento generalmente incompleta del transgén retroviral, tanto con la consecuencia de una línea de células parcialmente reprogramado y el riesgo demutagénesis por inserción 29, 30, 31. El método no viral utiliza diferentes estrategias: es decir, plásmidos, vectores, ARNm, proteínas, transposones. La derivación de células iPS libres de secuencias transgénicas pretende eludir los efectos potencialmente nocivos de la expresión del transgen con fugas y la mutagénesis por inserción. Entre todas las estrategias no virales mencionados anteriormente, el sistema de transposón / transposasa PiggyBac (PB) requiere sólo las repeticiones terminales invertidas que flanquean un transgén y la expresión transitoria de la enzima transposasa para catalizar eventos de inserción o de escisión 32. La ventaja en el uso de transposones sobre otros métodos para la generación de células iPS es la posibilidad de obtener células iPS libre de vectores con un enfoque de vector no viral que muestra la misma eficacia de los vectores retrovirales. Esto es posible mediante escisión trace-menos de la codificación transposón integrado para la reprogramming siguientes factores de una nueva expresión transitoria de la transposasa en las células iPS 33. Dado que PB es eficiente en diferentes tipos de células 34, 35, 36, 37, es más adecuado para un enfoque clínico con respecto a los vectores virales, y permite la producción de células iPS sin xeno contrario a protocolos de producción virales actuales que utilizan xenobiótico condiciones, este sistema se utiliza para obtener células iPS a partir murino AF.

Aquí proponemos un protocolo detallado siguientes trabajos ya publicados para mostrar la producción de iPS a partir de células pluripotentes clones AF de ratón (células iPS-AF) 38.

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Protocolo

Todos los procedimientos fueron realizados de acuerdo con la ley italiana. muestras murino AF fueron cosechadas de los ratones gestantes en 13,5 días postcoital (DPC) de ratones C57BL / 6 ratones Tg (UBC-GFP) 30Scha / J llamada GFP.

Producción 1. transposón

NOTA: los vectores de expresión de transposones se generaron utilizando procedimientos de clonación estándar. El ADN plásmido para ratón AF células transfección se preparó usando kits comerciales.

  1. Mezclar 10 ng de ADN de plásmido con 50 l de bacterias DH5a en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Incubar el tubo de microcentrífuga en hielo durante 20 min.
  2. choque térmico a 42 ° C durante 40 segundos.
  3. Coloque el tubo de microcentrífuga en hielo durante 2 min.
  4. Añadir 250 l de caldo de caldo de lysogeny (LB) precalentado (37 ° C). Agitar (300 rpm) a 37 ° C durante 30 min.
  5. Spread 30 l de cada transformación sobre placas LB con 0,1 mg / ml de ampicilina. Permita que las placas se sequen y se incuban invertidas a 37 ° C overnight.
  6. Al día siguiente, por la tarde, Pick 3 colonias, utilizando puntas estériles de 200 l, de cada transformación y transferencia a 0,1 mg / ml de LB amp.
  7. Agitar bacterias (300 rpm) durante la noche a 37 ° C.
  8. Para la purificación de plásmido utilizar kits comerciales. plásmidos de archivo a -20 ° C.

2. fibroblastos de embriones de ratón (MEF) Cultura

  1. El recubrimiento de las placas de 6 pocillos con 0,1% de gelatina
    1. recubrir placas bajo el capó adición de 1 ml de gelatina estéril al 0,1% a cada uno de los seis pozos. Deje que la gelatina se polimeriza en la incubadora (37 ° C) durante 1 hora.
    2. Desechar el exceso, y secar las placas durante 1 hora.
    3. Use parafina para sellar y las placas, almacenarlas a temperatura ambiente.
  2. La inactivación de MEF con mitomicina C
    1. Descongelar un vial de 4 x 10 6 células MEF utilizando un baño de 37 ° C.
    2. Semillas MEF en la campana en una placa de Petri (150 mm) con medio de MEF.
    3. Cultivar las células a 37 ° C y 5% de CO2.
    4. (Precaución) Añadir mitomicina C (5 mg / ml) cuando las células son confluentes.
    5. Células de lugar en una incubadora (37 ° C y 5% de CO2) durante 3 h.
    6. Retire medio con células mitomicina C. Lavar tres veces con solución salina tampón fosfato 1x (PBS).
    7. Añadir 2 ml de las células con tripsina y local comercial en el incubador a 37ºC durante 5 min. Después, añadir 18 ml de medio de bloqueo para detener la reacción con tripsina.
    8. Contar las células utilizando una cámara Burker de acuerdo con el protocolo del fabricante.
    9. centrifugar las células a 145 xg durante 5 min. Descartar el sobrenadante.
    10. Seed 60.000 células / cm 2 de inactivada MEF sobre placas recubiertas de gelatina 0,1%.
    11. Cultivar las células durante 24 horas a 37 ° C y CO 2 al 5%, antes de la siembra AF y / o células iPS-AF.

3. aislamiento de células de ratón AF

  1. Configurar y comprobar los apareamientos programados PLU vaginalgs después de 24 h de co-vivienda.
  2. Observe hasta 13,5 dpc y sacrificar presa embarazada a través de la dislocación cervical.
  3. Limpiar la pared abdominal del animal usando 70% de etanol.
  4. Con unas tijeras, realizar una incisión de laparotomía media la longitud de la pared abdominal para acceder a la cavidad abdominal.
  5. Exponer el útero con unas pinzas. Quitar el útero utilizando tijeras y transferencia en una placa de Petri de 100 mm lleno de PBS estéril 1x colocó en hielo.
  6. Utilizar un microscopio estereoscópico para recoger el AF a un aumento de 10X.
  7. Sostener el útero con una pinza y quitar la pared uterina con unas tijeras. Tenga cuidado para evitar cualquier daño a las membranas fetales y la consiguiente pérdida de líquido amniótico.
  8. Recoger los fetos en una placa de Petri de 100 mm estéril lleno de 1x PBS y colocar en hielo.
  9. Agarre la placenta de un feto con una pinza de punta fina y colocar en un recipiente limpio 100 mm placa de Petri.
  10. Retire el saco vitelino con unas pinzas de punta fina.
  11. perturbar el amnios con unas pinzas de punta fina y recoger 30 l de AF para cada feto usando una jeringa de insulina en un vial cónico de 15 ml.
  12. Después de la recogida AF, lavar cada feto con estéril 1x PBS suplementado con suero de 1% de bovino fetal (FBS) y recoger en los 15 ml tubo cónico que contiene el AF.
  13. Centrifugar AF a 145 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante bajo el capó y sembrar las células sedimentadas AF.

4. ratón AF cultivo celular

  1. Siembra de células de ratón AF
    1. Un día antes de la siembra, preparar una placa de 6 pocillos recubierta con gelatina 0,1% con MEF tratado con mitomicina C.
    2. Después de la recogida de AF, sembrar las células obtenidas de una amniocentesis (alrededor de 1 x 10 7 células obtenidas de fetos 6) sobre el mitóticamente inactivados MEF utilizando medio de cultivo AF.
    3. Cultivar las células a 37 ° C y 5% de CO 2, cambiando el medio cada dos días.
    4. Después de 7 días de cultivo, transfect células AF siguiendo el procedimiento descrito a continuación.

5. La transfección, la generación de células iPS-AF y Cultura

NOTA: células de ratón AF se transfectaron con el plásmido de transposón PB-tetO2-IRES-OKMS, en conjunción con un plásmido de expresión de la transposasa (mPBase) y con el transactivador de tetraciclina inversa plásmido transposón (PB-CAG-rtTA). Todos los plásmidos fueron proporcionados por el profesor Andras Nagy 33.

  1. Mezclar 1 g de PB-tetO2-IRES-OKMS con 0,5 g de mPBase y 0,5 g de PB-CAG-rtTA (ADN total: 2 g) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  2. Diluir el ADN a 100 l con medio libre de suero (de Eagle modificado por Dulbecco - DMEM).
  3. Añadir 8 l de la reactivo de transfección (por ejemplo, FUGENE) (en la proporción de ADN plasmídico: agente de transfección de 2 g (ADN) a agente de transfección 8 l) en el ADN que contiene 1,5 ml tubo de microcentrífuga.
  4. Incubar la transfección mezcla de reactivos / ADN durante 15 min a temperatura ambiente.
  5. Añadir gota a gota 100 l de la mezcla de reactivo de transfección / DNA por pocillo a una placa de 6 pocillos con células AF ratón y distribuir por agitación suave, con un volumen final de 2 ml / pocillo. Dejar durante 24 h.
  6. El día después, inducir la expresión de factores de la Yamanaka (Oct4, Klf4 cMyc, Sox2) por la alimentación de las células con medio fresco iPS-AF suplementado con 1,5 g / ml de doxiciclina (2 ml de medio para cada pocillo).
  7. Alimentar a las células de todos los días, sin paso, en un medio con dox fresca (mantener las células en medios suplementados con doxiciclina hasta el punto 5.13).
  8. Observar las células dentro de las 24 h para la expresión mCherry y diariamente durante la formación de colonias (colonias aparecen típicamente entre 20 y 30 días después de la transfección).
  9. Un día antes de la recolección de colonia, preparar una placa de cultivo tisular de 96 pocillos con MEF tratado con mitomicina C.
  10. Recoger colonias individuales en 50 l de volumen usinga 200 pipeta l, y transferir de forma secuencial en una placa de 96 pocillos en pocillos individuales.
  11. El día después, se disocian todas las colonias en células individuales mediante la adición de 50 l de la tripsina comercial e incubar durante 5 min a 37 ° C.
  12. Pipetear arriba y abajo para desagregar la colonia.
  13. Transferencia de 50 l de la tripsina que contiene la colonia disociada en un nuevo bien con inactivada MEF en una gelatina 0,1% recubierto de 96 pocillos de la placa llena con 100 l de medio fresco iPS-AF suplementado con doxiciclina.
  14. Cuando las células alcanzan el 60-70% de confluencia, se dividió en un pocillo de una placa de 24 pocillos.
  15. Cuando las células alcanzan el 60-70% de confluencia, se dividió 1: 2 a dos pocillos, uno con doxiciclina y la otra sin doxiciclina, para verificar si las colonias aparecen también en la condición sin doxiciclina.
  16. Seguir manteniendo clones iPS-AF, doxiciclina independiente, en inactivada MEF en el medio IPS-AF.
  17. Cultivar las células a 37 ° C y 5% de CO 2, CHAnging medio diario.

6. La tinción de fosfatasa alcalina

  1. Realizar tinción de fosfatasa alcalina siguiendo el protocolo del fabricante cuando se produzca la aparición de células iPS-AF independientes doxiciclina.

7. La inmunofluorescencia

  1. Siempre que se produzca la aparición de células iPS independientes doxiciclina-AF, sembrar 150.000 células / cm2 en un pocillo de una placa de 24 pocillos con inactivada MEF, y hacer crecer las células durante 48 horas a 37 ° C y 5% de CO2.
  2. (Precaución) fijar las células mediante la adición de 300 l por pocillo de 4% de paraformaldehído (PFA) durante 15 min a temperatura ambiente.
  3. Añadir 300 l de 0,1% de células para permeabilizar NP-40.
  4. Enjuagar las células con 300 l de 0,1% PBS-Tween 20.
  5. Añadir 300 l de tampón de bloqueo de la (10% de suero de caballo en 1x PBS) durante 1 hr a temperatura ambiente.
  6. Utilice los siguientes anticuerpos primarios: Oct4 (1:80), Sox2 (1:80), Klf4 (1:80), Nanog (1:100) y SSEA1 (1:80). Diluir SSEA1 con 1% de albúmina de suero bovino (BSA), suero de cabra normal al 10%, 0,3 M de glicina en 0,1% PBS-Tween-20. Diluir todos los otros anticuerpos con 10% de suero de caballo en 1x PBS.
  7. Se incuban los anticuerpos durante la noche a 4 ° C.
  8. Enjuague con 300 l de 0,1% PBS-Tween-20.
  9. Usa los anticuerpos secundarios diluidos en suero de caballo al 10% en 1 x PBS: cabra Alexa594-conjugado anti-IgG de ratón (1: 200), Alexa594-conjugado IgG de pollo anti-cabra (1: 200), Alexa594 conjugado de pollo anti-IgG de conejo (1: 200), de cabra conjugado con Alexa568 anti-IgM de ratón (1: 200). Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente.
  10. Enjuague con 1x PBS.
  11. núcleos de tinción con solución de Hoechst (1: 10.000) en 1x PBS.

8. En Vitro Diferenciación Celular

  1. Para formar gota colgante cuerpos embrioides (EBS), cultivar las gotas individuales (2.000 células / 20 l) sobre la tapa de las placas Petri, con el medio de diferenciación.
  2. Incubar las placas a 37 ° Cy 5% de CO2 durante 4 días.
  3. Transferir los EB en 100 mm platos bacteriana grado en el cultivo en suspensión durante 3 días en medio de diferenciación.
  4. EBs de placas en placas de 24 pocillos recubiertas con matriz de membrana basal (diluido 1:10 en DMEM) durante otros 14 días.
  5. Para los análisis de inmunofluorescencia, utilizar anticuerpos primarios: T (1: 100), αfp (1: 200) y Tubb3 (1: 500) 37.

Formación 9. En Vivo Teratoma

  1. Se inyectan 100 l de 1x PBS que contenía 1 x 10 6 células iPS-AF en el músculo de la extremidad posterior de Rag2 - / -? C - / - ratones.
  2. Sacrificar los ratones mediante dislocación cervical 6 semanas después de la inyección de células.
  3. Retire las masas tumorales, que se distinguen por su tamaño, de la extremidad posterior de los ratones durante los siguientes análisis.
  4. Cortar 7-10 micras secciones transversales de espesor del tumor isopentano-congelado usando un criostato.
  5. Para una Haematoxylind eosina (HE) de la mancha:
    1. Manchar con HE para evaluar la composición del tejido tumoral, siguiendo el protocolo del fabricante.
  6. Para las manchas de inmunoperoxidasa:
    1. Fijar secciones teratoma con 4% PFA durante 15 min a temperatura ambiente.
    2. Permeabilizar con 0,1% Triton X-100.
  7. Incubar con los siguientes anticuerpos: Tubb3 (1: 100), αfp (01:50) y αSMA (1: 100) diluido en 1% de BSA en PBS 1x. Incubar durante 1 hora a 37 ° C (para Tubb3) o durante la noche a 4 ° C (para los otros anticuerpos).
  8. peroxidasa bloque usando 100% de metanol durante 20 min.
  9. Incubar durante 45 min a 37 ° C con el anticuerpo secundario conjugado con HRP (1: 150) anti-ratón.
  10. Enjuague con 1x PBS.
  11. Incubar con peroxidasa sustrato (HRP) (ver Materiales Tabla) durante 5 min.
  12. Enjuague con agua del grifo durante 5 minutos.
  13. Teñir con hematoxilina QS durante 9 s.
  14. Enjuague con agua del grifo.

10. Extracción de ARN a partir de células

  1. Utilice un kit de extracción de ARN comercial de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante.

11. La extracción de RNA de teratoma

  1. Homogeneizar el teratoma usando una mano de mortero y mortero y nitrógeno líquido para evitar la descongelación de la muestra.
  2. Pesar 25 mg de tejido.
  3. Añadir 1 ml de reactivo comercial para la extracción de RNA y 200 l de cloroformo.
  4. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
  5. Centrifugar a 13.000 xg y 4 ° C durante 15 min.
  6. Transferir el sobrenadante aclarado a un tubo nuevo.
  7. Para purificar el RNA utilizar un kit de extracción de ARN comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Análisis de la reacción en cadena de la polimerasa 12. Reverse Transcription

  1. Sintetizar la primera hebra de ADNc utilizando una transcriptasa inversa para la transcripción inversa (RT) reacción en cadena de polimerasa (PCR) y oligo accor (dT)ding con el protocolo del fabricante, para obtener 50 ng / l de cDNA. Diluir cDNA con agua libre de RNasa a una concentración de 10 ng / mL.
  2. Realizar RT-PCR utilizando la polimerasa de ADN de acuerdo con el protocolo del fabricante, utilizando 1 ng / l de cDNA.

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Resultados

Para evaluar la capacidad de la reprogramación, se recogieron las células de ratón AF de fetos de ratones GFP. Las células fueron transfectadas con el plásmido de transposón circular PB-tetO2-IRES-OKMS, que expresa los factores Yamanaka (Oct4, Sox2, Klf4 y cmyc) vinculados a la proteína fluorescente mCherry de una manera inducible por doxiciclina, y revertir transactivador de tetraciclina (PB- CAG-rtTA) plásmidos junto con el plásmido de expresión de la transposasa (mPBase). C?...

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Discusión

El método elegido para obtener la inducción de la pluripotencia es relevante para la seguridad clínica de células con respecto al trasplante a largo plazo. Hoy en día, existen varios métodos adecuados para la reprogramación. Entre los métodos no integrativos, la viral (SEV) vector Sendai es un virus de ARN que pueden producir grandes cantidades de proteína sin integrar en el núcleo de las células infectadas 40 y podría ser una estrategia para obtener células iPS. vectores SeV podría...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

This work was supported by CARIPARO Foundation Grant number 13/04 and Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza Grant number 10/02. Martina Piccoli, Chiara Franzin and Michela Pozzobon are funded by Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza. Enrica Bertin is funded by CARIPARO Foundation Grant number 13/04. Paolo De Coppi is funded by Great Ormond Street Hospital Children's Charity.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm Bacterial-grade Petri Dishes BD Falcon351029For in vitro differentiation
2-mercaptoethanol SigmaM6250For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Alexa568-conjugated goat anti-mouse IgM Thermo Fisher ScientificA21043Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated chicken anti-goat IgG Thermo Fisher ScientificA21468Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated chicken anti-rabbit IgG Thermo Fisher ScientificA21442Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated goat anti-mouse IgG Thermo Fisher ScientificA11005Secondary antibody (immunofluorescence)
Alkaline Phosphatase kit Sigma85L1Alkaline Phosphatase  staining
AmpicillinSigmaA0166For bacterial selection
Bovine Serum Albumin SigmaA7906BSA, for blocking solution. Diluted in PBS 1x
ChloroformSigmaC2432For RNA extraction
DH5α cellsThermo Fisher Scientific18265-017Bacteria for cloning procedure
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific41965039For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Doxycycline SigmaD9891For exogenous factors expression
Microcentrifuge tubes (1.5 ml) Sarstedt 72.706For PB production 
ES FBS Thermo Fisher Scientific10439024For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
FBS Thermo Fisher Scientific10270106For MEF medium
Fine point forcepsF.S.TDumont #5 AF isolation
GelatinJ.T.Baker131Used 0.1%, diluted in PBS 1x
GlycineBio-Rad161-0718For blocking solution. Diluted in PBS 1x
Haematoxylin QSVector LaboratoriesH3404Nuclei detection
HE Bio-Optica04-061010Histological analysis of teratoma
Hoechst Thermo Fisher ScientificH3570Nuclei detection
Horse Serum Thermo Fisher Scientific16050-122For blocking solution
HRP-conjugated goat anti-mouse IgGSantaCruzsc2005Secondary antibody (immunoperoxidase)
ImmPACT NovaRED Vector LaboratoriesSK4805Peroxidase substrate
Insulin syringe with needle (25 G)TerumoSS+01H25161Amniocentesis procedure
Klf4 SantaCruzsc-20691Rabbit polyclonal IgG
L-glutamine Thermo Fisher Scientific25030For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
LB broth (Lennox)SigmaL3022For bacterial growth
LIF SigmaL5158For mouse AF and iPS-AF cells medium
Matrigel BD354234For in vitro differentiation. Diluted 1:10 in DMEM
MethanolSigma32213Peroxidase blocking
MULTIWELL 24 well plateBD Falcon353047For in vitro differentiation
MULTIWELL 6 well plateBD Falcon353046For MEF, mouse AF and iPS-AF cells culture
Nanog ReproCELLRCAB0002P-FRabbit polyclonal IgG
Non-essential amino acids SigmaM7145For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Normal Goat SerumVector LaboratoriesS2000For blocking solution. Diluted in PBS 1x
NP-40Sigma12087-87-0For cell permeabilization. Diluted in PBS 1x
Oct4SantaCruzsc-5279Mouse monoclonal IgG2b
Oligo (dT) Thermo Fisher Scientific18418012For RT-PCR
Paraformaldehyde (solution)Sigma441244PFA, fixative, diluted in PBS
PBS 10xThermo Fisher Scientific14200-067D-PBS, free of Ca2+/Mg2+. Diluted with sterile water to obtain PBS 1x
Penicillin - Streptomycin Thermo Fisher Scientific15070063For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Petri Dish (150 mm)BD Falcon353025For MEF culture, tissue culture
PiggyBac transposase expression plasmid Provided by professor Andras Nagy laboratory-mPBase
PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS transposon plasmidProvided by professor Andras Nagy laboratory-PB-tetO2-IRES-OKMS
QIAprep Spin Maxiprep KitQiagen12663For plasmids purification
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106For plasmids purification
Reverse tetracycline transactivator transposon plasmid Provided by professor Andras Nagy laboratory-rtTA
RNeasy Mini Kit Qiagen74134For RNA extraction
Sox2 SantaCruzsc-17320Goat polyclonal IgG
SSEA1 Abcamab16285Mouse monoclonal IgM
SuperScript II Reverse Transcriptase Thermo Fisher Scientific18064-014For RT-PCR
T Abcamab20680Rabbit polyclonal IgG
Taq DNA PolymeraseThermo Fisher Scientific10342020PCR
Trypsin Thermo Fisher Scientific25300-054Cell culture passaging
Triton X-100Bio-Rad161-047For cell permeabilization, diluted in PBS 1x
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific15596-026For RNA extraction
Tubb3  Promega G712AMouse monoclonal IgG1
TWEEN-20SigmaP1379For cell permeabilization, diluted in PBS 1x
αfp   R&D SystemsMAB1368Mouse Monoclonal IgG1
αSMA Abcamab7817Mouse Monoclonal IgG2a
Transfection Reagent (FuGENE HD)Promega E2311For AF cells transfection
StereomicroscopeNikonSM2645To perform amniocentesis 
200 μl tipsSarstedt 70.760012To pick bacteria colonies
ScissorF.S.T14094-11 stainless 25UTo perform amniocentesis 
EthanolSigma2860To clean the abdominal wall of the pregnant dam
Tissue culture petri dish (150 mm) BD Falcon353025For MEF expansion
Mitomycin CSigmaM4287-2MGFor MEF inactivation
MULTIWELL 96 well plateBD Falcon353071For iPS-AF culture

Referencias

  1. You, Q., et al. Isolation of human mesenchymal stem cells from third-trimester amniotic fluid. Int J Gynaecol Obstet. 103 (2), 149-152 (2008).
  2. Prusa, A. R., Hengstschlager, M. Amniotic fluid cells and human stem cell research: a new connection. Med Sci Monit. 8 (11), RA253-RA257 (2002).
  3. Ditadi, A., et al. Human and murine amniotic fluid c-Kit+ Lin- cells display hematopoietic activity. Blood. 113 (17), 3953-3960 (2009).
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  5. Zani, A., et al. Amniotic fluid stem cells improve survival and enhance repair of damaged intestine in necrotising enterocolitis via a COX-2 dependent mechanism. Gut. 63 (2), 300-309 (2014).
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