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Neste Artigo

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Resumo

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

Resumo

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

Introdução

Diagnóstico pré-natal é uma importante ferramenta clínica para avaliar doenças genéticas (ou seja, aberrações cromossômicas, doenças monogenéticos ou poligenéticos / multifactorial) e malformações congênitas (hérnia diafragmática congênita ou seja, lesões pulmonares císticas, onfalocele, gastrosquise). As células do líquido amniótico (AF) são simples de se obter a partir de procedimentos de rotina programadas durante o segundo trimestre de gravidez (ou seja, a amniocentese e amnioreduction) ou cesarianas 1, 2. A disponibilidade de células pré-natais de FA a partir de pacientes ou de neonatais proporciona a possibilidade de utilizar esta fonte para a medicina regenerativa, e vários investigadores investigaram a possibilidade de tratar diferentes doenças ou danos de tecidos utilizando uma população de células estaminais isolado a partir de AF 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. A possibilidade de obter facilmente células AF de pacientes doentes, em uma janela de tempo em que a doença é muitas vezes parado, abre o caminho para a idéia de usar esta fonte de células para fins de reprogramação. Na verdade,-tronco pluripotentes induzidas (iPS células) derivadas de células AF poderia ser diferenciadas em células de interesse para testes in vitro de droga ou de abordagens de engenharia de tecidos, a fim de preparar uma terapia adequada e específica no paciente antes do parto. Muitos estudos já demonstraram a capacidade das células AF de ser reprogramado e diferenciadas em uma ampla gama de tipos de células 13, 14, 15, 16, 17 </ sup>, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.

Desde a descoberta por Takahashi e Yamanaka 28 de células somáticas reprogramadas através da expressão forçada de quatro fatores de transcrição (Oct4, Sox2, cMyc e KLF4), os progressos têm sido feitos no campo da reprogramação. Considerando os diferentes métodos, pode-se distinguir entre as abordagens virais e não virais. A primeira espera que o uso de vectores virais (retrovírus e lentivírus), que têm alta eficiência, mas geralmente incompleta silenciamento do transgene retroviral, tanto com a consequência de uma linha de células parcialmente reprogramados e o risco deinserção mutagênese 29, 30, 31. O método não-viral utiliza diferentes estratégias: isto é, plasmídeos, vectores, ARNm, proteína, transposões. A derivação de células iPS livres de sequências transgênicas visa contornar os efeitos potencialmente prejudiciais de expressão do transgene gotejante e mutagénese de inserção. Entre todos os mencionados estratégias não-virais acima, a piggyBac (PB) sistema de transposão / transposase requer apenas as repetições terminais invertidas flanqueiam um transgene e a expressão transiente da enzima transposase para catalisar a inserção ou excisão eventos 32. A vantagem na utilização de transposões sobre outros métodos para a geração de células IPS é a possibilidade de obtenção de células iPS livre do vector com uma abordagem de vector não virai, que mostra a mesma eficiência de vectores retrovirais. Isto é possível por excisão-traço inferior da codificação de transposão integrada para a reprogramming factores na sequência de uma nova expressão transitória da transposase nas células iPS 33. Dado que o OP é eficaz em diferentes tipos de células 34, 35, 36, 37, é mais adequado para uma abordagem clínica no que diz respeito aos vectores virais, e permite a produção de células iPS livre de xeno contrariamente aos protocolos de produção virais correntes que usam xenobióticos condições, este sistema é usado para obter as células iPS a partir AF murino.

Aqui propomos um protocolo detalhado seguintes trabalhos já publicados para mostrar a produção de clones iPS pluripotentes a partir de células AF rato (células iPS-AF) 38.

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Protocolo

Todos os procedimentos estavam de acordo com a lei italiana. amostras murino AF foram colhidas a partir de ratos grávidas em 13,5 dias post coitum (DPC) de camundongos C57BL / 6-Tg camundongos (UBC-GFP) 30Scha / J chamada GFP.

Produção 1. Transposon

NOTA: Os vectores de expressão transposões foram gerados utilizando procedimentos de clonagem padrão. O DNA de plasmídeo para a transfecção de células de rato AF foi preparado utilizando-se kits comerciais.

  1. Misturar 10 ng de ADN de plasmídeo com 50 uL de bactérias DH5a num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Incubar o tubo de microcentrifugadora em gelo durante 20 min.
  2. O choque térmico a 42 ° C durante 40 seg.
  3. Coloque tubo de microcentrifugadora em gelo durante 2 min.
  4. Adicionar 250 ul de caldo pré-aquecido (37 ° C) caldo lisogenia (LB). Agitar (300 rpm) a 37 ° C durante 30 min.
  5. Espalhe 30 ul de cada transformação em placas LB com 0,1 mg / ml de ampicilina. Permitir que as placas para secar e incubar invertida a 37 ° C OVernight.
  6. No dia seguinte, na parte da tarde, escolher 3 colónias, usando estéreis 200 dicas ul, de cada transformação e transferir para 0,1 mg / ml de LB amp.
  7. Agitar bactérias (300 rpm) durante a noite a 37 ° C.
  8. Para a purificação do plasmídeo usar kits comerciais. plasmídeos de Stock a -20 ° C.

2. embrionárias de camundongos Fibroblastos (MEF) Cultura

  1. Revestimento das placas de 6 poços com 0,1% de gelatina
    1. revestir placas sob o capô adição de 1 ml de solução estéril de gelatina a 0,1% a cada um dos seis poços. Deixe a gelatina polimerizar na incubadora (37 ° C) durante 1 h.
    2. Descartar o excesso, e secar as placas durante 1 hr.
    3. Use parafilme para vedar e armazenar as placas à temperatura ambiente.
  2. Inactivação de MEF com mitomicina C
    1. Descongelar um frasco de 4 x 10 6 células MEF usando um banho de 37 ° C.
    2. Semente MEF na capa em uma placa de Petri (150 mm) com meio MEF.
    3. Cultivar as células a 37 ° C e 5% de CO 2.
    4. (CUIDADO) Adicionar mitomicina C (5 mg / mL) quando as células estão confluentes.
    5. Colocar as células em uma incubadora (37 ° C e 5% de CO 2) durante 3 h.
    6. Remova o meio de células com mitomicina C. Lavar três vezes com solução salina de tampão fosfato 1x (PBS).
    7. Adicionar 2 ml de tripsina as células e colocar em comerciais a 37 ° C incubadora durante 5 min. Depois, adicione 18 ml de meio de bloqueio para parar a reacção de tripsina.
    8. Contar as células utilizando uma câmara de Burker de acordo com o protocolo do fabricante.
    9. células centrifugar a 145 xg por 5 min. Descartar o sobrenadante.
    10. Semente 60.000 células / cm 2 de MEF inactivado em placas revestidas com gelatina a 0,1%.
    11. Cultivar as células durante 24 h a 37 ° C e CO2 a 5%, antes da semeadura AF e / ou células IPS-AF.

3. Rato AF isolamento de células

  1. Configurar acasalamentos cronometrados e verificar plu vaginalgs após 24 h de co-habitação.
  2. Observe até 13,5 dpc e sacrificar barragem grávida por deslocamento cervical.
  3. Limpar a parede abdominal do animal, por meio de 70% de etanol.
  4. Com uma tesoura, realizar uma laparotomia mediana incisão do comprimento da parede abdominal para ter acesso para a cavidade abdominal.
  5. Expor o útero usando uma pinça. Remover o útero com uma tesoura e transferir para um prato de 100 milímetros de Petri estéril cheio com PBS 1x colocadas em gelo.
  6. Use uma lupa para recolher o AF em aumento de 10x.
  7. Segure o útero com uma pinça e retire a parede uterina com uma tesoura. Tenha cuidado para evitar qualquer dano às membranas fetais e consequente fuga de líquido amniótico.
  8. Recolha fetos em uma placa de Petri 100 milímetros preenchido com estéril 1x PBS e colocar no gelo.
  9. Segure a placenta de um feto com uma pinça fina ponto e lugar em um 100 milímetros placa de Petri limpa.
  10. Retire o saco vitelino usando uma pinça de ponta fina.
  11. Interromper o âmnio usando uma pinça de ponta fina e recolher 30 ul de AF para cada feto usando uma seringa de insulina em um 15 ml frasco cónico.
  12. Após a recolha de AF, lavar cada feto com PBS estéril 1x suplementado com 1% de soro fetal de bovino (FBS) e recolher nas tubo de 15 ml contendo o AF.
  13. Centrifugar AF a 145 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante sob o capô e semear as células AF peletizadas.

Cultura de Células 4. Rato AF

  1. Semeadura de células de camundongo AF
    1. Um dia antes da semeadura, preparar uma solução a 0,1% placa de 6 poços revestidos com gelatina com MEF tratado com mitomicina C.
    2. Após a coleta AF, semear as células obtidas a partir de uma amniocentese (cerca de 1 x 10 7 células obtidas a partir de 6 fetos) sobre o MEF mitoticamente inactivados utilizando meio de cultura AF.
    3. Cultivar as células a 37 ° C e 5% de CO 2, mudando o meio todos os outros dias.
    4. Após 7 dias de cultura, transcélulas fect AF seguintes o procedimento descrito abaixo.

5. A transfecção, geração de células iPS-AF e Cultura

NOTA: As células de ratinho AF foram transfectadas com o plasmídeo transposão PB-tetO2-IRES-OKMS, em conjunto com um plasmídeo de expressão de transposase (mPBase) e com o transactivador de tetraciclina reversa plasmídeo transposão (PB-CAG-rtTA). Todos os plasmídeos foram fornecidas pelo professor Andras Nagy 33.

  1. Misturar 1 ug de PB-tetO2-IRES-OKMS com 0,5 ug de mPBase e 0,5 ^ g de OP-CAG-rtTA (ADN total: 2? G) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  2. Dilui-se o ADN a 100 uL de meio isento de soro (Dulbecco Modified Eagle Médium - DMEM).
  3. Adiciona-se 8 mL de reagente de transfecção (por exemplo, FuGENE) (na proporção de ADN de plasmídeo: O agente de transfecção de 2 ug (ADN) para o agente de transfecção de 8 uL) contendo o ADN em 1,5 mL tubo de microcentrífuga.
  4. Incubar mistura reagente / transfecção de DNA durante 15 minutos à temperatura ambiente.
  5. Adicionar gota a gota 100 uL da mistura de reagentes de transfecção / ADN por poço para uma placa de 6 poços com células AF rato e distribuir por uma agitação suave, com um volume final de 2 mL / poço. Deixe por 24 h.
  6. No dia seguinte, induzirem a expressão de factores do Yamanaka (Oct4, KLF4, cMyc, Sox2), alimentando as células com meio fresco IPS-AF suplementado com 1,5 ug / ml de doxiciclina (2 mL de meio para cada poço).
  7. Alimentar as células a cada dia, sem passagem, por meio fresco contendo DOX (manter as células em meios suplementados com doxiciclina até que ponto 5.13).
  8. Observar células no prazo de 24 h para a expressão mCherry e diariamente para a formação de colónias (colônias aparecem normalmente entre 20 e 30 dias após a transfecção).
  9. Um dia antes da colheita de colónia, preparar uma placa de cultura de tecidos de 96 poços com MEF tratado com mitomicina C.
  10. Escolha colónias individuais em 50 ul de volume de Utilizanga 200 uL pipeta, e transferi-los sequencialmente para uma placa de 96 poços, em poços individuais.
  11. No dia seguinte, dissociar cada colónia em células isoladas através da adição de 50 ul de tripsina comercial e incubar durante 5 min a 37 ° C.
  12. Pipeta cima e para baixo para desagregar a colônia.
  13. Transferir 50 uL da tripsina contendo a colónia dissociada em um novo bem com MEF inactivada numa gelatina 0,1% revestidos de 96 poços da placa cheia com 100 uL de meio de IPS-AF fresco suplementado com doxiciclina.
  14. Quando as células atingem 60-70% de confluência, divididas em um poço de uma placa de 24 poços.
  15. Quando as células atingem 60-70% de confluência, divididas 1: 2 a dois poços, uma com a doxiciclina e o outro sem doxiciclina, para verificar se colónias aparecem também na condição sem doxiciclina.
  16. Continuar a manter clones iPS-AF, doxiciclina independente, em MEF inativada no meio iPS-AF.
  17. Células a 37 ° C e 5% de CO 2, CH cultivaranging média diária.

6. Coloração de Fosfatase Alcalina

  1. Realização da coloração da fosfatase alcalina seguindo o protocolo do fabricante, sempre que haja o aparecimento de células IPS-AF independentes doxiciclina.

7. imunofluorescência

  1. Sempre que haja o aparecimento de doxiciclina células independentes IPS-AF, sementes 150.000 células / cm2 em um poço de uma placa de 24 poços com MEF inactivado, e crescer as células durante 48 h a 37 ° C e 5% de CO 2.
  2. (CUIDADO) Fixar as células por adição de 300 ul por poço de 4% de paraformaldeído (PFA) durante 15 min à temperatura ambiente.
  3. Adicionar 300 uL de 0,1% de NP-40 para permeabilizar as células.
  4. Lavar as células com 300 uL de 0,1% de PBS-Tween 20.
  5. Adicionar 300 ul de tampão de bloqueio (soro de cavalo a 10% em 1x PBS) durante 1 h à temperatura ambiente.
  6. Utilize os seguintes anticorpos primários: Oct4 (1:80), Sox2 (1:80), KLF4 (1:80), NANOG (1:100) e SSEA1 (1:80). Diluir SSEA1 com 1% de albumina de soro bovino (BSA), soro de cabra normal a 10%, 0,3 M de glicina em 0,1% PBS-Tween-20. Dilui-se todos os outros anticorpos com soro de cavalo a 10% em PBS 1x.
  7. Incubar anticorpos durante a noite a 4 ° C.
  8. Lavar com 300 ul de 0,1% de PBS-Tween-20.
  9. Use os anticorpos secundários diluídos em soro de cavalo a 10% em PBS 1x: cabra Alexa594-conjugado anti-IgG de ratinho (1: 200), IgG de galinha anti-cabra Alexa594-conjugado (1: 200), Alexa594-conjugado de galinha anti-IgG de coelho (1: 200), Alexa568 de cabra conjugado com anti-rato de IgM (1: 200). Incubar durante 2 horas à temperatura ambiente.
  10. Enxágüe com 1x PBS.
  11. núcleos mancha com solução de Hoechst (1: 10.000) em 1x PBS.

8. In Vitro Cell Differentiation

  1. Para formar pendurados gota corpos embrióides (EBS), cultivar gotas individuais (2.000 células / 20 ul) sobre a tampa da placa de Petri, utilizando o meio de diferenciação.
  2. Incubar os pratos a 37 ° Ce 5% de CO 2 durante 4 dias.
  3. Transferir EBs em 100 mm pratos de grau bacteriana na cultura em suspensão durante 3 dias em meio de diferenciação.
  4. EBs prato em 24 poços, placas revestidas com matriz de membrana basal (diluído 1:10 em DMEM) durante mais 14 dias.
  5. Para as análises de imunofluorescência, usam anticorpos primários: T (1: 100), αfp (1: 200) e Tubb3 (1: 500) 37.

9. Formação In Vivo teratoma

  1. Injectar 100 ul de 1x PBS contendo 1 x 10 6 células IPS-AF no músculo do membro posterior de RAG2 - / - yc - / - ratos.
  2. Sacrificar os ratos por deslocamento cervical 6 semanas após a injeção de células.
  3. Retirar as massas tumorais, que se distinguem pelo seu tamanho, a partir do membro posterior de ratinhos para as análises seguintes.
  4. Cortar 7-10 uM secções transversais de espessura de tumor isopentano-congelado utilizando um criostato.
  5. Para Hematoxilina umd Eosina (HE) Stain:
    1. Mancha com HE para avaliar a composição do tecido do tumor, seguindo o protocolo do fabricante.
  6. Para Stain imunoperoxidase:
    1. Fix secções teratoma com PFA a 4% durante 15 min à temperatura ambiente.
    2. Permeabilizar com 0,1% de Triton X-100.
  7. Incubar com os anticorpos seguintes: Tubb3 (1: 100), αfp (01:50) e αSMA (1: 100) diluída em BSA a 1% em PBS 1x. Incubar durante 1 hora a 37 ° C (para Tubb3) ou durante a noite a 4 ° C (para os outros anticorpos).
  8. peroxidase de bloco utilizando metanol a 100% durante 20 min.
  9. Incubar durante 45 min a 37 ° C com anticorpo secundário conjugado com HRP (1: 150) anti-rato.
  10. Enxágüe com 1x PBS.
  11. Incubar com peroxidase de substrato (HRP) (Ver Materiais Tabela) durante 5 min.
  12. Lavar com água da torneira durante 5 min.
  13. Mancha com Hematoxilina QS para 9 seg.
  14. Lavar com água da torneira.

10. A extracção de ARN a partir de células

  1. Usar um kit de extração de RNA comerciais de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante.

11. A extracção de ARN a partir de teratoma

  1. Homogeneizar o teratoma usando um pilão e nitrogênio argamassa e líquidos para evitar o descongelamento da amostra.
  2. Pesar 25 mg de tecido.
  3. Adicionar 1 ml de reagente comercial para extração de RNA e 200 mL de clorofórmio.
  4. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
  5. Centrifuga-se a 13000 xg e 4 ° C durante 15 min.
  6. Transferir o sobrenadante clarificado para um tubo novo.
  7. Para purificar o ARN utilizar um kit de extração de RNA comerciais de acordo com o protocolo do fabricante.

12. Transcrição Reversa-polimerase Análise Chain Reaction

  1. Sintetizar a primeira cadeia de ADNc utilizando uma transcriptase reversa para a transcrição inversa (RT) -polimerase reacção em cadeia (PCR) e o oligo acor (dT)Ding com o protocolo do fabricante, para se obter 50 ng / uL de ADNc. Dilui-se com ADNc de água isenta de RNase na concentração de 10 ng / mL.
  2. Realizar RT-PCR utilizando a polimerase de ADN de acordo com o protocolo do fabricante, utilizando 1 ng / uL de ADNc.

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Resultados

Para avaliar a capacidade de reprogramação, as células do rato AF foram coletados de fetos de ratos GFP. As células foram transfectadas com o plasmídeo circular transposão PB-tetO2-IRES-OKMS, que expressa os factores Yamanaka (Oct4, Sox2, cMyc e KLF4) ligadas à proteína fluorescente mCherry de uma forma indutível doxiciclina, tetraciclina e transactivador reverso (PB- CAG-rtTA) os plasmídeos juntamente com o plasmídeo de expressão de transposase (mPBase). Células de ratinho ...

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Discussão

O método escolhido para se obter a indução de pluripotência é relevante para segurança clínica célula no que diz respeito ao transplante a longo prazo. Hoje em dia, existem vários métodos adequados para a reprogramação. Entre os métodos de não-integrativos, a viral (SeV) Sendai vector é um vírus de ARN que pode produzir grandes quantidades de proteína, sem integração no núcleo das células infectadas e 40 podia ser uma estratégia para a obtenção de células iPS. vectores Se...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

This work was supported by CARIPARO Foundation Grant number 13/04 and Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza Grant number 10/02. Martina Piccoli, Chiara Franzin and Michela Pozzobon are funded by Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza. Enrica Bertin is funded by CARIPARO Foundation Grant number 13/04. Paolo De Coppi is funded by Great Ormond Street Hospital Children's Charity.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm Bacterial-grade Petri Dishes BD Falcon351029For in vitro differentiation
2-mercaptoethanol SigmaM6250For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Alexa568-conjugated goat anti-mouse IgM Thermo Fisher ScientificA21043Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated chicken anti-goat IgG Thermo Fisher ScientificA21468Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated chicken anti-rabbit IgG Thermo Fisher ScientificA21442Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated goat anti-mouse IgG Thermo Fisher ScientificA11005Secondary antibody (immunofluorescence)
Alkaline Phosphatase kit Sigma85L1Alkaline Phosphatase  staining
AmpicillinSigmaA0166For bacterial selection
Bovine Serum Albumin SigmaA7906BSA, for blocking solution. Diluted in PBS 1x
ChloroformSigmaC2432For RNA extraction
DH5α cellsThermo Fisher Scientific18265-017Bacteria for cloning procedure
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific41965039For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Doxycycline SigmaD9891For exogenous factors expression
Microcentrifuge tubes (1.5 ml) Sarstedt 72.706For PB production 
ES FBS Thermo Fisher Scientific10439024For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
FBS Thermo Fisher Scientific10270106For MEF medium
Fine point forcepsF.S.TDumont #5 AF isolation
GelatinJ.T.Baker131Used 0.1%, diluted in PBS 1x
GlycineBio-Rad161-0718For blocking solution. Diluted in PBS 1x
Haematoxylin QSVector LaboratoriesH3404Nuclei detection
HE Bio-Optica04-061010Histological analysis of teratoma
Hoechst Thermo Fisher ScientificH3570Nuclei detection
Horse Serum Thermo Fisher Scientific16050-122For blocking solution
HRP-conjugated goat anti-mouse IgGSantaCruzsc2005Secondary antibody (immunoperoxidase)
ImmPACT NovaRED Vector LaboratoriesSK4805Peroxidase substrate
Insulin syringe with needle (25 G)TerumoSS+01H25161Amniocentesis procedure
Klf4 SantaCruzsc-20691Rabbit polyclonal IgG
L-glutamine Thermo Fisher Scientific25030For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
LB broth (Lennox)SigmaL3022For bacterial growth
LIF SigmaL5158For mouse AF and iPS-AF cells medium
Matrigel BD354234For in vitro differentiation. Diluted 1:10 in DMEM
MethanolSigma32213Peroxidase blocking
MULTIWELL 24 well plateBD Falcon353047For in vitro differentiation
MULTIWELL 6 well plateBD Falcon353046For MEF, mouse AF and iPS-AF cells culture
Nanog ReproCELLRCAB0002P-FRabbit polyclonal IgG
Non-essential amino acids SigmaM7145For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Normal Goat SerumVector LaboratoriesS2000For blocking solution. Diluted in PBS 1x
NP-40Sigma12087-87-0For cell permeabilization. Diluted in PBS 1x
Oct4SantaCruzsc-5279Mouse monoclonal IgG2b
Oligo (dT) Thermo Fisher Scientific18418012For RT-PCR
Paraformaldehyde (solution)Sigma441244PFA, fixative, diluted in PBS
PBS 10xThermo Fisher Scientific14200-067D-PBS, free of Ca2+/Mg2+. Diluted with sterile water to obtain PBS 1x
Penicillin - Streptomycin Thermo Fisher Scientific15070063For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Petri Dish (150 mm)BD Falcon353025For MEF culture, tissue culture
PiggyBac transposase expression plasmid Provided by professor Andras Nagy laboratory-mPBase
PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS transposon plasmidProvided by professor Andras Nagy laboratory-PB-tetO2-IRES-OKMS
QIAprep Spin Maxiprep KitQiagen12663For plasmids purification
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106For plasmids purification
Reverse tetracycline transactivator transposon plasmid Provided by professor Andras Nagy laboratory-rtTA
RNeasy Mini Kit Qiagen74134For RNA extraction
Sox2 SantaCruzsc-17320Goat polyclonal IgG
SSEA1 Abcamab16285Mouse monoclonal IgM
SuperScript II Reverse Transcriptase Thermo Fisher Scientific18064-014For RT-PCR
T Abcamab20680Rabbit polyclonal IgG
Taq DNA PolymeraseThermo Fisher Scientific10342020PCR
Trypsin Thermo Fisher Scientific25300-054Cell culture passaging
Triton X-100Bio-Rad161-047For cell permeabilization, diluted in PBS 1x
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific15596-026For RNA extraction
Tubb3  Promega G712AMouse monoclonal IgG1
TWEEN-20SigmaP1379For cell permeabilization, diluted in PBS 1x
αfp   R&D SystemsMAB1368Mouse Monoclonal IgG1
αSMA Abcamab7817Mouse Monoclonal IgG2a
Transfection Reagent (FuGENE HD)Promega E2311For AF cells transfection
StereomicroscopeNikonSM2645To perform amniocentesis 
200 μl tipsSarstedt 70.760012To pick bacteria colonies
ScissorF.S.T14094-11 stainless 25UTo perform amniocentesis 
EthanolSigma2860To clean the abdominal wall of the pregnant dam
Tissue culture petri dish (150 mm) BD Falcon353025For MEF expansion
Mitomycin CSigmaM4287-2MGFor MEF inactivation
MULTIWELL 96 well plateBD Falcon353071For iPS-AF culture

Referências

  1. You, Q., et al. Isolation of human mesenchymal stem cells from third-trimester amniotic fluid. Int J Gynaecol Obstet. 103 (2), 149-152 (2008).
  2. Prusa, A. R., Hengstschlager, M. Amniotic fluid cells and human stem cell research: a new connection. Med Sci Monit. 8 (11), RA253-RA257 (2002).
  3. Ditadi, A., et al. Human and murine amniotic fluid c-Kit+ Lin- cells display hematopoietic activity. Blood. 113 (17), 3953-3960 (2009).
  4. Piccoli, M., et al. Amniotic fluid stem cells restore the muscle cell niche in a HSA-Cre, Smn(F7/F7) mouse model. Stem Cells. 30 (8), 1675-1684 (2012).
  5. Zani, A., et al. Amniotic fluid stem cells improve survival and enhance repair of damaged intestine in necrotising enterocolitis via a COX-2 dependent mechanism. Gut. 63 (2), 300-309 (2014).
  6. Rota, C., et al. Human amniotic fluid stem cell preconditioning improves their regenerative potential. Stem Cells Dev. 21 (11), 1911-1923 (2012).
  7. Mirabella, T., et al. Pro-angiogenic soluble factors from Amniotic Fluid Stem Cells mediate the recruitment of endothelial progenitors in a model of ischemic fasciocutaneous flap. Stem Cells Dev. 21 (12), 2179-2188 (2012).
  8. Mirabella, T., Cili, M., Carlone, S., Cancedda, R., Gentili, C. Amniotic liquid derived stem cells as reservoir of secreted angiogenic factors capable of stimulating neo-arteriogenesis in an ischemic model. Biomaterials. 32 (15), 3689-3699 (2011).
  9. Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
  10. Kim, J. A., et al. MYOD mediates skeletal myogenic differentiation of human amniotic fluid stem cells and regeneration of muscle injury. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 147(2013).
  11. Vadasz, S., et al. Second and third trimester amniotic fluid mesenchymal stem cells can repopulate a de-cellularized lung scaffold and express lung markers. J Pediatr Surg. 49 (11), 1554-1563 (2014).
  12. Turner, C. G., et al. Preclinical regulatory validation of an engineered diaphragmatic tendon made with amniotic mesenchymal stem cells. J Pediatr Surg. 46 (1), 57-61 (2011).
  13. Galende, E., et al. Amniotic Fluid Cells Are More Efficiently Reprogrammed to Pluripotency Than Adult Cells. Cloning Stem Cells. 12 (2), 117-125 (2009).
  14. Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Hum Mol Genet. 18 (22), 4340-4349 (2009).
  15. Ye, L., et al. Induced pluripotent stem cells offer new approach to therapy in thalassemia and sickle cell anemia and option in prenatal diagnosis in genetic diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (24), 9826-9830 (2009).
  16. Wolfrum, K., et al. The LARGE Principle of Cellular Reprogramming: Lost, Acquired and Retained Gene Expression in Foreskin and Amniotic Fluid-Derived Human iPS Cells. PLoS ONE. 5 (10), 137-138 (2010).
  17. Ye, L., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using site-specific integration with phage integrase. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19467-19472 (2010).
  18. Lu, H. E., et al. Selection of alkaline phosphatase-positive induced pluripotent stem cells from human amniotic fluid-derived cells by feeder-free system. Exp Cell Res. 317 (13), 1895-1903 (2011).
  19. Lu, H. E., et al. Modeling Neurogenesis Impairment in Down Syndrome with Induced Pluripotent Stem Cells from Trisomy 21 Amniotic Fluid Cells. Exp Cell Res. 319 (4), 498-505 (2012).
  20. Kobari, L., et al. Human induced pluripotent stem cells can reach complete terminal maturation: in vivo and in vitro evidence in the erythropoietic differentiation model. Haematologica. 97 (12), 1795-1803 (2012).
  21. Li, Q., Fan, Y., Sun, X., Yu, Y. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Amniotic Fluid Cells by Reprogramming with Two Factors in Feeder-free Conditions. J Reprod Dev. 59 (1), 72-77 (2012).
  22. Fan, Y., Luo, Y., Chen, X., Li, Q., Sun, X. Generation of Human β-thalassemia Induced Pluripotent Stem Cells from Amniotic Fluid Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette. J Reprod Dev. 58 (4), 404-409 (2012).
  23. Liu, T., et al. High efficiency of reprogramming CD34+ cells derived from human amniotic fluid into induced pluripotent stem cells with Oct4. Stem Cells Dev. 21 (12), 2322-2332 (2012).
  24. Jiang, G., et al. Human transgene-free amniotic-fluid-derived induced pluripotent stem cells for autologous cell therapy. Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).
  25. Drozd, A. M., et al. Generation of human iPSC from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system. Stem Cell Res Ther. 6 (122), (2015).
  26. Moschidou, D., et al. Human mid-trimester amniotic fluid stem cells cultured under embryonic stem cell conditions with Valproic acid acquire pluripotent characteristics. Stem Cells Dev. 22 (3), 444-458 (2012).
  27. Moschidou, D., et al. Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach. Mol Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).
  28. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  29. Mikkelsen, T. S., et al. Dissecting direct reprogramming through integrative genomic analysis. Nature. 454 (7200), 49-55 (2008).
  30. Sridharan, R., et al. Role of the murine reprogramming factors in the induction of pluripotency. Cell. 136 (2), 364-377 (2009).
  31. Knight, S., Collins, M., Takeuchi, Y. Insertional mutagenesis by retroviral vectors: current concepts and methods of analysis. Curr Gene Ther. 13 (3), 211-227 (2013).
  32. Fraser, M. J., Ciszczon, T., Elick, T., Bauser, C. Precise excision of TTAA-specific lepidopteran transposons piggyBac (IFP2) and tagalong (TFP3) from the baculovirus genome in cell lines from two species of Lepidoptera. Insect Mol Biol. 5 (2), 141-151 (1996).
  33. Woltjen, K., Kim, S. I., Nagy, A. The PiggyBac Transposon as a Platform Technology for Somatic Cell Reprogramming Studies in Mouse. Methods Mol Biol. 1357, 1-22 (2015).
  34. Wu, S. C., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (41), 15008-15013 (2006).
  35. Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
  36. Wang, W., et al. Chromosomal transposition of PiggyBac in mouse embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27), 9290-9295 (2008).
  37. Cadiñanos, J., Bradley, A. Generation of an inducible and optimized PiggyBac transposon system. Nucleic Acids Res. 35 (12), e87(2007).
  38. Bertin, E., et al. Reprogramming of mouse amniotic fluid cells using a PiggyBac transposon system. Stem Cell Research. 15 (3), 510-513 (2015).
  39. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  40. Fusaki, N., et al. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
  41. Nishishita, N., et al. Generation of virus-free induced pluripotent stem cell clones on a synthetic matrix via a single cell subcloning in the naive state. PLoS One. 7 (9), e38389(2012).
  42. Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PLoS One. 7 (8), e42855(2012).
  43. Yant, S. R., et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Mol Cell Biol. 25 (6), 2085-2094 (2005).
  44. Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. PiggyBac transposon-mediated gene transfer in human cells. Mol Ther. 15 (1), 139-145 (2007).
  45. Galvan, D. L., et al. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J Immunother. 32 (8), 837-844 (2009).
  46. Huang, X., et al. Gene transfer efficiency and genome-wide integration profiling of Sleeping Beauty, Tol2, and piggyBac transposons in human primary T cells. Mol Ther. 18 (10), 1803-1813 (2010).
  47. Meir, Y. J., et al. Genome-wide target profiling of PiggyBac and Tol2 in HEK 293: pros and cons for gene discovery and gene therapy. BMC Biotechnol. 11 (28), (2011).
  48. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  49. Filareto, A., et al. An ex vivo gene therapy approach to treat muscular dystrophy using inducible pluripotent stem cells. Nat Commun. 4 (1549), (2013).
  50. Darabi, R., et al. Human ES- and iPS-derived myogenic progenitors restore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophic mice. Cell Stem Cell. 10 (5), 610-619 (2012).

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