JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

Özet

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

Giriş

Prenatal tanı genetik hastalıkların (örneğin kromozomal anormallikler, monogenetik veya çok faktörlü / polijenetik hastalıklar) ve konjenital anomali (yani konjenital diyafragma hernisi, kistik akciğer lezyonları, ekzomfalos, Gastroşizis) değerlendirmek için önemli bir klinik araçtır. Amniyotik sıvı (AF) hücreleri gebeliğin ikinci üç aylık döneminde rutin planlanan prosedürlerden elde etmek kolay (yani amniyosentez ve amniyoredüksiyon yapıldığında) ya da sezaryen bölümler 1, 2. Prenatal veya neonatal hastalarda AF hücrelerinin mevcudiyeti rejeneratif tıp için bu kaynak kullanma imkanı sağlar, ve birkaç araştırmacı AF 3, 4, 5, 6 izole bir kök hücre popülasyonu kullanarak farklı doku hasarları veya hastalıkları tedavi imkanı araştırıldı, 7, 8, 9, 10, 11, 12. Kolayca Hastalık genellikle hareketsiz olduğu bir zaman penceresinde, hastalıklı hastaların AF hücreleri elde etme ihtimali, yeniden programlama amacıyla bu hücre kaynağı kullanma düşüncesine yol açar. Gerçekten de, AF hücrelerinden türetilen uyarılmış pluripotent kök (IPS) hücreleri doğum öncesi uygun bir hastaya özgü tedavi hazırlamak amacıyla, in vitro ilaç testleri için veya doku mühendisliği yaklaşımlar ilgi hücrelerinde ayırt edilebilir. Birçok çalışma, daha önce AF hücrelerinin yeteneği hücre tipleri 13, 14, 15, 16, 17 bir aralığı içine yeniden programlanması ve ayırt edilmesi göstermiştir/ sup>, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.

Dört transkripsiyon faktörleri (Oct4, Sox2, Myc'nin ve Klf4) zorla ifade ile Takahashi ve reprogrammed somatik hücre Yamanaka 28 ile keşfinden bu yana, ilerleme yeniden programlama alanında yapılmıştır. farklı yöntemler göz önüne alındığında, biz viral ve viral olmayan yaklaşımlar ayırt edebilirsiniz. İlk kısmen yeniden programlanan hücre hattının sonucu ve risk hem de yüksek verim ama retroviral transgen genellikle eksik susturulması, sahip viral vektörler (retrovirüsler ve lentiviruses), kullanımını bekliyoraraya sokma mutajenez 29, 30, 31. Yani plazmidler, vektörler, mRNA, protein, transpozonlar: viral olmayan yöntem farklı stratejiler kullanır. Transgenik dizilerin ücretsiz iPS hücrelerinin türetilmesi sızdıran transgen ifade ve girmeyle mutagenez potansiyel zararlı etkileri engelleyecek amaçlamaktadır. Yukarıda açıklanan tüm viral olmayan stratejiler arasında, piggyBac (PB) transpozon / transposase sistemi ekleme veya eksizyon olayları 32 katalize bir transgen ve transposase enzimin geçici ifadesini yan sadece ters terminali tekrarlar gerektirir. iPS hücresi üretimi için diğer yöntemlere göre transpozonlar kullanılarak avantajı retroviral vektörler aynı etkinliğini gösteren bir viral olmayan vektör yaklaşımla vektörü içermeyen iPS hücrelerini elde etme imkanı vardır. Bu reprogr için entegre transposon kodlama iz az eksizyon ile mümkündüriPS hücrelerinin 33 transpozazın yeni, geçici ifade, aşağıdaki faktörler amming. PB farklı hücre tipleri, 34, 35, 36, 37 etkili olduğu göz önüne alındığında, viral vektörler ile ilgili klinik yaklaşımın için daha uygundur, ve ksenobiyotik kullanarak mevcut virüs üretim protokolleri aksine kseno içermeyen iPS hücrelerinin üretimi sağlar Koşullar, bu sistem, kemirgen AF iPS hücreleri elde etmek için kullanılır.

Burada fare AF hücrelerinin (iPS-AF hücreleri) 38 dan pluripotent iPS klonların üretimini göstermek için zaten yayınlanmış çalışmaları takip ayrıntılı bir protokol öneriyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm işlemler İtalyan yasalarına göre idi. Murin AF örnekleri GFP adı C57BL / 6-Tg (UBC-GFP) 30Scha / J fareleri 13.5 gün sonra coitum (DPC) gebe farelerin hasat edilmiştir.

1. Transpozon Üretimi

Not: Transposon sentezleme vektörleri standart klonlama prosedürleri kullanılarak elde edilmiştir. Fare AF hücreleri transfeksiyon için plazmid DNA, ticari kitler kullanılarak hazırlandı.

  1. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde DH5α bakteri 50 ul plasmid DNA, 10 ng karıştırın. 20 dakika boyunca buz üzerinde mikrosantrifüj tüpü inkübe edin.
  2. 40 sn için 42 ° C sıcaklıkta ısı şoku.
  3. 2 dakika boyunca buz üzerinde mikrosantrifüj tüpü yerleştirin.
  4. Önceden ısıtılmış (37 ° C) lizojeni etsuyu (LB) suyu 250 ul ekleyin. 30 dakika boyunca 37 ° C'de (300 rpm) çalkalayın.
  5. 0.1 mg / ml ampisilin ile LB levhaları üzerine her dönüşüm için 30 ul yayıldı. Plakalar kuru ve 37 ° C ov de ters inkübe izinernight.
  6. Ertesi gün, öğleden sonra, her dönüşümden, steril 200 ul ipuçlarını kullanarak, 3 koloniler almak ve 0.1 mg / ml LB amp üzerine aktarın.
  7. gece boyunca 37 ° C'de (300 rpm) bakteri çalkalayın.
  8. Plazmid Saflaştırma için, ticari kitler kullanın. -20 ° C'de Hazır plazmid.

2. Fare Embriyonik fibroblast (MEF) Kültür

  1. % 0.1 jelatin ile 6 oyuklu plakaların kaplanması
    1. Altı gözeneğin her steril% 0.1 jelatin 1 ml ilave başlık altında Coat plakalar. jelatin 1 saat süreyle bir inkübatör (37 ° C) polimerize olsun.
    2. aşırı atın ve 1 saat süre ile plakaları kurutunuz.
    3. oda sıcaklığında saklamak plakaları mühür ve parafilm kullanın.
  2. Mitomisin C ile MEF inaktivasyonu
    1. 37 ° C banyo kullanılarak 4 x 10 6 MEF hücreleri şişe çözülme.
    2. MEF ortamı ile bir Petri kabı (150 mm) başlık MEF tohumu.
    3. 37 ° C'de ve% 5 CO2 hücreleri geliştirin.
    4. (DİKKAT) hücreler konfluent mitomisin C (5 mg / ml) ekleyin.
    5. Bir inkübatör içine yerleştirin hücreleri (37 ° C ve% 5 CO2) 3 saat karıştırıldı.
    6. mitomisin C yıkama hücreleri ile 1x Fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez orta çıkarın.
    7. 5 dakika için 37 ° C inkübatör içine ticari tripsin ve yeri hücre 2 ml ilave edilir. Sonra, tripsin reaksiyonu durdurmak için kesme aracının 18 ilave edin.
    8. üreticinin protokolüne göre bir Bürker odası kullanarak hücreleri sayın.
    9. 5 dakika boyunca 145 x g'de santrifüje hücreleri. süpernatant atın.
    10. Tohum 60.000 hücre /% 0.1 jelatin kaplı plakalar üzerinde inaktive EMB cm2.
    11. AF ve / veya iPS AF hücreleri tohumlamadan önce 37 ° C'de 24 saat% 5 CO2 hücreleri geliştirin.

3. Fare AF Hücre İzolasyonu

  1. zamanlanmış çiftleşmesi kurmak ve vajinal PLU kontroleş yuva 24 saat sonra GS.
  2. 13.5 DPC kadar gözlemleyin ve servikal dislokasyon yoluyla hamile baraj kurban.
  3. % 70 etanol kullanılarak hayvanın karın duvarı temizleyin.
  4. makas kullanarak, karın boşluğuna erişebilmek için karın duvarının uzunluğu incising orta hat laparotomi gerçekleştirin.
  5. forseps kullanarak rahim Açığa. 1x PBS buz üzerine yerleştirildi steril dolu bir 100 mm Petri kabı içine makas ve transfer kullanarak rahim kaldırmak.
  6. 10X büyütmede AF toplamak için Stereomikroskopta kullanın.
  7. forseps ile rahim tutun ve makas ile rahim duvarına çıkarın. Fetal membranlar ve buna bağlı olarak amniotik sıvı sızıntısını önlemek için dikkatli olun.
  8. Steril 1X PBS ile doldurulmuş bir 100 mm Petri kabı içine fetusu toplayın ve buz üzerine yerleştirin.
  9. Temiz bir 100 mm Petri kabı ince bir nokta forseps ve yer ile bir fetus plasenta kavrayın.
  10. ince nokta forseps kullanarak kesesi sarısı çıkarın.
  11. ince nokta forseps kullanarak amniyon Disrupt ve 15 ml konik şişe içine bir insülin şırınga kullanarak her bir fetus için AF 30 ul toplamak.
  12. AF toplandıktan sonra,% 1 fetal inek serumu (FBS) ile takviye edilmiş, steril 1 x PBS ile her fetus yıkayın ve 15 ml AF içeren konik tüp toplar.
  13. 5 dakika boyunca 145 xg'de Santrifüj AF. kaputun altında Süpernatantı ve pelet AF hücreleri tohum.

4. Fare AF Hücre Kültürü

  1. Fare AF Hücrelerinin tohumlama
    1. Bir gün önce, ekim için, mitomisin C ile muamele edilmiş MEF ile% 0.1 jelatin kaplı 6 oyuklu plaka hazırlanması.
    2. AF toplandıktan sonra, AF kültür ortamı kullanılarak (yaklaşık 1 x 10 7 hücre 6 fetusa elde edilen) mitotik inaktive MEF üzerine bir amniyosentez elde edilen hücreler tohum.
    3. Her gün ortam değiştirilerek, 37 ° C ve% 5 CO2 hücreleri geliştirin.
    4. 7 günlük bir kültürden, trans sonraAşağıda tarif edilen prosedür takip fect AF hücreleri.

5. Transfeksiyon iPS-AF Hücre Üretimi ve Kültür

Not: Fare AF hücreleri (PB-CAG-rtTA) transpozon plazmid transposaz sentezleme plasmidi (mPBase) ile birlikte ters tetrasiklin transaktivatör ile, PB-tetO2-IRES-OKMS transpozon plasmidi ile transfekte edilmiştir. Bütün plasmidler Profesör Andras Nagy 33 tarafından temin edilmiştir.

  1. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde: (2 ug toplam DNA), 0.5 mPBase ug ve 0.5 PB-CAG-rtTA ug PB-tetO2-IRES-OKMS 1 ug karıştırın.
  2. serumsuz ortam ile 100 uL (- DMEM Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı) DNA seyreltilir.
  3. (Plazmid DNA oranında 8 uL transfeksiyon ajanı 2 ug (DNA) transfeksiyon maddesi) (örneğin, Fugene) transfeksiyon reaktifi 8 uL ekleyin 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü ihtiva eden DNA'ya.
  4. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca transfeksiyon reaktifi / DNA karışımı inkübe edin.
  5. / Oyuk 2 mL'lik bir son hacme sahip fare AF hücreleri, 6 gözlü bir levhaya oyuk başına transfeksiyon reaktifi / DNA karışımı, 100 uL damla damla eklenir ve yavaşça döndürülerek dağıtın. 24 saat boyunca bekletin.
  6. Ertesi gün, doksisiklin 1.5 ug / mL (her bir oyuk için ortam, 2 mL) ile desteklenmiş taze iPS AF ortamı hücreleri beslenmesiyle Yamanaka en faktörleri (Oct4, Klf4 Myc'nin, Sox2) ekspresyonunu indükler.
  7. Taze Ortodoks içeren ortam (nokta 5.13 kadar doksisiklin ile desteklenmiş medya hücreleri korumak) ile, geçit olmadan, her gün hücreleri beslemek.
  8. MCherry ifade 24 saat içinde ve günlük koloni oluşumu (koloniler tipik transfeksiyon sonra 20 ile 30 gün arasında görünür) hücreleri gözlemleyin.
  9. Bir gün kolonisi seçmek önce, mitomisin C ile muamele edilmiş MEF ile 96 oyuklu bir doku kültür plakası hazırlanır.
  10. hacim usin 50 uL tek koloniler seçinga 200 uL pipetle ve tek tek oyuklara bir 96-çukurlu plaka sırayla transfer edin.
  11. Sonraki gün, ticari bir tripsin 50 ul ekleyerek tek hücre içine her koloni ayırmak ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edilir.
  12. koloni parçalara ayırma aşağı yukarı pipet ve.
  13. doksisiklin ile desteklenmiş taze iPS AF ortamın 100 uL dolu 96 oyuklu bir plaka kaplama% 0.1 jelatin ile etkisizleştirilmiş MEF ile yeni bir kuyuya ayrışmış koloniyi içeren tripsin başına 50 uL.
  14. Hücreler 60-70% konfluansa ulaştığında, 24 oyuklu plaka iyi ayrıldı.
  15. koloniler doksisiklin olmadan durumda da görünüp görünmediğini doğrulamak için iki kuyu, doksisiklin olmadan doksisiklin ile diğeri, 2: Hücreler% 60-70 izdiham ulaştığınızda, 1 ayrıldı.
  16. IPS-AF ortamında inaktive MEF üzerinde, doksisiklin bağımsız iPS-AF klonlar, korumaya devam ediyor.
  17. CH, 37 ° C ve% 5 CO2, hücreleri yetiştirmekgünlük orta Anging.

6. Alkalin Fosfataz Boyama

  1. doksisiklin, bağımsız iPS AF hücreleri görünümü olduğunda imalatçının protokolü takip alkalin fosfataz boyama gerçekleştirin.

7. İmmünofloresan

  1. Doksisiklin, bağımsız iPS AF hücreleri görünümü olduğu zaman, inaktive MEF ile 24 oyuklu plaka iyi 150.000 hücre / cm2, tohum ve 37 ° C'de ve% 5 CO2 seviyesinde 48 saat süre ile hücre büyür.
  2. (DİKKAT), oda sıcaklığında 15 dakika süreyle% 4 paraformaldehid (PFA) oyuk başına 300 ul ilave edilerek hücreler sabitleyin.
  3. % 0.1 NP-40 permeabilize hücrelerin 300 ul ekle.
  4. % 0.1, PBS-Tween 20 300 ul hücreleri durulayın.
  5. Oda sıcaklığında 1 st için bloke edici tampon (1 x PBS içinde% 10 at serumu) 300 ul ekle.
  6. (1:10 Oct4 (1:80), Sox2 (1:80), Klf4 (1:80), Nanog: Aşağıdaki primer antikorlar kullanın0) ve SSEA1 (1:80). % 1 sığır serum albümini (BSA),% 10 normal keçi serumu ile SSEA1 seyreltilir, 0.3 M glisin,% 0.1 PBS-Tween-20. 1 x PBS içinde% 10 at serumu ile diğer tüm antikorlar seyreltilir.
  7. 4 ° C'de bir gece antikorlar inkübe edin.
  8. % 0.1 PBS-Tween-20 300 ul ile durulayın.
  9. 1 x PBS içinde% 10 at serumu içinde seyreltilmiş sekonder antikor kullanarak: Alexa594 konjüge edilmiş keçi anti-fare IgG (1: 200), Alexa594 konjüge edilmiş tavuk anti-keçi IgG (1: 200), Alexa594 konjüge edilmiş, tavuk anti-tavşan IgG (1: 200), Alexa568-konjuge keçi anti-fare IgM (1: 200). Oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe edin.
  10. 1x PBS ile durulayın.
  11. 1x PBS: Hoechst çözeltisi (10.000 1) ile Leke çekirdekleri.

Vitro Hücre Farklılaşma 8.

  1. asılı damla embriyoid organları (EBS) oluşturmak için, farklılaşma ortamı kullanılarak, Petri kapağı üzerine (2.000 hücre / 20 ul) tek damla yetiştirmek.
  2. 37 ° C'de inkübe edin yemekler4 gün boyunca% 5 CO2.
  3. farklılaşma ortamında 3 gün süspansiyon kültüründe 100 mm bakteriyel dereceli tabaklara EBS aktarın.
  4. Başka bir 14 gün boyunca (DMEM içinde 1:10 oranında seyreltilmiş) bazal membran matris ile kaplanmış 24 oyuklu plakalarda ve plaka EBS.
  5. T (1: 100), αfp (1: 200) ile Tubb3 (1: 500) 37 immünofloresan analiz için, birincil antikorlar kullanır.

9. Vivo teratom oluşumu

  1. / - - Γc - / - farelerde Rag2 ve hindlimb kas içine 1 x 10 6 iPS-AF hücreleri içeren 1x PBS 100 ul enjekte edilir.
  2. 6 hafta Hücre enjeksiyonundan sonra servikal dislokasyon ile fareler kurban.
  3. Aşağıdaki analizler için farelerin hindlimb itibaren, kendi boyutuna göre ayırt tümör kitleleri, çıkarın.
  4. Bir Kriyostat kullanarak izopentan dondurulmuş tümör 7-10 mikron kalınlığında enine kesitler halinde kesilmiştir.
  5. Hematoksilen And Eozin (HE) Leke:
    1. Üreticinin protokolü takip edilerek, tümör dokusu yapısını değerlendirmek, HE ile leke.
  6. Immunoperoksidaz Leke için:
    1. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 4 PFA ile teratom bölümleri sabitleyin.
    2. % 0.1 Triton X-100 ile geçirgenliği.
  7. Aşağıdaki antikorlar ile inkübe: Tubb3 (1: 100), αfp (1:50) ile αSMA (1: 100), 1 x PBS içinde% 1 BSA içinde seyreltilmiştir. 1 (Tubb3 için), 37 ° C de saat ya da gece boyunca 4 ° C 'de (diğer antikorlar için) inkübe edin.
  8. 20 dakika% 100 metanol kullanılarak blok peroksidaz.
  9. 37 ° C'de 45 dakika süreyle inkübe HRP ile konjüge edilmiş (1: 150), ikincil antikor anti-fare.
  10. 1x PBS ile durulayın.
  11. 5 dakika boyunca peroksidaz (HRP) alt-tabaka (Malzeme Tablosu) kuluçkalayın.
  12. 5 dakika boyunca musluk suyu ile durulayın.
  13. 9 saniye Hematoksilen QS ile Leke.
  14. musluk suyuyla durulayın.

Hücreler 10. RNA Ekstraksiyonu

  1. İmalatçının tavsiye ettiği protokole göre, ticari bir RNA özütleme kiti kullanarak.

Teratom 11. RNA Ekstraksiyon

  1. örnek çözdürme önlemek için bir havan ve sıvı azot kullanılarak teratom homojenize edilir.
  2. Dokunun 25 mg tartılır.
  3. RNA ekstraksiyonu için ticari reaktif 1 mL kloroform 200 uL ekleyin.
  4. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
  5. 13.000 x g'de santrifüj ve 15 dakika boyunca 4 ° C.
  6. yeni bir tüpe süpernatant aktarın.
  7. RNA, imalatçının protokolüne göre, ticari bir RNA özütleme kiti kullanmak saflaştırmak için.

12. Ters Transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu Analizi

  1. Ters transkripsiyon (RT) -polymerase zincir reaksiyonu (PCR) ve oligo (dT) edi bir ters transkriptaz kullanılarak birinci sarmal cDNA sentezlemeüreticinin protokolüne Ding, 50 ng / cDNA uL elde edildi. 10 ng / ml arasında bir konsantrasyonda RNaz içermeyen su ile cDNA seyreltilir.
  2. RT-PCR 1 ng kullanılarak, üreticinin protokolüne uygun olarak DNA polimeraz kullanılarak gerçekleştirmek / cDNA uL.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

reprogramming kapasitesini değerlendirmek, fare AF hücreleri GFP farelerin fetusa toplanmıştır. Hücreler PB- (a doksisiklin indüklenebilir bir şekilde MCherry fluoresan proteine ​​bağlanmış Yamanaka faktörleri (Oct4, Sox2 Myc'nin ve Klf4) ifade dairesel transpozon plazmid PB-tetO2-IRES-OKMS, transfekte ve tetrasiklin transaktivatör tersine edildi CAG-rtTA) transposaz ifade plazmidi (mPBase) ile birlikte plazmidler. Fare AF hücreleri MEF besleyici tabakası üzerinde...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

pluripotensin indüksiyon elde etmek için seçilen yöntem, uzun vadeli transplantasyonu ile ilgili hücre, klinik güvenliği için geçerlidir. Günümüzde, yeniden programlama için uygun çeşitli yöntemler vardır. Bütünleştirici olmayan yöntemler arasında, Sendai viral (SeV) vektörü bulaşmış hücreler 40 çekirdeği içine entegre olmayan proteinin büyük miktarlarda üretmek ve iPS hücreleri elde etmek için bir strateji olabilir bir RNA virüsüdür. SeV vektörleri ötelem...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

This work was supported by CARIPARO Foundation Grant number 13/04 and Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza Grant number 10/02. Martina Piccoli, Chiara Franzin and Michela Pozzobon are funded by Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza. Enrica Bertin is funded by CARIPARO Foundation Grant number 13/04. Paolo De Coppi is funded by Great Ormond Street Hospital Children's Charity.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm Bacterial-grade Petri Dishes BD Falcon351029For in vitro differentiation
2-mercaptoethanol SigmaM6250For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Alexa568-conjugated goat anti-mouse IgM Thermo Fisher ScientificA21043Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated chicken anti-goat IgG Thermo Fisher ScientificA21468Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated chicken anti-rabbit IgG Thermo Fisher ScientificA21442Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated goat anti-mouse IgG Thermo Fisher ScientificA11005Secondary antibody (immunofluorescence)
Alkaline Phosphatase kit Sigma85L1Alkaline Phosphatase  staining
AmpicillinSigmaA0166For bacterial selection
Bovine Serum Albumin SigmaA7906BSA, for blocking solution. Diluted in PBS 1x
ChloroformSigmaC2432For RNA extraction
DH5α cellsThermo Fisher Scientific18265-017Bacteria for cloning procedure
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific41965039For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Doxycycline SigmaD9891For exogenous factors expression
Microcentrifuge tubes (1.5 ml) Sarstedt 72.706For PB production 
ES FBS Thermo Fisher Scientific10439024For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
FBS Thermo Fisher Scientific10270106For MEF medium
Fine point forcepsF.S.TDumont #5 AF isolation
GelatinJ.T.Baker131Used 0.1%, diluted in PBS 1x
GlycineBio-Rad161-0718For blocking solution. Diluted in PBS 1x
Haematoxylin QSVector LaboratoriesH3404Nuclei detection
HE Bio-Optica04-061010Histological analysis of teratoma
Hoechst Thermo Fisher ScientificH3570Nuclei detection
Horse Serum Thermo Fisher Scientific16050-122For blocking solution
HRP-conjugated goat anti-mouse IgGSantaCruzsc2005Secondary antibody (immunoperoxidase)
ImmPACT NovaRED Vector LaboratoriesSK4805Peroxidase substrate
Insulin syringe with needle (25 G)TerumoSS+01H25161Amniocentesis procedure
Klf4 SantaCruzsc-20691Rabbit polyclonal IgG
L-glutamine Thermo Fisher Scientific25030For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
LB broth (Lennox)SigmaL3022For bacterial growth
LIF SigmaL5158For mouse AF and iPS-AF cells medium
Matrigel BD354234For in vitro differentiation. Diluted 1:10 in DMEM
MethanolSigma32213Peroxidase blocking
MULTIWELL 24 well plateBD Falcon353047For in vitro differentiation
MULTIWELL 6 well plateBD Falcon353046For MEF, mouse AF and iPS-AF cells culture
Nanog ReproCELLRCAB0002P-FRabbit polyclonal IgG
Non-essential amino acids SigmaM7145For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Normal Goat SerumVector LaboratoriesS2000For blocking solution. Diluted in PBS 1x
NP-40Sigma12087-87-0For cell permeabilization. Diluted in PBS 1x
Oct4SantaCruzsc-5279Mouse monoclonal IgG2b
Oligo (dT) Thermo Fisher Scientific18418012For RT-PCR
Paraformaldehyde (solution)Sigma441244PFA, fixative, diluted in PBS
PBS 10xThermo Fisher Scientific14200-067D-PBS, free of Ca2+/Mg2+. Diluted with sterile water to obtain PBS 1x
Penicillin - Streptomycin Thermo Fisher Scientific15070063For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Petri Dish (150 mm)BD Falcon353025For MEF culture, tissue culture
PiggyBac transposase expression plasmid Provided by professor Andras Nagy laboratory-mPBase
PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS transposon plasmidProvided by professor Andras Nagy laboratory-PB-tetO2-IRES-OKMS
QIAprep Spin Maxiprep KitQiagen12663For plasmids purification
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106For plasmids purification
Reverse tetracycline transactivator transposon plasmid Provided by professor Andras Nagy laboratory-rtTA
RNeasy Mini Kit Qiagen74134For RNA extraction
Sox2 SantaCruzsc-17320Goat polyclonal IgG
SSEA1 Abcamab16285Mouse monoclonal IgM
SuperScript II Reverse Transcriptase Thermo Fisher Scientific18064-014For RT-PCR
T Abcamab20680Rabbit polyclonal IgG
Taq DNA PolymeraseThermo Fisher Scientific10342020PCR
Trypsin Thermo Fisher Scientific25300-054Cell culture passaging
Triton X-100Bio-Rad161-047For cell permeabilization, diluted in PBS 1x
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific15596-026For RNA extraction
Tubb3  Promega G712AMouse monoclonal IgG1
TWEEN-20SigmaP1379For cell permeabilization, diluted in PBS 1x
αfp   R&D SystemsMAB1368Mouse Monoclonal IgG1
αSMA Abcamab7817Mouse Monoclonal IgG2a
Transfection Reagent (FuGENE HD)Promega E2311For AF cells transfection
StereomicroscopeNikonSM2645To perform amniocentesis 
200 μl tipsSarstedt 70.760012To pick bacteria colonies
ScissorF.S.T14094-11 stainless 25UTo perform amniocentesis 
EthanolSigma2860To clean the abdominal wall of the pregnant dam
Tissue culture petri dish (150 mm) BD Falcon353025For MEF expansion
Mitomycin CSigmaM4287-2MGFor MEF inactivation
MULTIWELL 96 well plateBD Falcon353071For iPS-AF culture

Referanslar

  1. You, Q., et al. Isolation of human mesenchymal stem cells from third-trimester amniotic fluid. Int J Gynaecol Obstet. 103 (2), 149-152 (2008).
  2. Prusa, A. R., Hengstschlager, M. Amniotic fluid cells and human stem cell research: a new connection. Med Sci Monit. 8 (11), RA253-RA257 (2002).
  3. Ditadi, A., et al. Human and murine amniotic fluid c-Kit+ Lin- cells display hematopoietic activity. Blood. 113 (17), 3953-3960 (2009).
  4. Piccoli, M., et al. Amniotic fluid stem cells restore the muscle cell niche in a HSA-Cre, Smn(F7/F7) mouse model. Stem Cells. 30 (8), 1675-1684 (2012).
  5. Zani, A., et al. Amniotic fluid stem cells improve survival and enhance repair of damaged intestine in necrotising enterocolitis via a COX-2 dependent mechanism. Gut. 63 (2), 300-309 (2014).
  6. Rota, C., et al. Human amniotic fluid stem cell preconditioning improves their regenerative potential. Stem Cells Dev. 21 (11), 1911-1923 (2012).
  7. Mirabella, T., et al. Pro-angiogenic soluble factors from Amniotic Fluid Stem Cells mediate the recruitment of endothelial progenitors in a model of ischemic fasciocutaneous flap. Stem Cells Dev. 21 (12), 2179-2188 (2012).
  8. Mirabella, T., Cili, M., Carlone, S., Cancedda, R., Gentili, C. Amniotic liquid derived stem cells as reservoir of secreted angiogenic factors capable of stimulating neo-arteriogenesis in an ischemic model. Biomaterials. 32 (15), 3689-3699 (2011).
  9. Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
  10. Kim, J. A., et al. MYOD mediates skeletal myogenic differentiation of human amniotic fluid stem cells and regeneration of muscle injury. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 147(2013).
  11. Vadasz, S., et al. Second and third trimester amniotic fluid mesenchymal stem cells can repopulate a de-cellularized lung scaffold and express lung markers. J Pediatr Surg. 49 (11), 1554-1563 (2014).
  12. Turner, C. G., et al. Preclinical regulatory validation of an engineered diaphragmatic tendon made with amniotic mesenchymal stem cells. J Pediatr Surg. 46 (1), 57-61 (2011).
  13. Galende, E., et al. Amniotic Fluid Cells Are More Efficiently Reprogrammed to Pluripotency Than Adult Cells. Cloning Stem Cells. 12 (2), 117-125 (2009).
  14. Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Hum Mol Genet. 18 (22), 4340-4349 (2009).
  15. Ye, L., et al. Induced pluripotent stem cells offer new approach to therapy in thalassemia and sickle cell anemia and option in prenatal diagnosis in genetic diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (24), 9826-9830 (2009).
  16. Wolfrum, K., et al. The LARGE Principle of Cellular Reprogramming: Lost, Acquired and Retained Gene Expression in Foreskin and Amniotic Fluid-Derived Human iPS Cells. PLoS ONE. 5 (10), 137-138 (2010).
  17. Ye, L., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using site-specific integration with phage integrase. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19467-19472 (2010).
  18. Lu, H. E., et al. Selection of alkaline phosphatase-positive induced pluripotent stem cells from human amniotic fluid-derived cells by feeder-free system. Exp Cell Res. 317 (13), 1895-1903 (2011).
  19. Lu, H. E., et al. Modeling Neurogenesis Impairment in Down Syndrome with Induced Pluripotent Stem Cells from Trisomy 21 Amniotic Fluid Cells. Exp Cell Res. 319 (4), 498-505 (2012).
  20. Kobari, L., et al. Human induced pluripotent stem cells can reach complete terminal maturation: in vivo and in vitro evidence in the erythropoietic differentiation model. Haematologica. 97 (12), 1795-1803 (2012).
  21. Li, Q., Fan, Y., Sun, X., Yu, Y. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Amniotic Fluid Cells by Reprogramming with Two Factors in Feeder-free Conditions. J Reprod Dev. 59 (1), 72-77 (2012).
  22. Fan, Y., Luo, Y., Chen, X., Li, Q., Sun, X. Generation of Human β-thalassemia Induced Pluripotent Stem Cells from Amniotic Fluid Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette. J Reprod Dev. 58 (4), 404-409 (2012).
  23. Liu, T., et al. High efficiency of reprogramming CD34+ cells derived from human amniotic fluid into induced pluripotent stem cells with Oct4. Stem Cells Dev. 21 (12), 2322-2332 (2012).
  24. Jiang, G., et al. Human transgene-free amniotic-fluid-derived induced pluripotent stem cells for autologous cell therapy. Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).
  25. Drozd, A. M., et al. Generation of human iPSC from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system. Stem Cell Res Ther. 6 (122), (2015).
  26. Moschidou, D., et al. Human mid-trimester amniotic fluid stem cells cultured under embryonic stem cell conditions with Valproic acid acquire pluripotent characteristics. Stem Cells Dev. 22 (3), 444-458 (2012).
  27. Moschidou, D., et al. Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach. Mol Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).
  28. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  29. Mikkelsen, T. S., et al. Dissecting direct reprogramming through integrative genomic analysis. Nature. 454 (7200), 49-55 (2008).
  30. Sridharan, R., et al. Role of the murine reprogramming factors in the induction of pluripotency. Cell. 136 (2), 364-377 (2009).
  31. Knight, S., Collins, M., Takeuchi, Y. Insertional mutagenesis by retroviral vectors: current concepts and methods of analysis. Curr Gene Ther. 13 (3), 211-227 (2013).
  32. Fraser, M. J., Ciszczon, T., Elick, T., Bauser, C. Precise excision of TTAA-specific lepidopteran transposons piggyBac (IFP2) and tagalong (TFP3) from the baculovirus genome in cell lines from two species of Lepidoptera. Insect Mol Biol. 5 (2), 141-151 (1996).
  33. Woltjen, K., Kim, S. I., Nagy, A. The PiggyBac Transposon as a Platform Technology for Somatic Cell Reprogramming Studies in Mouse. Methods Mol Biol. 1357, 1-22 (2015).
  34. Wu, S. C., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (41), 15008-15013 (2006).
  35. Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
  36. Wang, W., et al. Chromosomal transposition of PiggyBac in mouse embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27), 9290-9295 (2008).
  37. Cadiñanos, J., Bradley, A. Generation of an inducible and optimized PiggyBac transposon system. Nucleic Acids Res. 35 (12), e87(2007).
  38. Bertin, E., et al. Reprogramming of mouse amniotic fluid cells using a PiggyBac transposon system. Stem Cell Research. 15 (3), 510-513 (2015).
  39. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  40. Fusaki, N., et al. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
  41. Nishishita, N., et al. Generation of virus-free induced pluripotent stem cell clones on a synthetic matrix via a single cell subcloning in the naive state. PLoS One. 7 (9), e38389(2012).
  42. Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PLoS One. 7 (8), e42855(2012).
  43. Yant, S. R., et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Mol Cell Biol. 25 (6), 2085-2094 (2005).
  44. Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. PiggyBac transposon-mediated gene transfer in human cells. Mol Ther. 15 (1), 139-145 (2007).
  45. Galvan, D. L., et al. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J Immunother. 32 (8), 837-844 (2009).
  46. Huang, X., et al. Gene transfer efficiency and genome-wide integration profiling of Sleeping Beauty, Tol2, and piggyBac transposons in human primary T cells. Mol Ther. 18 (10), 1803-1813 (2010).
  47. Meir, Y. J., et al. Genome-wide target profiling of PiggyBac and Tol2 in HEK 293: pros and cons for gene discovery and gene therapy. BMC Biotechnol. 11 (28), (2011).
  48. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  49. Filareto, A., et al. An ex vivo gene therapy approach to treat muscular dystrophy using inducible pluripotent stem cells. Nat Commun. 4 (1549), (2013).
  50. Darabi, R., et al. Human ES- and iPS-derived myogenic progenitors restore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophic mice. Cell Stem Cell. 10 (5), 610-619 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli imsel BiyolojiSay 120Amniyotik s v h creleriuyar lm pluripotent k k h crelerpiggyBac transpozonrejeneratif t pyeniden programlamafare

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır