Kryoschneiden von benachbarten Regionen eines einzelnen Maus Skelettmuskel für die Genexpression und histologische Analysen

Zusammenfassung

Aufeinanderfolgende Kryo-Abschnitte werden gesammelt, um histologische Anwendungen und Anreicherung von RNA für Genexpressionsmessungen mit benachbarten Regionen aus einer einzigen Maus Skelettmuskel ermöglichen. 30 mg gepoolt Kryoabschnitte und Messungen werden direkt im Vergleich über mehrere Anwendungen hinweg - Qualitativ hochwertige RNA wird aus 20 erhalten.

Zusammenfassung

Mit diesem Verfahren werden aufeinanderfolgende Kryoschnitte gesammelt beide Mikroskopieanwendungen für Gewebe Histologie und Anreicherung von RNA für die Genexpression zu ermöglichen, benachbarte Bereiche von einer einzigen Maus Skelettmuskel verwendet. Typischerweise wird es ausreichende Homogenisierung von kleinen Skelettmuskelproben zu erreichen, herausfordernd, weil Puffervolumen für die effiziente Schleifanwendungen zu gering sein kann, aber ohne ausreichende mechanische Störung, die dichte Gewebearchitektur der Muskelgrenzen Eindringen von Pufferreagenzien, was letztlich geringe RNA-Ausbeute. Durch Befolgen des Protokolls hier berichtet wird, 30 & mgr; m Abschnitte werden gesammelt und vereinigt Kryoschneiden und anschließende Homogenisierung Nadel ermöglicht, um mechanisch den Muskel zu stören, die Erhöhung der Oberfläche für die Puffer Eindringen ausgesetzt. Die primären Beschränkungen der Technik sind, dass es einen Kryostaten erfordert, und es ist relativ geringen Durchsatz. Allerdings können qualitativ hochwertige RNA aus kleinen Proben von gepoolten m erhalten werdenuscle Kryoschnitte, so dass dieses Verfahren zugänglich für viele verschiedene Skelettmuskeln und anderen Geweben. Darüber hinaus ermöglicht diese Technik angepasst Analysen (zB Gewebe Histopathologie und Genexpression) aus benachbarten Regionen eines einzelnen Skelettmuskel , so dass Messungen direkt im Vergleich über mehrere Anwendungen hinweg werden können experimentelle Unsicherheit zu reduzieren und replikative Tierversuche notwendig zur Quelle ein kleines Gewebe zu reduzieren für mehrere Anwendungen.

Einleitung

Das Ziel dieser Technik ist es, mehrere experimentelle Analysen von verschiedenen Modalitäten, wie Histologie und Genexpression, zugänglich von einem einzigen kleinen Skelettmuskel Quelle Gewebe zu machen. Mikroskopieanwendungen sind die empfindlichsten Konservierungsverfahren abzutasten, die sorgfältig während der Kryokonservierung kontrolliert werden muss, die Bildung von Eiskristallen Artefakte zu begrenzen. Somit wird der Methodenentwicklung auf der Grundlage der tibialis anterior (TA) gefroren Muskel teilweise mit Einbettungsharz in einer -140 ° C mit flüssigem Stickstoff gekühlt 2-methylbutan-Bad als Ausgangsmaterial sowohl für die Mikroskopie Immunofluoreszenz abgedeckt und Genexpressionsanalyse.

Die Notwendigkeit, die gleiche Ausgangsmaterial für verschiedene technische Ansätze zu verwenden, ist besonders wichtig für die intramuskuläre Injektion basierende Experimenten, wo die linke und rechte Muskeln verschiedenen Bedingungen darstellen, eine Versuchs- und eine Kontroll. Zum Beispiel in der Muskelregeneration Studien, eine muscle ist mit einem Toxin injiziert weit verbreitete Gewebeschädigung zu verursachen , während der kontralateralen Muskel dient als Vehikel-injizierten Kontroll ^1. In ähnlicher Weise Störungen Studien der Gentherapie für die Muskel beginnen in der Regel mit Validierung des Gentherapievektor durch intramuskuläre Injektion mit leerem Vektor verglichen werden, nicht verwandten Vektor oder Fahrzeugsteuerung auf der Gegenseite ^2. Daher ist es nicht möglich, jeden TA Muskel zu einer anderen Anwendung beziehen.

Gemeinsame Strategien mit diesem Thema befassen, sind: i) eine andere Muskelgruppe für jede Anwendung zu verwenden, ii) zusätzliche Mäuse zu verwenden, oder iii) für jede Anwendung ein Stück des Muskels abzuschneiden. Allerdings erhebliche Unterschiede zwischen den Muskelgruppen machen es schwierig, Daten aus separaten Anwendungen zu vergleichen und weiteren Tieren erhöhen Kosten und sind schlecht gerechtfertigt, wenn andere Alternativen gibt. Die Aufteilung der Muskel nach der Sektion verschiedenen Anwendungen zu beziehen ist die beste Option in vielen Fällen. Jedoch sind die Muskelstücke oft zu klein für die Homogenisierung ^2-5 Pulverisierung unter flüssigem Stickstoff oder mechanische Schleiftechniken zu verwenden. Muskel führt ein hochStrukturGewebe gepackt mit extrazellulären Matrix und kontraktilen Proteine, unzureichende mechanische Homogenisierung zu einer geringen Ausbeute an nachfolgende DNA, RNA oder Protein. Das Verfahren detailliert hier können kleine Mengen von Gewebe aus einer Hand Muskel für den Einsatz in vielfältigen Anwendungen, und die Einbeziehung von Kryoschneiden und Nadel Verreiben verbessert mechanische Homogenisierung für eine bessere RNA-Ausbeute.

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Protokoll

Alle Tier Verfahren wurden von der University of Georgia Institutional Animal Care und Use Committee unter Verwendung von Tieren Protokoll A2013 07-016 (Beedle) zugelassen.

1. Kryokonservierung von Unfixierte Skelettmuskel

1. Vorbereitung
   1. Schneiden Kork in kleine Quadrate (ca. 1 cm x 1 cm) mit einer Rasierklinge, schreiben auf den Korken mit einer feinen Spitze Marker, der an 2-Methyl resistent ist, die Quelle Maus und Muskel zu identifizieren, und machen einen sehr flachen Schnitt (ca. 1 mm) über die obere Oberfläche. Legen Sie eine Kunststoff-Deckglas in den Schnitt zur Ausrichtung des Gewebes zu verwenden. Wiederholen, bis ein Korken bereit ist, für jedes Gewebe kryokonserviert werden.
   2. Erhalten flüssigem Stickstoff, 2-Methyl, Einbettmittel, Tieftemperatur-Thermometer, Korken, Dissektionswerkzeuge und Studie Maus.
      ACHTUNG: Flüssiger Stickstoff ist ein komprimiertes Gas , das bei Erhitzen explodieren können. Laborkittel, Tieftemperatur-Handschuhe und Gesichtsschutz beim Umgang mit flüssigen nitrogen; Kontakt mit der Haut oder den Augen kann zu Verbrennungen oder Erfrierungen verursachen. 2-Methyl ist eine entzündlich, giftig, Gesundheits- und Umweltrisiko dar . Persönliche Schutzausrüstung tragen (Laborkittel, Handschuhe, Schutzbrille), öffnen Sie den Vorratsbehälter in einem Abzug, übertragen die kleine Menge, die für das Einfrieren (in der Regel 200 bis 400 ml) in einen separaten Behälter, der dicht verschlossen werden kann, und zur Vermeidung von Inhalation .
   3. Euthanize Mäuse mit einer genehmigten Methode der Sterbehilfe unter Narkose. Kurz gesagt, mit 2,5% Isofluran in Sauerstoff aus einem Isofluran Verdampfer mit der Maus in eine Inhalationskammer einlegen, warten Sie, bis 20 Sekunden nach der Maus für ein Pedal Reflex zu überprüfen nicht mehr bewegt. Wenn das Pedal reflex negativ ist, euthanize die Studie Maus durch zervikale Dislokation ^6.
      HINWEIS: Euthanasie Methoden bedürfen der Zustimmung des institutionellen Ethikkommission.
   4. Entfernen Sie die Haut des distalen hindlimb darüber liegenden und schneiden Sie die distalen vorderen Sehnen knapp über dem Knöchel fein Punkt dissection Schere. Fassen Sie die distalen Sehnen mit einer feinen Pinzette und sanft nach oben ziehen und in Richtung der Knie während seitliche Faszie Schneiden des Muskels zu lösen. Ziehen Sie den Muskel aus senkrecht vom Knie und machen einen endgültigen Schnitt des TA - Muskel ⁷ auszuschneiden.
      HINWEIS: Der Muskel TA wird hier verwendet als ein Beispiel, aber jede Maus Skelettmuskel oder das Herz kann des Benutzers Versuchsziele gegebenenfalls in diesem Protokoll für die TA ersetzt werden. Die einzige Einschränkung ist, dass ein Gewebe klein genug sein muss, schnelle Kryokonservierung über seine gesamte Tiefe zu erreichen; eine maximale Gewebe Größe von 1 cm x 1 cm wird empfohlen.
   5. Wiederholen Sie auf dem anderen Bein und sezieren heraus alle anderen Gewebe gesammelt werden. Führen dissection so schnell wie möglich Gewebeabbau vor der Kryokonservierung zu begrenzen.
   6. Orient jeder Muskel für Querschnitte auf seiner voretikettierten Kork. Stellen Sie die Muskel senkrecht zu den Korken mit dem distalen Sehne berührt den Korken und die Spitze des Muskels extweg, aufrecht gehalten durch das Deckglas endet.
   7. Kryokonservierung alle Gewebe für die histologische Analyse so bald wie möglich nach der Sektion, vorzugsweise innerhalb von 5 min, aber auf jeden Fall nicht mehr als 15 min verstrichene Zeit seit Euthanasie der Quelle Tier.
2. Kryokonservierung
   1. Beginnen Sie mit der Kryokonservierung Bad fünf Minuten vor dem Ende der Dissektion Abkühlung. Pour 2-methylbutan in einen offenen Metallbecher bis zu einer Tiefe von etwa 3 cm. Gießen von flüssigem Stickstoff in einen isolierten Behälter mit einer Tiefe von 2 bis 4 cm. Stellen Sie das Becherglas von 2-Methylbutan in den flüssigen Stickstoff; der Stickstoff zu kochen beginnt. Vermeiden Stickstoff Spritzwasser in das 2-Methyl Becher.
      ACHTUNG: Bereiten Sie in einem Abzug oder einem gut belüfteten Bereich Einfrieren Bad.
   2. Legen Sie eine Niedertemperatur-Thermometer in die 2-Methyl Temperatur zu überwachen und häufig mit einer Gabel umrühren, um sicherzustellen, gleichmäßige Kühlung. Weiter rühren und abkühlen, bis 2-methylbutane erreicht -140 ° C, das Hinzufügen neuer flüssigem Stickstoff zu dem äußeren Bad wie nötig.
      HINWEIS: -140 ° C ist die optimale Temperatur Eiskristall Artefakte in quergestreiften Muskulatur zu minimieren; andere Gewebe bei verschiedenen Temperaturen Kryokonservierung besten (beispielsweise Gehirn, -90 ° C).
   3. Einbettungs Harz nur auf den unteren 35 - 50% des Muskels, wo er den Korken trifft und fallen sofort den Korken in die 2-Methyl bei -140 ° C. wiederholen sich schnell bis zu 8 Geweben pro freeze Charge. Rühre 30 sec, den Boden des Bechers Abkratzen, um sicherzustellen, dass Gewebe nicht einfrieren in das Verfestigen 2-methylbutan.
   4. Mit einer Gabel, Löffel oder geschlitzt große Zange jedes Gewebe Korken aus der 2-Methyl zu ziehen. Schnell das Deckglas zu entfernen, überschüssige 2-Methyl in den Becher, und dann fallen die Gewebe Kork in den äußeren Stickstoff Bad abtupfen. Wiederholen Sie dies für den restlichen Korken in den Becher.
   5. Transfer-Proben in flüssigem Stickstoff oder auf Trockeneisein -80 ° C Gefrierschrank für die Lagerung.
   6. Wenn irgendwelche Gewebe für die Kryokonservierung bleiben, wiederholen Sie die Schritte 1.2.3 bis 1.2.4. Fügen Sie zusätzliche 2-Methyl dem Becher oder flüssigem Stickstoff auf dem äußeren Bad als notwendig und wieder kühl bis -140 ° C. Entsorgen Sie die 2-Methyl als gefährlicher Abfall eingestuft.

2. Sammeln Cryoschnitte für Histologie und RNA-Anwendungen

1. Vorbereitung.
   1. Pre-wiegen eine DNase / RNase-freie autoklaviert Rohr auf einer Analysenwaage. Dann bewegen sie in die Kryostatkammer vorzukühlen. Wiederholen, bis Rohre bereit sind, für alle zusammengefasste Kryoschnittes Proben gesammelt werden.
   2. Für Skelettmuskel-Schnitte, bestätigen, dass die Kryostatkammer Temperatur -21 bis -22 ° C durch seinen internen Thermostat ist. Übertragen keine Behälter mit Gewebe geschnitten in die Kammer zu ermöglichen, und der Behälter (s) mindestens 15 min vor dem Öffnen zu dem Kryostaten Temperatur äquilibrieren.
   3. Legen Sie eine neue Einweg-Kryostaten Klinge. Alternativ entfernen Sie das vorhandene Klinge, Spray mit RNase Dekontaminationslösung, Spülen mit ddH ₂ O, und setzen Sie sie wieder in den Kryostaten zu kühlen. Sprühen Sie einen sauberen Tuch mit 70% Ethanol und vorsichtig die Klinge und Klingenklemm Plattform wischen.
      1. Spray ein sauberes Gewebe mit einer RNase Dekontaminationslösung und wischen Kryostaten Bürsten. Sprühen Sie ein Gewebe mit ddH ₂ O, reinigen Sie die Bürsten wieder und stellte sie in der Kryostatkammer auf eine saubere Oberfläche.
         ACHTUNG: Der Kryostat Klinge sollte durch den Messerschutz abgedeckt werden , wenn sie nicht in Gebrauch ist . Auch RNase Dekontaminationslösung ist giftig und friert einen Niederschlag in der Kälte Kryostatkammer zu bilden. Deshalb vorsichtig und seine Verwendung in der Kryostatkammer vermeiden.
   4. Innerhalb der Kryostatkammer, legen Sie einen Dime-Größe Tropfen (etwa 300 ul) des Harzes auf eine warme Probe chuck Einbettung, setzen Sie ein Gewebe Korken auf dem Harz, nach unten drücken, und legen Sie das Futter in den freezing Schiene oder auf ein Schnellgefrierelement, falls vorhanden.
   5. Nach dem Einbetten Harz verfestigt (weiß), fügen Sie zusätzliche Einbettung Harz auf dem Kork, um den unteren 35% des Gewebes und drücken Sie die Wärme-Extraktor in das Einbettmittel für ein schnelles Einfrieren besser in das Gewebe zu stabilisieren. Warten Sie 5 Minuten vor dem Schneiden das Harz zu ermöglichen, vollständig zu härten.
   6. Sicherzustellen, dass der Probenklammer in seiner am weitesten zurückgezogenen Position befindet, die am weitesten von der Klinge. Legen Sie die Gewebeprobe Futter in die Objektklammer.
2. Kryoschnittes Vorbereitung.
   1. Lösen Sie die Messerträgerhalter, stellen Sie den Freiwinkel des Messers auf 10 ° (oder einem Winkel geeignet für den Messerträger verwendet wird), und wieder anziehen. Lösen Sie die Bremse und drehen Sie das Handrad den Muskel zur Klinge zu senken. Schätzen Sie den kürzesten Abstand zwischen dem Gewebe und Klinge, bewegen sich dann das Gewebe von der Klinge weg und greifen Bremse das Handrad.
   2. Lösen Sie die Höhenverstellung lever und bewegen den Klingenträger nach vorne oder hinten, beziehungsweise, wenn das Ende des Gewebes mehr als etwa 2 mm von der Klinge oder der Klinge trifft auf das Gewebe. Ziehen Sie und senken Sie wieder das Gewebe Abstand zu prüfen, von der Klinge. Wiederholen Anpassungen bis die Klinge 1 bis 2 mm von dem Ende des Gewebes durch visuelle Schätzung.
   3. Senken Sie das Gewebe in Richtung der Klinge und beurteilen Gewebe Winkel für Querschnitte. Verriegeln Sie das Handrad und lassen Sie die Probe Klemmhebel. Schieben der Probenklammer nach links oder rechts, bis die horizontale Ausrichtung des Gewebes an der Klinge senkrecht.
   4. Schieben Sie die Objektklammer nach oben oder unten die "y" Ausrichtung anzupassen, so dass Gewebeschnitte senkrecht zur Längsachse des Muskels sein wird. Ziehen Sie die Probe Klemmhebel.
   5. Verwenden Sie die Grob- und Feinvorschub die Probe zu fördern, bis sie gerade die Klinge berührt. Sofern Teile aus einem bestimmten Gewebetiefe zu suchen, setzen Sie die Summe der Schnittdicken auf Null (Spitze des Gewebes).
   6. Stellen Sie den Kryostaten auf die Trimm-Funktion mit Schnittdicke bei 30 & mgr; m. Schneiden Sie und verwerfen Abschnitte , bis die vorgewählte Tiefe für die Gewebesammlung erreicht wird (zB 400 & mgr; m von oben).
3. Sammeln Sie Kryoabschnitte für die RNA-Extraktion.
   1. Öffnen Sie das Rohr zum Sammeln Abschnitte und legen Sie sie in der Nähe des Messerträgers. Verwenden Sie eine vorgekühlte, sauberen Pinsel jeden Abschnitt zu holen, wie sie von der Klinge und übertragen die Kryoschnittes in das Rohr geschnitten wird. Wiederholen, bis die vereinigten Abschnitte 30 mg wiegen oder die gewünschten Gewebetiefe erreicht ist.
      HINWEIS: Für einen erwachsenen Maus tibialis anterior, Sammlung von Gewebetiefe von etwa 400 bis 4000 & mgr; m ergibt typischerweise 25 - 40 mg. Mit Metallzange zu übertragen Abschnitte mit dem Sammelrohr wird nicht empfohlen, da die Abschnitte auf der Metalloberfläche zu haften und verklumpen neigen.
   2. Wenn Einbettmittel den Muskel Kryoschnittes umgibt, sperren Sie die Handbremse und die Verwendung einer Rasierklingekleine Stücke von Harz abrasieren, bis nur noch eine dünne Schicht um die Spitze des Muskels ist. Schneiden Sie immer Harz mit der Klinge weg abgewinkelt vom Muskel.
      HINWEIS: Eine dünne Schicht Harz der Einbettung im Wesentlichen nicht die Downstream-RNA-Präparation beeinträchtigen. Wenn dickere Einbettmittel vorhanden ist, verwenden Sie Pinsel, die er aus dem Muskel weg zu necken, bevor Sie die Kryoschnittes in das Sammelrohr bewegt.
   3. Alternativ Pool Abschnitte auf der Messerträger und die Übertragung in der Masse zu dem Sammelrohr.
      HINWEIS: Jedoch neigt diese Methode langsamer zu sein, und die Abschnitte sind eher zusammenkleben und verklumpen, was die Effizienz der Nadel Homogenisierung in späteren Schritten zu reduzieren.
   4. Schnell stellen die gepoolten Kryoschnittes Rohr in einer Analysenwaage und Rekordrohr Gewicht. Unmittelbar senden Sie das Rohr mit dem kalten Kryostaten Kammerabschnitt Temperatur nahe -20 ° C zu halten. Berechnen des Gewichts der vereinigten Abschnitte.
      HINWEIS: Wenn die RNA-Isolierung auf Anzeige auftretenifferent Tag, speichern Sie die gepoolten Kryoschnittes Rohr bei -80 ° C bis zur Verwendung.
4. Sammeln Sie Kryoabschnitte für die Histologie.
   1. Drücken Sie die Schnittdicke Knopf für die Feinschneide und Verwendung Pfeile, um die Kryostatschnitt Dicke auf 7 & mgr; m (oder einem anderen geeigneten Schnittdicke, in der Regel 6 bis 10 & mgr; m).
      HINWEIS: dünneren Abschnitten (6 bis 10 um) sollte für die histologische Anwendungen verwendet werden, dass Färbereagenzien sicherstellen kann die Tiefe des Gewebeschnittes durchdringen. Dünne Schnitte können aus jeder Tiefe während der Kryoschneiden genommen werden, aber tiefere Abschnitte werden bevorzugt, da Harz einbetten, die mit Gewebetiefe erhöht, nicht histologischen Färbung nicht beeinträchtigt.
   2. Schneiden Sie und verwerfen 4 bis 7 Abschnitte eine konsistente, auch Gewebeoberfläche zu erhalten. Notieren Sie sich die Gewebetiefe.
   3. Geschnitten, um einen Abschnitt und richten sie auf der Oberfläche des Klingenträgers. Nehmen Sie den Abschnitt durch schnell und sanft eine warme (Raumtemperatur) Mikroskop-Objektträger zu berührenauf den Abschnitt auf dem Messerträger. Bringen Sie den Schieber auf Raumtemperatur. Fortgesetzt, bis die Anzahl der gewünschten Folien erhalten wird. Notieren Sie sich die endgültige Gewebetiefe.
      HINWEIS: eine zweite (duplicate) Abschnitt für jedes Gewebe Sammeln empfohlen.
   4. Mit sectioning abgeschlossen ist, greifen in die Hand Radbremse, kehren die Probe in die hinterste Position, und das Gewebe Futter entfernen. Verwenden Sie den Kryostaten Wärmeelement das Einbetten von Harz zu schmelzen, das Gewebe Korken auf dem Proben Futter zu halten. Entfernen Gewebe Kork, trocken mit Gewebe, und zurück zur Lagerung.
   5. Wiederholen von Schritt 2.1.2 für jede verbleibende Gewebe. Erlauben Folien für 20 min zum Trocknen nach der letzten Gewebe angebracht ist. Verwenden Sie dann Dias für die histologische oder Immunfluoreszenzanfärbung oder Einfrieren bei -80 ° C in einer Dia-Box, bis sie benötigt.

3. RNA-Isolierung aus gepoolten Cryoschnitte

1. RNA-Extraktion
   1. Verschieben Röhre (n) von gepoolten Kryoabschnitte auf Eis. Sofort im einorganischen RNA Extraktionsreagenz in einem Verhältnis von etwa 1 ml pro 50 mg Reagenz Kryoschnitt Gewicht, typischerweise 600 & mgr; l pro Röhrchen.
      ACHTUNG: RNA - Isolierung Reagenzien sind giftig, ätzend und reizend. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers zum sicheren Umgang.
   2. Unter Verwendung einer 1-ml-Spritze mit einer 18-Gauge-Nadel, ziehen die Flüssigkeit nach oben RNA-Extraktion und spülen Sie die Wände des Rohres, bis alle Gewebe in der Lösung suspendiert wird. Versuchen Sie, um Luftblasen während Nadel Homogenisierung minimieren.
   3. Verwenden Sie die Spitze der Nadel zu zerdrücken und zu zerstreuen alle verklumpten Kryoabschnitte und Stücke an der Rohrwand haften. Man reibt zu homogenisieren von fünf Strichen die Probe nach oben und unten durch die Nadel vorbei, und dann die Probe auf Eis zurückzukehren. Wiederholen sowohl die Schritte drei bis fünfmal oder so oft wie notwendig ist, alle Klumpen zu stören und die Probe leicht durch die Nadel passieren.
   4. Entfernen Sie die 18-Gauge-Nadel und ersetzen sie durch eine 22-Gauge-Nadel. sorgfältig triturate die Probe für fünf Schläge, und kehren dann die Probe auf Eis. Wiederholen Sie die Verreiben drei bis vier Mal eine sehr fein dispergierte Gewebehomogenat zu erreichen.
      HINWEIS: Wenn Gewebepartikel beginnen die Nadel zu blockieren, wenn die Probe Ausarbeitung vertreiben alle Probe aus der Spritze und wechseln Sie wieder auf die 18-Gauge-Nadel für weitere Homogenisierung. Eine zusätzliche Verreibung Schritt mit einer 25 oder 26 Gauge-Nadel zugesetzt werden maximale Ausbeute zu erhalten. Jedoch kann die Nadel verstopft werden, so besteht die Gefahr der Probe Verschütten ist.
   5. Bewegen Sie die Probe aus Eis auf Raumtemperatur. Inkubieren Sie für 5 min auf molekulare Komplexe unterbrechen.
   6. In einem Abzug mit 0,1 ml 1-Brom-3-chlorpentan (BCP) pro 1 ml RNA-Isolierung Reagenz verwendet (Schritt 3.1.1), typischerweise 60 & mgr; l pro Röhrchen. Das Röhrchen wird kräftig von Hand für 15 Sekunden (nicht vortexen). Inkubieren der Probe bei Raumtemperatur für 2 bis 3 min. Anschließend zentrifugieren für 15 min bei 12.000 xg und 4 ° C.
      VORSICHT: BCP ist brennbar und giftig. Griff in einer Abzugshaube und Handschuhe tragen, einen Laborkittel und Schutzbrille.
   7. sammeln Sie vorsichtig die obere wässrige Phase (farblos), die RNA und übertragen sie in ein sauberes Röhrchen. Fügen Sie ein gleiches Volumen von 70% igem Ethanol (in DEPC-Wasser) und Wirbel zu mischen. Inkubieren bei Raumtemperatur für bis zu 10 min.
      HINWEIS: das mittlere und untere Zwischenphasen Phenol-BCP Phasen können für die genomische DNA und Protein verarbeitet werden, jeweils entsprechend den Anweisungen des Herstellers oder in einem Phenol-BCP gefährlichen Abfallbehälter zur Entsorgung gesammelt.
2. RNA-Reinigung.
   1. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers für die Proben Bindung, Waschen und Elution mit geringfügigen Abweichungen ^8. Beispielsweise:
   2. Einen aliquoten Teil DNase / RNase-freies Wasser in einem 37 ° C Bad oder Inkubator Vorwärmen für Schritt 3.2.4.
   3. Fügen Sie die RNA-Probe von oben 3.1.8 zu einer Reinigungskolonne und Zentrifuge die Probe für 15 Sekundenbei 12.000 xg bei Raumtemperatur. Gießen der Strömung durch wieder in der gleichen Spalte und wieder zentrifugiert. Wiederholen Sie ein weiteres Mal RNA-Bindung, zu maximieren und dann die endgültige Fluss durch verwerfen.
   4. Führen Waschschritte gemäß den Anweisungen des Herstellers ^8. Bewerben 700 & mgr; l Waschpuffer (kein Ethanol) auf die Säule, Spin für 15 Sekunden bei 12.000 · g, und entsorgen Sie die Strömung durch.
   5. In 500 ul Waschpuffer (mit Ethanol) auf die Säule, Spin für 15 Sekunden bei 12.000 · g, und entsorgen Sie die Strömung durch. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
   6. Drehen Sie die leere Säule für 1 min bei 12.000 xg um die Membran zu trocknen.
   7. Übertragen Sie die Spin-Säule auf eine saubere RNase-, DNase-freie Röhrchen. In 40 ul vorgewärmtes DNase / RNase-freies Wasser (von 3.2.1) in die Mitte der Säule Membran. Bei Raumtemperatur inkubieren für 2 min und dann für 2 min bei 12.000 x g zentrifugieren.
      HINWEIS: Die 40 & mgr; l Elutionsvolumen beträgt etwa 1,3 & mgr; l pro mg ursprünglichenGewebe für 30 mg gepoolt Kryoabschnitte. Stellen Sie die Elutionsvolumen als geeignet für unterschiedliche Ausgangsgewebegewichte, aber nicht reduzieren unter 32 & mgr; l. Eine zweite Elution unter Verwendung von etwa 0,7 & mgr; l pro mg des ursprünglichen Gewebes kann Gesamt-RNA Ausbeute zu erhöhen hinzugefügt werden.
   8. Analyse der RNA (Säulenelution) für die Konzentration und Reinheit durch ein Spektrophotometer, Elektrophorese und / oder einem Bioanalyzer. Lagern Sie die RNA bei -80 ° C bis zum Downstream - Anwendungen benötigt werden , wie zum Beispiel die reverse Transkription für quantitative PCR - ^4.
      HINWEIS: Eine DNase-Behandlung wird empfohlen, vor der RNA in Downstream-Anwendungen verwendet wird. Diese Behandlung kann bei einigen RNA Reinigungssäulen vor dem Waschschritt durchgeführt werden, an diesem speziellen Punkt folgende Säulenelution, oder auf einem Aliquot der RNA als ersten Schritt in jedem Downstream-Anwendung. Die RNA sollte für mehrere Jahre stabil sein.

4. Die histologische Analyse von Immunofluoreszenz Staining Muscle Cryoschnitte

1. Einfache Immunofluoreszenz-Protokoll.
   1. Verwenden Sie einen hydrophoben Stift, um die Gruppe von Abschnitten auf jeder Folie zu umkreisen. PBS in den eingekreisten Bereich (ca. 80 & mgr; l für eine kleine Fläche von bis zu 500 & mgr; l für eine große Oberfläche) vorsichtig fallen, darauf achten, daß das Gewebe zu berühren. Inkubieren für 5 min bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Wenn gefrorene Folien verwenden, entfernen Sie Dias von -80 ° C Gefrierschrank und Inkubation bei Raumtemperatur für 20 bis 30 min und trocken auftauen, dann weiter wie oben. Mindestens zwei Folien benötigt werden: ein experimentelles Folie in primären und sekundären Antikörper inkubiert werden; und ein Steuerschieber, für den primären Antikörper ist ausgeschlossen, die "sekundäre nur" Kontrolle.
   2. Tipp der Folie abgießen PBS. In 5% Eselserum in PBS (Blocking-Lösung) auf den eingekreisten Bereich; vorsichtig sein, um sicherzustellen, dass die Muskelpartien nicht austrocknen. Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 min (oder bis zu mehreren Stunden in einer Feuchtigkeitskammer).
   3. Bereiten primären Antikörperlösung zur Muskelregeneration zu analysieren. Mischungsblockierungslösung, mit einem EMHC Antikörper (01.40) und einem ColVI Antikörper (1: 1000). Bereiten Sie etwa 150 & mgr; l, 300 & mgr; l oder 500 & mgr; l für kleine, mittlere oder große Gleitflächen sind. Rührers 5 sec und dann zentrifugieren für 2 min bei 15.000 xg jede Präzipitat zu pelletieren.
   4. Für experimentelle Rutschen, kippen Sie die Folie blockiert Lösung abgießen und dann primären Antikörperlösung aus 4.1.3 hinzuzufügen. Für die Sekundärsteuerschieber, kippen Sie den Schiebe Lösung abgießen blockiert und dann frisch Blockierungslösung (kein Antikörper) hinzufügen. Inkubiere Objektträger in einer feuchten Kammer bei 4 ° C über Nacht.
      HINWEIS: Wenn Folien Pipettieren Antikörperlösungen auf, immer Flüssigkeit von der Oberseite der primären Antikörperlösung Rohr ziehen, stören keine Niederschlag am Boden des Röhrchens.
   5. Tipp gleitet Lösung abgießen. In PBS tropfenweise zu dem eingekreisten Bereich jeder Folie zu waschen, Spitze zu gießenab, dann mehr PBS hinzufügen und für 3 bis 5 min inkubiert. Wiederholen für insgesamt drei Waschungen.
      HINWEIS: Die Waschzeit sehr flexibel ist und kann bei Bedarf auf 20 min verlängert werden. Im Allgemeinen ist die Anzahl der Lösung ändert wichtiger als die Zeit.
   6. Bereiten Sie sekundäre Antikörperlösung für alle Folien (einschließlich der sekundären Steuerschieber) unter Verwendung einer 1: 500 Verdünnung von roten und grünen Fluorophor-gekoppelten Sekundärantikörper Maus IgG1 (EMHC) und Kaninchen-IgG (ColVI) und 1 zu erkennen: 10.000 Verdünnung von DAPI Kern Fleck.
      1. Zum Beispiel mit 9 ul ddH ₂ O zu 1 ul DAPI mischen , um eine Verdünnung von 1:10 von DAPI machen. Dann wird für einen 500 & mgr; l Endvolumen, fügen Sie 1,0 & mgr; l anti-Maus-IgG1-red + 1.0 & mgr; l anti-Kaninchen-IgG-green + 0,5 & mgr; l von 1:10 DAPI zu 447,5 & mgr; l Blockierungslösung. Vortex mischen und Zentrifuge für 2 min bei 15.000 xg jeden Niederschlag zu pelletieren.
         HINWEIS: Im Idealfall alle Sekundärantikörper sollte aus den gleichen Wirtsspezies sein.
   7. Tipp die Folien die letzte PBS waschen abgießen. In sekundären Antikörper-Lösung alle Gewebe zu decken. Decken Sie die Dias sie vor Licht zu schützen und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
      HINWEIS: Alle Sekundärantikörper sollten validiert werden mit anderen Arten in der dualen Markierungsexperimenten minimale Kreuzreaktivität zu haben.
   8. Waschen Sie die Objektträger wie in 4.1.5 beschrieben. Nach der letzten Waschung, Zünglein an der Folie, um die PBS abgießen und die Folie auf einem Gewebe festgelegt. Hinzufügen von 3 bis 4 Tropfen einer wässrigen Befestigungsmittel entlang einer Seite.
   9. Stellen Sie den Rand eines Deckglas nur auf die Außenkante der Befestigungsmittel. Mit einer Pinzette, senken Sie langsam das Deckglas auf den Geweben, dann lassen Sie die Deck und vorsichtig in die richtige Position zu erschließen. Schließlich sanft jede Ecke des Deckglases drücken es zu stabilisieren.
   10. Schützen Sie die Folien aus Licht und lagern bei 4 ° C bis zur Verwendung.
       HINWEIS: Für die Langzeitlagerung, eine dünne Schicht Nagellack entlang der Kante des the Deckglas, um die Folie vor dem Austrocknen zu verhindern.
2. Histologische Auswertung.
   1. Bild die Dias ein epifluoreszenten oder konfokalen Mikroskop mit geeigneten Filtern mit EMHC (rot) zu erfassen; ColVI (grün); und DAPI-gefärbten Zellkernen (blau), typischerweise ein 20x - Objektiv ^1,5 verwendet wird .
   2. Bestätigen Sie, dass das Fluoreszenzsignal aus experimentellen Dias von der sekundären Steuerschieber unterschiedlich ist die Spezifität des EMHC und ColVI Erkennung ⁴ zu demonstrieren.
      HINWEIS: EMHC positive regenerierende Fasern sollte sich von ca. 2 bis 7 Tage nach einer Muskelverletzung und variabel bei Mäusen mit Muskeldystrophie sichtbar sein. Collagen VI ist in der extrazellulären Matrix umgebenden Muskelfasern, Blutgefäße und Nerven und in den größeren Bindegewebsbündel von peri- und Epimysium. DAPI Kernfärbung ist nützlich Muskelfasern mit zentralen Kernen gegenüber peripheren Kerne Regeneration anzeigt Faser zu erkennen und das Vorhandensein von infiltrating Zellen. Nekrotische oder verletzten Fasern aufgrund Erkennung Fleck schwach von endogenem IgG mit dem Maus-IgG-Sekundärantikörpers kann, die die Fasern durch beschädigte Muskelmembranen eindringt.
   3. Zur Quantifizierung der Regeneration nehmen überlappende Mikroskop Bilder mit jeder Fluoreszenzfilter über das gesamte Bild. Führen Sie die EMHC, ColVI und DAPI Bilder für jeden Standort und dann die Bilder ausrichten , um eine Karte des gesamten Abschnitts ^1,5 rekonstruieren.
   4. Mit Analyse-Software, zählen die Anzahl der EMHC positive Fasern und die Gesamtzahl der Fasern letzten Regeneration zu berechnen (100 * (# EMHC + Fasern / # Gesamtfasern)). Außerdem zählen die Anzahl der zentral nukleierten Fasern aus der gesamten Fasern Regeneration über einen längeren Zeitraum (100 * (# CN + Fasern / # Gesamtfasern)) ^1,5 zu messen.

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Ergebnisse

Muscle Kryoschnittes RNA ist hoch in der Qualität und sorgt für eine ausreichende Ausbeute für die meisten Anwendungen

Die Analysen von sechzehn Skelettmuskel - RNA - Präparationen sind in Tabelle 1 unter Verwendung von 19,4 bis 41 mg gepoolten tibialis anterior (TA) Muskel von 8 Kontrollmäusen gezeigt. Sowohl linke (L) und rechten (R) TA Muskeln wurden in Regenerationsversuche vorbereitet mit 3 Tagen gesamm...

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Diskussion

Um die besten Ergebnisse mit dieser Methode zu erreichen, halten Harz auf das untere Drittel beschränkt Einbetten oder die Hälfte des Muskels während der Kryokonservierung Gewebe, weil überschüssiges Harz wird die Sammlung der gepoolten Kryoabschnitte verlangsamen und erhöhen Harz Kontamination in der RNA-Isolierung eingebettet ist. Auch besondere Aufmerksamkeit während der Nadel Homogenisierung ist wichtig, die Ausbeute zu maximieren und die Wahrscheinlichkeit einer Verstopfung der Nadel zu minimieren. Das Proto...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cork	VWR Scientific	23420-708	Cut into small squares with a sharp blade.
Plastic coverslip	Fisher Scientific	12-547	Used to orient the muscle during freezing.
Low temperature thermometer	VWR Scientific	89370-158
2-methylbutane	Sigma	M32631-4L	Caution: hazardous chemical. Store in flammable cabinet.
Embedding resin: "cryomatrix"	Thermo Fisher Scientific	6769006	Other embedding resins can be substituted for cryomatrix.
Cryostat	Thermo Fisher Scientific	microm HM550 with disposable blade carrier	Any working cryostat should be sufficient for the protocol.
Disposable cryostat blade	Thermo Fisher Scientific	3052835	Use an appropriate blade or knife for the cryostat to be used.
RNAse decontamination solution: "RNase Zap"	Thermo Fisher Scientific	AM9780
Analytical balance	Mettler Toledo	XS64
Paint brush	Daler Rowney	214900920	Use to handle cryosections. Can be found with in stores with simple art supplies.
Razor blade	VWR Scientific	55411-050
Microscope slide	VWR Scientific	48311600
RNA organic extraction reagent: TRIzol	Thermo Fisher Scientific	15596026	Caution: TRIzol is a hazardous chemical. Note: Only organic extraction reagents are recommended for RNA extraction from skeletal muscle.
18 gauge needle	VWR Scientific	BD305185
22 gauge needle	VWR Scientific	BD305155
26 gauge needle	VWR Scientific	BD305115	Optional. Can be used for a third round of sample trituration in the RNA extraction protocol.
1 ml syringe	VWR Scientific	BD309659	For very high value samples, a Luer-Lok syringe is recommended (e.g., VWR BD309628).
1-bromo-3-chloropentane (BCP)	Sigma	B9673
For 70% ethanol in DEPC water: 200 proof alcohol	Decon Laboratories, Inc.	+M18027161M	Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 ml DEPC water.
For 70% ethanol in DEPC water: DEPC-treated water	Thermo Fisher Scientific	AM9922	Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 ml DEPC water.
RNA purification kit: PureLink RNA minikit	Thermo Fisher Scientific	12183018A	Final steps of RNA preparation.
DNase/Rnase-free water	Gibco	10977	DEPC-treated water can also be used.
Spectrophotometer: Nanodrop 2000	Thermo Fisher Scientific	NanoDrop 2000
Dnase I	Thermo Fisher Scientific	AM2222	Treat purified RNA to remove any DNA contamination before downstream appications.
Hydrophobic pen	Thermo Fisher Scientific	8899
Dulbecco's PBS	Gibco	14190	PBS for immunofluorescence protocol.
Donkey serum	Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc	017-000-121	Rehydrate normal donkey serum stock according to the manufacturer's instructions, then dilute an aliquot to 5% for immunofluorescence.  Normal goat serum can also be used.
eMHC antibody	University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank	F1.652
Collagen VI antibody	Fitzgerald Industries	#70R-CR009x
Donkey anti-rabbit AlexaFluor488	Thermo Fisher Scientific	A21206
Goat anti-mouse IgG1 AlexaFluor546	Thermo Fisher Scientific	A21123
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	Thermo Fisher Scientific	D1306
Aqueous mounting media: Permafluor	Thermo Fisher Scientific	TA-030-FM	Only use mounting media designed for fluorescent applications with anti-fade properties.
Glass coverslip	VWR Scientific	16004-314	Use for mounting slides at the end of immunofluorescence protocl
Image analysis software: ImageProExpress	Media Cybernetics, Inc.	Image-Pro Express, or more advanced products	Freeware ImageJ should also work for manual counting. More advanced software with segmentation abiities may allow partial automation of the process; e.g., ImageProPremier.
Merge and map section images: Photoshop	Adobe	Photoshop
Cardiotoxin	Sigma	C9659	Sigma C9659 has been discontinued. Other options for cardiotoxin are EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; or Ge Script # RP17303; but these have not been validated.
reverse transcription kit: Superscript III First-strand synthesis system	Thermo Fisher Scientific	18080051	Any validated, high quality reverse transcription reagents can be used.
Standard PCR: GoTaq Flexi polymerase system	Promega	M8298	Any validated, high quality Taq polymerase system can be used. If DNA sequencing is to be used for any application downstream of the PCR, then a high fidelity PCR system should be used instead.
SYBR green	Thermo Fisher Scientific	S7585	For use in qPCR when not using a dedicated qPCR master mix. Use with SuperROX (for Applied Biosystems instruments) and GoTaq Flexi polymerase and buffers.
ROX: SuperROX, 15 mM	BioResearch Technologies, Inc. Novato CA	SR-1000-10	SuperROX is more stable in the PCR reaction, so it is preferred for use as a qPCR passive reference dye over ROX (carboxy-X-rhodamine). For qPCR with Applied Biosystems instruments
Real-time PCR	Applied Biosystems	7900HT