Cryosectioning de contigües Les régions d'un muscle squelettique de souris unique pour l'expression génique et analyses histologiques

Résumé

cryo-sections consécutives sont recueillies pour permettre aux applications histologiques et l'enrichissement de l'ARN pour la mesure de l'expression des gènes en utilisant des régions adjacentes à partir d'un muscle squelettique de souris unique. ARN de haute qualité est obtenu à partir de 20 - 30 mg de cryosections et les mesures mises en commun sont comparés directement à travers des applications.

Résumé

Avec cette méthode, cryosections consécutifs sont recueillies pour permettre aux deux applications de microscopie pour l'histologie des tissus et à l'enrichissement de l'ARN pour l'expression des gènes en utilisant des régions adjacentes à partir d'un muscle squelettique de souris unique. En règle générale, il est difficile d'obtenir une homogénéisation suffisante des petits échantillons de muscles squelettiques, car les volumes de tampon peut être trop faible pour des applications de broyage efficaces, mais sans rupture mécanique suffisante, l'architecture du tissu dense de limites musculaires pénétration des réactifs de tampon, ce qui provoque finalement le rendement en ARN faible. En suivant le protocole présenté ici, à 30 um coupes sont recueillies et mises en commun permettant cryosectioning et après l'homogénéisation de l'aiguille pour perturber mécaniquement le muscle, ce qui augmente la zone de surface exposée à la pénétration du tampon. Les principales limites de la technique est qu'elle nécessite un cryostat, et il est relativement faible débit. Cependant, l'ARN de haute qualité peut être obtenue à partir de petits échantillons de m groupécryosections uscle, ce qui rend cette méthode accessible pour de nombreux muscles squelettiques différents et d'autres tissus. Des analyses plus, cette technique permet appariées (par exemple, l' histopathologie des tissus et l' expression des gènes) des régions adjacentes d'un seul muscle squelettique de sorte que les mesures peuvent être comparées directement à travers les applications pour réduire l' incertitude expérimentale et de réduire les expérimentations animales réplicatives nécessaires pour approvisionner un petit tissu pour des applications multiples.

Introduction

Le but de cette technique est de faire de multiples analyses expérimentales par des modalités différentes, telles que l'histologie et l'expression des gènes, accessibles à partir d'un seul petit tissu source du muscle squelettique. applications de microscopie sont les plus sensibles à l'échantillon des méthodes de conservation, qui doit être soigneusement contrôlée afin de limiter la formation d'artefacts de cristaux de glace lors de la cryoconservation. Ainsi, le développement de la méthode est basé sur le muscle tibial antérieur (TA) musculaire et congelées partiellement recouvert d'enrobage de résine dans un liquide de bain de 2-méthylbutane d'azote refroidi à -140 ° C en tant que matériau de base pour la microscopie par immunofluorescence et l'expression génique analyses.

La nécessité d'utiliser le même matériau source pour diverses approches techniques est particulièrement important pour les expériences à base d'injection intramusculaire où les muscles droit et gauche représentent les différentes conditions expérimentales, l'une et l'autre contrôle. Par exemple, dans les études de régénération musculaire, une muSCLE est injecté avec une toxine pour causer des dommages aux tissus répandus tandis que le muscle controlatéral sert de contrôle du véhicule à injection ^1. De même, les études de thérapie génique pour les troubles musculaires commencent généralement à la validation du vecteur de thérapie génique par injection intramusculaire , à comparer avec le vecteur vide, vecteur ou sans rapport avec le contrôle du véhicule du côté controlatéral ^2. Par conséquent, il est impossible de l'obtenir dans chaque muscle TA pour une application différente.

Les stratégies communes pour faire face à ce problème sont les suivants: i) d'utiliser un groupe musculaire différent pour chaque application, ii) d'utiliser des souris supplémentaires, ou iii) pour couper un morceau de muscle pour chaque application. Cependant, des différences substantielles entre les groupes musculaires, il est difficile de comparer les données à partir d'applications séparées, et les animaux supplémentaires augmentent la charge et sont peu justifiées si d'autres alternatives existent. En divisant le muscle après dissection à la source des applications différentes est la meilleure option in de nombreux cas. Toutefois, les morceaux de muscles sont souvent trop petits pour utiliser la pulvérisation sous azote liquide ou par des techniques de broyage mécanique pour l' homogénéisation ^2-5. Le muscle est un tissu très structurel garnie de protéines de la matrice extracellulaire et contractiles, l'homogénéisation mécanique inadéquate conduit à un faible rendement de l'ADN ultérieur, l'ARN ou une protéine. La méthode détaillée ici permet de petites quantités de tissu d'un muscle de la source pour une utilisation dans des applications multiples, et l'inclusion de cryosectioning et l'aiguille trituration améliore l'homogénéisation mécanique pour un meilleur rendement de l'ARN.

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Protocole

Toutes les procédures animales ont été approuvées par l'Université de Géorgie Institutional Animal Care et utilisation Comité en vertu de l'utilisation des animaux protocole A2013 07-016 (Beedle).

1. Cryoconservation du muscle squelettique non fixé

1. Préparation
   1. Couper le liège en petits carrés (environ 1 cm x 1 cm) avec une lame de rasoir, écrire sur le bouchon avec un marqueur à pointe fine qui est résistant à la 2-méthylbutane pour identifier la souris source et le muscle, et faire une coupe très faible (environ 1 mm) sur toute la surface supérieure. Insérez une lamelle en plastique dans la coupe à utiliser pour orienter le tissu. Répétez jusqu'à ce qu'un bouchon est prêt pour chaque tissu à cryoconservés.
   2. Obtenir l'azote liquide, 2-méthylbutane, résine enrobage, d'un thermomètre à basse température, des bouchons, des outils de dissection, et la souris de l'étude.
      ATTENTION: L' azote liquide est un gaz comprimé qui peut exploser si chauffé. Porter une blouse de laboratoire, des gants à basse température et de protection du visage lors de la manipulation de liquide nitrogen; le contact avec la peau ou les yeux peuvent provoquer des brûlures ou des gelures. 2-Methylbutane est inflammable, toxique, de la santé et de danger pour l' environnement. Porter un équipement de protection individuelle (blouse de laboratoire, des gants, des lunettes de sécurité), ouvrir le conteneur de stockage dans une hotte, transférer la petite quantité nécessaire pour la congélation (généralement de 200 à 400 ml) dans un récipient séparé qui peut être fermé hermétiquement, et éviter d'inhaler .
   3. Euthanasier souris avec une méthode approuvée de l'euthanasie sous anesthésie. En bref, insérez la souris dans une chambre d'inhalation avec 2,5% d'isoflurane dans de l'oxygène à partir d'un vaporisateur isoflurane, attendez 20 secondes après que la souris cesse de se déplacer pour vérifier un réflexe de pédale. Lorsque le réflexe de la pédale est négative, euthanasier la souris de l' étude par dislocation cervicale ^6.
      REMARQUE: les méthodes d'euthanasie doivent être approuvées par le comité d'éthique institutionnelle.
   4. Enlever la peau recouvrant la hindlimb distale et couper les tendons antérieurs distales juste au-dessus de la cheville à pointe fine disseciseaux ction. Attrapez les tendons distales avec une pince fine et tirez doucement vers le haut et vers le genou tout en réduisant le fascia latéral pour libérer le muscle. Tirez le muscle perpendiculairement à partir du genou et de faire une coupe finale pour exciser le muscle TA ^7.
      NOTE: Le muscle TA est utilisé ici comme un exemple, mais tout le muscle squelettique de la souris ou le cœur peut être substitué à la TA dans ce protocole, le cas échéant à des objectifs expérimentaux de l'utilisateur. La seule limitation est que le tissu doit être suffisamment petit pour atteindre la cryoconservation rapide dans toute sa profondeur; une taille de tissu maximale de 1 cm x 1 cm est recommandée.
   5. Répéter l'opération sur la jambe opposée, et de disséquer toutes les autres tissus à collecter. Effectuer la dissection aussi rapidement que possible afin de limiter la dégradation des tissus avant la cryoconservation.
   6. Orient chaque muscle pour les sections transversales sur son bouchon de pré-étiquetés. Supporter le muscle perpendiculaire au bouchon avec le tendon distal de toucher le bouchon et la partie supérieure du poste de musclese terminant loin, tenue debout par la lamelle.
   7. Cryoconservation tous les tissus pour l'analyse histologique, dès que possible après la dissection, de préférence à moins de 5 min, mais certainement pas plus de 15 temps min écoulé depuis l'euthanasie de l'animal source.
2. Cryoconservation
   1. Commencer à refroidir le bain de cryoconservation cinq minutes avant la fin de la dissection. Verser le 2-méthylbutane dans un récipient métallique ouvert à une profondeur d'environ 3 cm. Verser de l' azote liquide dans un récipient isolant à une profondeur de 2 à 4 cm. Réglez le bécher de 2-méthylbutane dans l'azote liquide; l'azote commence à bouillir. Éviter les éclaboussures d'azote dans le bécher 2-méthylbutane.
      ATTENTION: Préparer le gel bain dans une hotte ou un endroit bien ventilé.
   2. Insérer un thermomètre à basse température dans le 2-méthylbutane pour surveiller la température et remuer souvent avec une fourchette afin d'assurer un refroidissement. Continuez à remuer et laisser refroidir jusqu'à ce que 2-moithylbutane atteint -140 ° C, l'ajout de nouveau de l'azote liquide dans le bain externe si nécessaire.
      NOTE: -140 ° C est la température optimale pour minimiser les artefacts de cristaux de glace dans le muscle strié; d' autres tissus peuvent cryoconservation mieux à des températures différentes (par exemple, le cerveau, -90 ° C).
   3. Appliquer une résine enrobage uniquement à la partie inférieure 35 - 50% du muscle où il rencontre le bouchon et déposer immédiatement le bouchon dans le 2-méthylbutane à -140 ° C. répéter rapidement jusqu'à 8 tissus par congélation lot. Agiter pendant 30 secondes, en grattant le fond du récipient pour assurer que les tissus ne gèle pas dans la solidification de 2-méthylbutane.
   4. Utiliser une fourchette, une cuillère à fentes ou de grandes pinces pour tirer sur chaque bouchon de tissu du 2-méthylbutane. Retirez rapidement la lamelle, tamponner l'excès de 2-méthylbutane dans le bêcher, puis déposer le bouchon de tissu dans le bain d'azote externe. Répétez l'opération pour tous les bouchons restants dans le bécher.
   5. échantillons de transfert dans l'azote liquide ou sur la glace sèche pour-80 ° C congélateur pour le stockage.
   6. Si les tissus restent pour la cryoconservation, répétez les étapes 1.2.3 à 1.2.4. Ajouter supplémentaire de 2-méthylbutane dans le bécher ou de l'azote liquide dans le bain externe nécessaire et re-refroidir à -140 ° C. Éliminer utilisé 2-méthylbutane comme des déchets dangereux.

2. Recueillir cryosections pour histologie et d'ARN Applications

1. Préparation.
   1. Pré-peser un tube DNase / RNase-autoclavé sur une balance analytique. Ensuite, déplacez-le dans la chambre cryostat à prérefroidir. Répétez jusqu'à ce que les tubes sont prêts pour tous les échantillons de cryosection communs à recueillir.
   2. Squelettique pour le sectionnement du muscle, confirmer que la température de la chambre de cryostat est de -21 à -22 ° C par son thermostat interne. Transférer les conteneurs avec les tissus à découper dans la chambre et laisser le récipient (s) à équilibrer la température du cryostat pendant au moins 15 minutes avant l'ouverture.
   3. Insérez une nouvelle lame de cryostat jetable. Alternativement, retirer la lame existante, pulvériser avec une solution de décontamination RNase, rincer à l' ddH ₂ O, et réinsérer dans le cryostat à refroidir. Vaporiser un tissu propre avec 70% d'éthanol et essuyez soigneusement la lame et la plate-forme de serrage.
      1. Vaporiser un tissu propre avec une solution de décontamination RNase et essuyez brosses cryostat. Vaporiser un tissu avec ddH ₂ O, essuyez les brosses et les mettre dans la chambre de cryostat sur une surface propre.
         ATTENTION: La lame de cryostat devrait être couvert par la garde du couteau lorsqu'il ne sert pas. En outre, la solution de décontamination RNase est toxique et se fige pour former un précipité dans la chambre de cryostat froid. Par conséquent, manipuler avec précaution et éviter son utilisation dans la chambre de cryostat.
   4. Dans la chambre de cryostat, placer une goutte de taille dime (environ 300 pi) d'enrobage de résine sur un échantillon mandrin chaud, mettre un bouchon de tissu sur le dessus de la résine, appuyez vers le bas, puis régler le mandrin dans le freezing rail ou sur un élément congélation rapide si disponible.
   5. Après l'enrobage résine se solidifie (blanc), ajouter la résine d'enrobage supplémentaire sur le dessus du bouchon, autour de la partie inférieure de 35% du tissu et appuyez sur l'extracteur de chaleur dans la résine d'enrobage pour une congélation rapide afin de mieux stabiliser le tissu. Attendre 5 min avant la coupe pour permettre à la résine de durcir complètement.
   6. Faire en sorte que la pince de l'échantillon se trouve dans sa position la plus rétractée, le plus éloigné de la lame. Insérez le mandrin de l'échantillon de tissu dans la pince de l'échantillon.
2. préparation cryosection.
   1. Desserrez le support de porte-lame, régler l'angle de dégagement de la lame à 10 ° (ou un angle approprié pour le support de lame utilisée), et resserrez. Relâchez le frein et tourner le volant pour abaisser le muscle vers la lame. Estimer la distance la plus proche entre le tissu et la lame, puis déplacez le tissu de la lame et d'engager le frein de roue à la main.
   2. Desserrez la leve de réglage de la hauteurr et déplacer le support de lame avant ou arrière, respectivement, si l'extrémité du tissu est supérieure à environ 2 mm de la lame ou si la lame heurte le tissu. Serrer et abaisser à nouveau le tissu pour vérifier la distance de la lame. Répéter réglages jusqu'à ce que la lame est de 1 à 2 mm de l'extrémité du tissu par estimation visuelle.
   3. Abaisser le tissu vers la lame et d'évaluer l'angle de tissu pour les sections transversales. Verrouiller le volant et relâcher le levier de serrage spécimen. Pousser la pince de prélèvement vers la gauche ou droite jusqu'à ce que l'orientation horizontale du tissu est perpendiculaire à la lame.
   4. Poussez l'échantillon serrent vers le haut ou vers le bas pour ajuster l'orientation "y" de sorte que les coupes de tissus seront perpendiculaires à l'axe longitudinal du muscle. Serrer le levier de serrage spécimen.
   5. Utilisez le cours et bien avancement pour faire avancer l'échantillon jusqu'à ce qu'il touche juste la lame. Si la recherche de sections à partir d'une profondeur de tissu particulier, réinitialiser la somme des épaisseurs de section à zéro (dessus du tissu).
   6. Régler le cryostat à la fonction de garniture avec l'épaisseur de coupe à 30 um. Couper et jeter les sections jusqu'à ce que la profondeur présélectionnée pour la collecte des tissus est atteinte (par exemple, 400 um à partir du haut).
3. Recueillir cryosections pour l'extraction de l'ARN.
   1. Ouvrir le tube pour les sections de collecte et de le placer près du porte-lame. Utilisez une brosse pré-refroidi propre pour ramasser chaque article tel qu'il est coupé de la lame et transférer le cryosection dans le tube. Répéter jusqu'à ce que les sections mises en commun pèse 30 mg ou la profondeur de tissu désiré est atteint.
      NOTE: Pour un jambier antérieur de souris adulte, collection de profondeur d'environ 400 à 4000 um de tissus donne généralement 25 - 40 mg. En utilisant des pinces métalliques pour transférer des sections sur le tube de collecte est pas recommandé que les sections ont tendance à coller et agglutiner sur la surface métallique.
   2. Si l'incorporation de résine entoure le cryosection musculaire, verrouiller le frein à main et d'utiliser une lame de rasoir pourraser petits morceaux de résine jusqu'à il y a seulement une fine couche autour du sommet du muscle. résine Toujours couper avec la lame inclinée loin du muscle.
      NOTE: Une mince couche d'enrobage de résine ne porte pas essentiellement la préparation d'ARN en aval. Si plus épaisse résine enrobage est présent, utiliser des brosses pour taquiner l'éloigner du muscle avant de déplacer le cryosection dans le tube de collecte.
   3. Alternativement, les sections de la piscine sur le porte-lame et le transfert en vrac vers le tube de collecte.
      NOTE: Cependant, cette méthode a tendance à être plus lent, et les articles sont plus susceptibles de rester et de se regrouper, ce qui peut réduire l'efficacité de l'aiguille homogénéisation dans les étapes ultérieures.
   4. Placez rapidement le tube de cryosection regroupé en un équilibre et un tube d'enregistrement du poids analytique. Remettre immédiatement le tube à la chambre de cryostat froide pour maintenir la section température proche de -20 ° C. Calculer le poids des sections mises en commun.
      NOTE: Si l'isolement de l'ARN se produira sur l'annoncejour DIFFÉRENTES, stocker le tube de cryosection commun à -80 ° C jusqu'à utilisation.
4. Collecter cryosections pour l'histologie.
   1. Appuyez sur le bouton de l'épaisseur de la section pour les fines et sectionnement utilisez les flèches pour régler l'épaisseur de la section de cryostat à 7 pm (ou une autre épaisseur de section appropriée, généralement de 6 à 10 um).
      REMARQUE: Les sections plus minces (6 à 10 um) doivent être utilisés pour des applications histologiques pour garantir que les réactifs de coloration peuvent pénétrer dans la profondeur de la coupe de tissu. des coupes minces peuvent être prélevées sur toute la profondeur au cours de la cryosectioning, mais des sections plus profondes sont préférées car enrobage de résine, qui augmente avec la profondeur des tissus, ne nuit pas à la coloration histologique.
   2. Couper et jeter 4 à 7 sections pour obtenir une surface uniforme, même tissu. Prenez note de la profondeur des tissus.
   3. Découper une section et l'orienter sur la surface du porte-lame. Ramassez la section en rapidement et en douceur de toucher un (température ambiante) lame de microscope chaudeà la section sur le porte-lame. Retour la diapositive à la température ambiante. Continuez jusqu'à ce que le nombre de diapositives désirées est obtenu. Prenez note de la profondeur du tissu final.
      NOTE: La collecte d'un deuxième (double) section pour chaque tissu est recommandé.
   4. Avec sectionnant complète, engager le frein de roue à main, renvoie le spécimen à la position de plus en arrière, et retirer le mandrin de tissu. Utilisez l'élément de chaleur cryostat pour faire fondre la résine enrobage tenant le bouchon de tissu sur le mandrin de l'échantillon. Retirer le liège de tissu, sécher avec un tissu, et revenir au stockage.
   5. Répétez l'étape 2.1.2 pour chaque tissu restant. Laisser les lames sécher pendant 20 minutes après le dernier tissu est monté. Ensuite, utilisez les diapositives pour histologiques ou immunofluorescence ou congeler à -80 ° C dans une boîte de diapositives jusqu'à ce que nécessaire.

3. Isolement de l'ARN à partir de Pooled cryosections

1. extraction de l'ARN
   1. tube (s) de déplacement de cryosections communs à glace. Immédiatement ajouter uneorganique de réactif d'extraction d'ARN selon un rapport d'environ 1 ml de réactif en fonction du poids cryosection 50 mg, typiquement 600 ul par tube.
      ATTENTION: Réactifs d'isolement d'ARN sont toxiques, corrosifs et irritants. Suivez les instructions du fabricant pour la manipulation.
   2. En utilisant une seringue de 1 ml avec une aiguille de calibre 18, dessiner l'ARN extraction liquide et rincer les parois du tube jusqu'à ce que tout le tissu est mis en suspension dans la solution. Essayez de minimiser les bulles d'air lors de l'aiguille homogénéisation.
   3. Utilisez la pointe de l'aiguille pour écraser et de disperser des cryosections et pièces en bouquets adhérant à la paroi du tube. Triturer à homogénéiser en passant l'échantillon et à travers l'aiguille pour cinq coups, puis retourner l'échantillon à la glace. Répétez les deux étapes trois à cinq fois, ou autant de fois qu'il est nécessaire de perturber tous les bouquets et passer l'échantillon facilement à travers l'aiguille.
   4. Retirez l'aiguille de calibre 18 et de le remplacer par une aiguille de calibre 22. tr soigneusementiturate l'échantillon pendant cinq coups, puis retourner l'échantillon à la glace. Répéter la trituration trois à quatre fois pour obtenir un homogénat de tissu très finement dispersé.
      NOTE: Si des particules de tissus commencent à bloquer l'aiguille lors de l'élaboration de l'échantillon, d'expulser tous les extraits de la seringue et revenir à l'aiguille de calibre 18 pour plus d'homogénéisation. Une étape de trituration supplémentaire avec une aiguille de calibre 25 ou 26 peut être ajouté pour obtenir un rendement maximal. Cependant, l'aiguille peut être obstrué donc il y a un risque d'échantillon déversement.
   5. Déplacer l'échantillon à partir de la glace jusqu'à la température ambiante. Incuber pendant 5 min à perturber les complexes moléculaires.
   6. Dans une hotte, ajouter 0,1 ml de 1-bromo-3-chloropentane (BCP) pour 1 ml de réactif d'isolement de l'ARN utilisé (étape 3.1.1), typiquement de 60 pi par tube. Agiter vigoureusement le tube à la main pendant 15 secondes (ne pas vortex). Incuber l'échantillon à température ambiante pendant 2 à 3 min. Ensuite, centrifugeuse pendant 15 minutes à 12.000 xg et 4 ° C.
      PRUDENCE: BCP est inflammable et toxique. Manipuler dans une hotte et porter des gants, une blouse de laboratoire, et des lunettes de sécurité.
   7. Recueillir soigneusement la phase aqueuse supérieure (incolore) contenant de l'ARN et le transférer dans un tube propre. Ajouter un volume égal d'éthanol à 70% (dans de l'eau DEPC) et vortex pour mélanger. Incuber à la température ambiante pendant jusqu'à 10 min.
      NOTE: l'interphase milieu et phases de phénol-BCP inférieures peuvent être traitées pour l'ADN génomique et de protéines, respectivement, selon les instructions du fabricant ou collectées dans un conteneur de déchets dangereux phénol-BCP pour l'élimination appropriée.
2. la purification de l'ARN.
   1. Suivez les instructions du fabricant pour la liaison échantillon, lavage et élution avec des variations mineures ^8. Par exemple:
   2. Placer une aliquote de l'eau DNase / RNase dans un bain ou incubateur à 37 ° à préchauffer pour l'étape 3.2.4.
   3. Ajouter l'échantillon d'ARN provenant 3.1.8 ci-dessus à une colonne de purification et de centrifuger l'échantillon pendant 15 secondesà 12 000 x g à température ambiante. Verser le débit à travers de nouveau dans la même colonne et re-centrifugation. Répéter un délai supplémentaire pour optimiser la liaison ARN, puis jeter le flux final à travers.
   4. Effectuer les étapes de lavage selon les instructions du fabricant ^8. Appliquer 700 pi de tampon de lavage (pas d'éthanol) à la colonne, spin pendant 15 secondes à 12.000 xg, et jeter l'écoulement à travers.
   5. Ajouter 500 pi de tampon de lavage (avec de l'éthanol) à la colonne, spin pendant 15 secondes à 12.000 xg, et jeter l'écoulement à travers. Répétez cette étape une fois.
   6. Faites tourner la colonne vide pendant 1 min à 12 000 xg pour sécher la membrane.
   7. Transférer la colonne spin à un tube DNase RNase propre. Ajouter 40 ul de / eau sans RNase préchauffé DNase (3.2.1) à partir du centre de la membrane de la colonne. A température ambiante, incuber pendant 2 min, puis centrifuger pendant 2 minutes à 12 000 x g.
      NOTE: Le volume d'élution de 40 ul est d'environ 1,3 ul par mg d'originetissus pour 30 mg de cryosections regroupées. Réglez le volume d'élution en fonction de différents poids de tissu de départ, mais ne réduisent pas en dessous de 32 ul. Une deuxième élution, en utilisant environ 0,7 ul par mg de tissu d'origine, peuvent être ajoutés pour augmenter le rendement d'ARN total.
   8. Analyser l'ARN (colonne d'élution) pour la concentration et la pureté d'un spectrophotomètre, l'électrophorèse, et / ou un bioanalyseur. Stocker l'ARN à -80 ° C jusqu'à son utilisation pour des applications en aval, telles que la transcription inverse pour la PCR quantitative ^4.
      NOTE: Un traitement de DNase est recommandé avant d'utiliser l'ARN dans les applications en aval. Ce traitement peut être effectué sur des colonnes de purification d'ARN avant l'étape de lavage, à ce point spécifique suivant élution de la colonne, ou sur une aliquote de l'ARN comme la première étape dans une application en aval. L'ARN doit être stable pendant plusieurs années.

4. Analyse histologique par immunofluorescence Staining de cryosections musculaires

1. Simple protocole immunofluorescence.
   1. Utilisez un stylo hydrophobe pour encercler le groupe de sections sur chaque diapositive. Laissez tomber doucement PBS dans la zone encerclée (environ 80 pi pour une petite surface jusqu'à 500 pl pour une grande surface), en faisant attention à ne pas toucher les tissus. Incuber pendant 5 min à température ambiante.
      NOTE: Si vous utilisez des diapositives congelés, retirer les lames de -80 ° C congélateur et incuber à température ambiante pendant 20 à 30 min de dégeler et sécher, puis procéder comme ci-dessus. Au moins deux lames sont nécessaires: une lame expérimentale pour être mis en incubation dans l'anticorps primaire et secondaire; et une glissière de commande pour lequel l'anticorps primaire est exclue, le «secondaire seulement».
   2. Astuce de la diapositive à verser hors PBS. Ajouter du sérum d'âne 5% dans du PBS (solution de blocage) à la zone cerclée; être attentif à ce que les sections de muscle ne se dessèchent pas. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes (ou jusqu'à plusieurs heures dans une chambre d'humidité).
   3. Préparer une solution d'anticorps primaire pour analyser la régénération musculaire. Mélanger une solution de blocage, avec un anticorps EMHC (01h40) et un anticorps ColVI (1: 1000). Préparer environ 150 pi, 300 pi ou 500 pi pour les petites, moyennes ou grandes zones de glissement, respectivement. Vortex pendant 5 secondes, puis centrifuger pendant 2 min à 15 000 xg pour sédimenter tout précipité.
   4. Pour les diapositives expérimentales, inclinez la lame pour verser hors solution de blocage, puis ajouter une solution d'anticorps primaire à partir de 4.1.3. Pour la glissière de commande secondaire, basculer la lame de verser hors solution de blocage, puis ajouter la solution de blocage fraîche (pas d'anticorps). Incuber les lames dans une chambre humide à 4 ° C pendant une nuit.
      NOTE: Lorsque pipetage des solutions d'anticorps sur des lames, toujours tirer le liquide de la partie supérieure du tube primaire de solution d'anticorps, ne perturbent pas tout précipité au fond du tube.
   5. Astuce glisse à verser hors solution. Ajouter PBS goutte à goutte à la région encerclée de chaque diapositive à laver, pointe à verserhors tension, puis ajouter plus de PBS et incuber pendant 3 à 5 min. Répétez l'opération pour un total de trois lavages.
      REMARQUE: Le temps de lavage est très flexible et peut être allongée jusqu'à 20 min si on le souhaite. En règle générale, le nombre de changements de solution est plus important que le temps.
   6. Préparer une solution d'anticorps secondaire pour toutes les lames (y compris le tiroir de commande secondaire) en utilisant une dilution 1: 500 d'anticorps secondaires verts et rouges fluorophore couplé pour détecter IgG1 de souris (EMHC) et l'IgG de lapin (ColVI) et 1: 10 000 dilution de DAPI nucléaire tache.
      1. Par exemple, mélanger 1 pl de DAPI avec 9 pi de ddH ₂ O pour faire une dilution 1:10 de DAPI. Ensuite, pour un volume final de 500 ul, ajouter 1,0 ul anti-souris IgG1 rouge + 1,0 ul d'IgG anti-lapin-vert + 0,5 pi de 01:10 DAPI à 447,5 pi de solution de blocage. Vortex pour mélanger et centrifuger pendant 2 min à 15 000 xg pour sédimenter tout précipité.
         NOTE: Idéalement, tous les anticorps secondaires devrait être de la même espèce hôte.
   7. Astuce les diapositives à verser le dernier lavage PBS. Ajouter une solution d'anticorps secondaire pour couvrir tous les tissus. Couvrir les lames pour les protéger de la lumière et laisser incuber à la température ambiante pendant 30 min.
      NOTE: Tous les anticorps secondaires devraient être validés pour avoir un minimum de réactivité croisée avec d'autres espèces dans des expériences de marquage double.
   8. Laver les lames comme décrit dans 4.1.5. Après le dernier lavage, faire pencher la diapositive à verser le PBS et régler la lame sur un tissu. Ajouter 3 à 4 gouttes d'un milieu de montage aqueux le long d'un côté.
   9. Fixer le bord d'une lamelle de verre juste au bord extérieur du support de montage. En utilisant des pinces, abaissez lentement la lamelle vers les tissus, puis relâchez la lamelle et tapotez doucement en position. Enfin, appuyez doucement sur chaque coin de la lamelle pour le stabiliser.
   10. Protéger les diapositives de la lumière et conserver à 4 ° C jusqu'à utilisation.
       REMARQUE: Pour le stockage à long terme, appliquer une mince couche de vernis à ongles le long du bord de the lamelle pour aider à prévenir la glissière de séchage.
2. L'évaluation histologique.
   1. Image les diapositives à l'aide d'un épifluorescence ou microscope confocal avec des filtres appropriés pour détecter EMHC (rouge); ColVI (vert); et les noyaux (bleu) DAPI teinté, typiquement en utilisant un objectif 20X ^1,5.
   2. Vérifiez que le signal fluorescent à partir de diapositives expérimentales est différente de la glissière de commande secondaire pour démontrer la spécificité de la détection EMHC et ColVI ^4.
      NOTE: Les fibres de régénération positives EMHC doivent être visibles d'environ 2 à 7 jours après une blessure musculaire et variablement chez des souris atteintes de dystrophie musculaire. Le collagène VI est présent dans la matrice extracellulaire entourant les fibres musculaires, les vaisseaux sanguins et les nerfs et les faisceaux plus grands du tissu conjonctif de la péri- et épimysium. DAPI colorant nucléaire est utile pour identifier les fibres musculaires avec des noyaux centraux par rapport aux noyaux périphérique indiquant la régénération des fibres, et la présence de infiltrating cellules. fibres nécrotiques ou blessées peuvent tacher faiblement avec l'anticorps secondaire IgG de souris due à la détection des IgG endogène qui pénètre dans les fibres musculaires à travers les membranes endommagées.
   3. Pour quantifier la régénération, se chevauchent microscope des photos avec chaque filtre fluorescent dans l'ensemble de l'image. Fusionner les images EMHC, ColVI et DAPI pour chaque emplacement, puis aligner les images pour reconstruire une carte de l'ensemble de la section ^1,5.
   4. En utilisant le logiciel d'analyse, compter le nombre de fibres positives EMHC et le nombre de fibres totales pour calculer récente régénération (100 * (# EMHC + fibres / # fibres totales)). En outre, compter le nombre de fibres nucléées centralement sur les fibres totales pour mesurer la régénération sur une période plus longue (100 * (# CN + fibres / # total des fibres)) ^1,5.

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Résultats

ARN Muscle cryosection est de haute qualité et offre un rendement suffisant pour la plupart des applications

Les analyses des seize squelettiques préparations d'ARN musculaires sont présentés dans le tableau 1 , en utilisant 19,4 mg de 41 à Pooled jambier antérieur (TA) , le muscle des souris témoins 8. Les deux à gauche (L) et droite muscles (R) TA ont été préparés dans des expériences de régé...

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Discussion

Pour obtenir les meilleurs résultats avec cette méthode, gardez l'intégration résine limitée au tiers inférieur ou la moitié du muscle pendant la cryoconservation de tissu, car l'excès de résine va ralentir la collecte des cryosections regroupées et peut augmenter l'incorporation de contamination de la résine dans l'isolement de l'ARN. En outre, une attention particulière lors de l'aiguille d'homogénéisation est important de maximiser le rendement et minimiser la probabilité d&...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cork	VWR Scientific	23420-708	Cut into small squares with a sharp blade.
Plastic coverslip	Fisher Scientific	12-547	Used to orient the muscle during freezing.
Low temperature thermometer	VWR Scientific	89370-158
2-methylbutane	Sigma	M32631-4L	Caution: hazardous chemical. Store in flammable cabinet.
Embedding resin: "cryomatrix"	Thermo Fisher Scientific	6769006	Other embedding resins can be substituted for cryomatrix.
Cryostat	Thermo Fisher Scientific	microm HM550 with disposable blade carrier	Any working cryostat should be sufficient for the protocol.
Disposable cryostat blade	Thermo Fisher Scientific	3052835	Use an appropriate blade or knife for the cryostat to be used.
RNAse decontamination solution: "RNase Zap"	Thermo Fisher Scientific	AM9780
Analytical balance	Mettler Toledo	XS64
Paint brush	Daler Rowney	214900920	Use to handle cryosections. Can be found with in stores with simple art supplies.
Razor blade	VWR Scientific	55411-050
Microscope slide	VWR Scientific	48311600
RNA organic extraction reagent: TRIzol	Thermo Fisher Scientific	15596026	Caution: TRIzol is a hazardous chemical. Note: Only organic extraction reagents are recommended for RNA extraction from skeletal muscle.
18 gauge needle	VWR Scientific	BD305185
22 gauge needle	VWR Scientific	BD305155
26 gauge needle	VWR Scientific	BD305115	Optional. Can be used for a third round of sample trituration in the RNA extraction protocol.
1 ml syringe	VWR Scientific	BD309659	For very high value samples, a Luer-Lok syringe is recommended (e.g., VWR BD309628).
1-bromo-3-chloropentane (BCP)	Sigma	B9673
For 70% ethanol in DEPC water: 200 proof alcohol	Decon Laboratories, Inc.	+M18027161M	Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 ml DEPC water.
For 70% ethanol in DEPC water: DEPC-treated water	Thermo Fisher Scientific	AM9922	Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 ml DEPC water.
RNA purification kit: PureLink RNA minikit	Thermo Fisher Scientific	12183018A	Final steps of RNA preparation.
DNase/Rnase-free water	Gibco	10977	DEPC-treated water can also be used.
Spectrophotometer: Nanodrop 2000	Thermo Fisher Scientific	NanoDrop 2000
Dnase I	Thermo Fisher Scientific	AM2222	Treat purified RNA to remove any DNA contamination before downstream appications.
Hydrophobic pen	Thermo Fisher Scientific	8899
Dulbecco's PBS	Gibco	14190	PBS for immunofluorescence protocol.
Donkey serum	Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc	017-000-121	Rehydrate normal donkey serum stock according to the manufacturer's instructions, then dilute an aliquot to 5% for immunofluorescence.  Normal goat serum can also be used.
eMHC antibody	University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank	F1.652
Collagen VI antibody	Fitzgerald Industries	#70R-CR009x
Donkey anti-rabbit AlexaFluor488	Thermo Fisher Scientific	A21206
Goat anti-mouse IgG1 AlexaFluor546	Thermo Fisher Scientific	A21123
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	Thermo Fisher Scientific	D1306
Aqueous mounting media: Permafluor	Thermo Fisher Scientific	TA-030-FM	Only use mounting media designed for fluorescent applications with anti-fade properties.
Glass coverslip	VWR Scientific	16004-314	Use for mounting slides at the end of immunofluorescence protocl
Image analysis software: ImageProExpress	Media Cybernetics, Inc.	Image-Pro Express, or more advanced products	Freeware ImageJ should also work for manual counting. More advanced software with segmentation abiities may allow partial automation of the process; e.g., ImageProPremier.
Merge and map section images: Photoshop	Adobe	Photoshop
Cardiotoxin	Sigma	C9659	Sigma C9659 has been discontinued. Other options for cardiotoxin are EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; or Ge Script # RP17303; but these have not been validated.
reverse transcription kit: Superscript III First-strand synthesis system	Thermo Fisher Scientific	18080051	Any validated, high quality reverse transcription reagents can be used.
Standard PCR: GoTaq Flexi polymerase system	Promega	M8298	Any validated, high quality Taq polymerase system can be used. If DNA sequencing is to be used for any application downstream of the PCR, then a high fidelity PCR system should be used instead.
SYBR green	Thermo Fisher Scientific	S7585	For use in qPCR when not using a dedicated qPCR master mix. Use with SuperROX (for Applied Biosystems instruments) and GoTaq Flexi polymerase and buffers.
ROX: SuperROX, 15 mM	BioResearch Technologies, Inc. Novato CA	SR-1000-10	SuperROX is more stable in the PCR reaction, so it is preferred for use as a qPCR passive reference dye over ROX (carboxy-X-rhodamine). For qPCR with Applied Biosystems instruments
Real-time PCR	Applied Biosystems	7900HT