Cryosectioning da contíguos Regiões de um músculo esquelético único mouse para expressão do gene e análises histológicas

Resumo

Consecutivos crio-secções são recolhidas para permitir que aplicações histológicas e enriquecimento do RNA para medições de expressão de genes usando regiões adjacentes a partir de um músculo esquelético único rato. RNA de alta qualidade é obtida a partir de 20 - 30 mg de criosecções e medições agrupados serão comparadas diretamente entre aplicativos.

Resumo

Com este método, criosecções consecutivos são coletadas para permitir que ambas as aplicações de microscopia para a histologia do tecido e enriquecimento do RNA para a expressão do gene usando regiões adjacentes a partir de um músculo esquelético único rato. Normalmente, é um desafio para alcançar a homogeneização adequada de amostras de músculo esquelético pequenas porque os volumes de tampão pode ser muito baixa para aplicações de moagem eficientes, mas sem ruptura mecânica suficiente, a arquitetura do tecido denso de limites musculares penetração de reagentes tampão, em última análise, causando baixo rendimento RNA. Seguindo o protocolo aqui relatado, 30 um secções são recolhidas e combinadas permitindo cryosectioning e subsequente homogeneização agulha para mecanicamente perturbar o músculo, aumentando a área de superfície exposta para a penetração tampão. As principais limitações da técnica é que ela exige um criostato, e é relativamente baixa taxa de transferência. No entanto, o RNA de alta qualidade pode ser obtido a partir de pequenas amostras de m reunidascriocortes uscle, tornando este método acessível para muitos músculos esqueléticos e de outros tecidos diferentes. Análises Além disso, esta técnica permite combinados (por exemplo, exame histopatológico dos tecidos e expressão de genes) de regiões adjacentes de um único músculo esquelético de modo que as medições podem ser diretamente comparados entre aplicativos para reduzir a incerteza experimental e para reduzir as experiências com animais replicativas necessárias para obter uma pequena de tecido para múltiplas aplicações.

Introdução

O objetivo desta técnica é fazer várias análises experimentais por diferentes modalidades, como histologia e expressão gênica, acessíveis a partir de um único tecido esquelético pequena fonte muscular. Microscopia aplicações são as mais sensíveis para amostrar os métodos de conservação, que devem ser cuidadosamente controlados para limitar a formação de artefactos de cristais de gelo durante a criopreservação. Assim, o desenvolvimento do método baseia-se no músculo tibial anterior (TA) músculo congelado parcialmente coberto com a incorporação de um banho de resina em 2-metilbutano -140 ° C líquido arrefecido com azoto como o material fonte para microscopia de imunofluorescência e a expressão do gene análises.

A necessidade de utilizar o mesmo material de origem de diversas abordagens técnicas é particularmente importante para as experiências com base em injecção intramuscular em que os músculos para a esquerda e direita representam condições diferentes, um experimental e um controlo. Por exemplo, em estudos de regeneração muscular, um muLECS é injectado com uma toxina para causar dano tecidual generalizada enquanto o músculo contralateral serve como controlo injectados com veículo ^1. De igual modo, os estudos de terapia génica para doenças musculares começam tipicamente com a validação do vector de terapia genética por injecção intramuscular para ser comparado com o vector vazio, ou vector não relacionado de controlo de veículo no lado contralateral ^2. Portanto, não é possível a fonte de cada músculo TA para uma aplicação diferente.

As estratégias comuns para lidar com este problema são: i) a utilização de um grupo muscular diferente para cada aplicação, ii) para usar camundongos adicionais, ou iii) para cortar um pedaço do músculo para cada aplicação. No entanto, diferenças significativas entre os grupos musculares tornam difícil comparar os dados de aplicativos separados, e os animais adicionais aumentam despesa e são mal justifica se existem outras alternativas. Dividindo o músculo após a dissecação, a fonte aplicações diferentes é a melhor opção in muitos casos. No entanto, os pedaços de músculo são muitas vezes demasiado pequena para usar pulverização sob azoto líquido ou técnicas de trituração mecânica para homogeneização ^2-5. Como o músculo é um tecido altamente estrutural embalado com proteínas da matriz extracelular e contráteis, homogeneização mecânica inadequada leva a um baixo rendimento de DNA posterior, RNA ou proteína. O método descrito aqui permite que pequenas quantidades de tecido de um músculo fonte para uso em múltiplas aplicações, ea inclusão de cryosectioning e agulha trituração melhora homogeneização mecânica para um melhor rendimento de RNA.

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Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pela Universidade da Geórgia Institutional Animal Care e do Comitê Use sob uso de animais protocolo A2013 07-016 (Beedle).

1. Criopreservação de Músculo Esquelético Unfixed

1. Preparação
   1. Corte da cortiça em pequenos quadrados (cerca de 1 cm x 1 cm) com uma lâmina de barbear, escrever sobre a cortiça com um marcador de ponta fina que é resistente a 2-metilbutano para identificar o mouse fonte e músculos, e fazer um corte muito raso (aproximadamente 1 mm), através da superfície superior. Insira uma lamela de plástico para dentro do corte a ser usado para orientar o tecido. Repita até que a cortiça está pronta para cada tecido a ser criopreservados.
   2. Obter azoto líquido, 2-metilbutano, resina de incorporação, termómetro de baixa temperatura, rolhas, instrumentos de dissecação, e mouse estudo.
      CUIDADO: O líquido de nitrogênio é um gás comprimido que pode explodir se aquecido. Usar um jaleco, luvas de baixa temperatura, e proteção facial adequados ao manusear líquido niTrogen; entre em contato com a pele ou os olhos pode causar queimaduras ou congelamento. 2-metilbutano é um inflamável, tóxico, saúde e risco ambiental. Use equipamento de proteção individual (jaleco, luvas, óculos de segurança), abra o recipiente de estoque em um exaustor, transferir a pequena quantidade necessária para a congelação (tipicamente 200 a 400 ml) para um recipiente separado que pode ser bem fechados, e evitar a inalação .
   3. Euthanize ratos com um método aprovado da eutanásia sob anestesia. Resumidamente, insira o mouse em uma câmara de inalação com 2,5% de isoflurano em oxigênio a partir de um vaporizador de isoflurano, esperar até 20 segundos após o mouse pára de se mover para verificar se há um reflexo pedal. Quando o reflexo pedal é negativo, eutanásia o mouse estudo realizado por deslocamento cervical ^6.
      NOTA: métodos de eutanásia requerem aprovação pelo comitê de ética institucional.
   4. Retire a pele que recobre o membro posterior distal e cortou os tendões anteriores distais logo acima do tornozelo com o ponto-fino Dissetesouras ction. Segure os tendões distais com uma pinça fina e puxe para cima e em direção ao joelho durante o corte fáscia lateral, para liberar o músculo. Retire o músculo out perpendicular a partir do joelho e fazer um corte final para extirpar o músculo TA ^7.
      NOTA: O músculo TA é usado aqui como um exemplo, mas qualquer rato músculo esquelético ou o coração pode ser substituído para o TA neste protocolo se apropriado aos objetivos experimentais do usuário. A única limitação é que o tecido deve ser pequena o suficiente para conseguir a criopreservação rápida toda a sua espessura; um tamanho máximo de tecido de 1 cm x 1 cm é recomendada.
   5. Repita com a outra perna, e dissecar para fora todos os outros tecidos a serem coletados. Realizar dissecção tão rapidamente quanto possível para limitar a degradação do tecido antes da criopreservação.
   6. Orient cada músculo para seções transversais sobre a sua cortiça pré-rotulados. Levante o músculo perpendicular ao cortiça com o tendão distal tocar a cortiça e o topo da ext muscularterminando de distância, na vertical pela lamela.
   7. Criopreservar todos os tecidos para análise histológica, logo que possível após a dissecação, de preferência dentro de 5 minutos, mas definitivamente não mais do que 15 min de tempo decorrido desde a eutanásia do animal de origem.
2. criopreservação
   1. Comece o banho de arrefecimento criopreservação cinco minutos antes do final da dissecção. Pour 2-metilbutano a uma proveta de metal abertas até uma profundidade de cerca de 3 cm. Pour azoto líquido para um recipiente isolado com uma profundidade de 2 a 4 cm. Defina o copo de 2-metilbutano para o azoto líquido; o azoto irá começar a ferver. Evitar respingos de azoto no copo 2-metilbutano.
      CUIDADO: Prepare congelamento banho em um exaustor ou uma área bem ventilada.
   2. Insira um termómetro de baixa temperatura para o 2-metilbutano para monitorar a temperatura e mexa com freqüência com um garfo para garantir o esfriamento. Continuar a agitar e arrefecer até 2-methylbutane atinge -140 ° C, adicionando novo azoto líquido para o banho externo conforme necessário.
      NOTA: -140 ° C é a temperatura óptima para minimizar artefactos de cristal de gelo no músculo estriado; outros tecidos podem criopreservar melhor a diferentes temperaturas (por exemplo, cérebro, -90 ° C).
   3. Aplicar resina incorporação apenas para a parte inferior 35 - 50% do músculo onde se encontra com a rolha e a rolha cair imediatamente para o 2-metilbutano a -140 ° C. Rapidamente repetir para até 8 tecidos por lote de congelamento. Agita-se durante 30 seg, raspando a parte inferior do copo para assegurar que os tecidos não congelar para o 2-metilbutano solidificar.
   4. Use um garfo, colher entalhada ou grandes pinças para puxar cada cortiça tecido do 2-metilbutano. remover rapidamente a lamela, dab o excesso de 2-metilbutano no copo, e depois soltar a rolha de tecido para o banho de azoto exterior. Repita o procedimento para todas as rolhas restantes no copo.
   5. amostras de transferência em nitrogênio líquido ou em gelo seco paraum congelador de -80 ° C para armazenamento.
   6. Se todos os tecidos permanecem para criopreservação, repita os passos 1.2.3 a 1.2.4. Adicionar adicional de 2-metilbutano ao copo ou nitrogênio líquido para o banho exterior como necessário e re-legal para -140 ° C. Descarte utilizado 2-metilbutano como resíduos perigosos.

2. Recolher Cortes congelados para histologia e RNA Applications

1. Preparação.
   1. Pré-pesam um tubo esterilizado DNase / livre de RNase numa balança analítica. Em seguida, movê-lo para a câmara de criostato de pré-resfriamento. Repita até que os tubos estão prontos para todas as amostras criocorte agrupados para ser coletado.
   2. Para seccionamento músculo esquelético, confirmar que a temperatura da câmara de criostato é -21 a -22 ° C por seu termostato interno. Transfira os recipientes com os tecidos a serem cortados para dentro da câmara e permitir que o recipiente (s) para equilibrar com a temperatura criostato durante pelo menos 15 min antes da abertura.
   3. Coloque uma lâmina nova criostato descartável. Como alternativa, remover a lâmina existente, spray com solução de descontaminação RNase, enxaguar com DDH ₂ O, e reinserir no criostato para esfriar. Pulverize um pano limpo com álcool 70% e limpe com cuidado a plataforma de fixação da lâmina ea lâmina.
      1. Spray de um tecido limpo com uma solução de descontaminação RNase e limpe as escovas criost�icas. Spray de um tecido com _ddH2O, limpe as escovas de novo e colocá-las na câmara de criostato sobre uma superfície limpa.
         CUIDADO: A lâmina criostato deve ser coberto pelo guarda faca quando não estiver em uso. Além disso, a solução de descontaminação de ARNase é tóxico e irá congelar para formar um precipitado na câmara fria criostato. Portanto, manusear com cuidado e evitar a sua utilização na câmara de criostato.
   4. Dentro da câmara de criostato, coloque uma gota centavo de tamanho (aproximadamente 300 ul) de incorporação de resina sobre um mandril espécime quente, definir uma rolha de tecido em cima da resina, pressione para baixo, e em seguida, definir o mandril na freezing ferroviária ou sobre um elemento de congelação rápida, se disponível.
   5. Após a incorporação de resina solidifica (branco), adicione resina de embebimento adicional na parte superior da rolha, ao redor do 35% inferior do tecido e pressionar o extractor de calor para a resina a incorporação de um congelamento rápido para estabilizar melhor o tecido. Esperar 5 min antes do corte para permitir que a resina a endurecer totalmente.
   6. Certifique-se de que o prendedor de amostra está na sua posição mais recuada, o mais distante da lâmina. Insira o mandril espécime de tecido para o prendedor de amostra.
2. preparação criocorte.
   1. Solte o suporte portador da lâmina, defina o ângulo de incidência da lâmina a 10 ° (ou um ângulo apropriado para a transportadora lâmina usada), e re-apertar. Solte o freio e girar o volante para reduzir o músculo para a lâmina. Estimar a distância mais próxima entre o tecido e lâmina, em seguida, passar o tecido longe da lâmina e envolver o freio da roda mão.
   2. Solte o leve ajuste de alturaR e deslocar o porta-lâminas para a frente ou para trás, respectivamente, se a extremidade do tecido é mais do que cerca de 2 mm a partir da lâmina ou se a lâmina atinge o tecido. Apertar e diminuir o tecido novamente para verificar distância da lâmina. Repetir ajustes até que a lâmina é de 1 a 2 mm da extremidade do tecido por estimativa visual.
   3. Abaixe o tecido na direção da lâmina e avaliar ângulo de tecido para seções transversais. Bloquear a roda de mão e solte a alavanca de fixação da amostra. Empurrar o prendedor de amostra para a esquerda ou para a direita até a orientação horizontal do tecido é perpendicular à lâmina.
   4. Empurrar a amostra da braçadeira para cima ou para baixo para ajustar a orientação de "Y" de modo que as secções de tecido será perpendicular ao eixo longo do músculo. Aperte a alavanca de fixação da amostra.
   5. Use o curso e alimentação para frente bem para fazer avançar a amostra até tocar a lâmina. Se procurando seções de uma profundidade de tecido especial, redefinir a soma das espessuras de corte para zero (parte superior do tecido).
   6. Defina o criostato à função de ajuste com espessura de corte em 30 mm. Cortar e descartar secções até a profundidade pré-seleccionada para a recolha de tecido é atingido (por exemplo, 400 um a partir do topo).
3. Recolha criosecções para extração de RNA.
   1. Abra o tubo para seções de coleta e colocá-lo perto da porta-lâmina. Utilize uma escova de pré-arrefecido, limpo para apanhar cada secção, uma vez que é cortado a partir da lâmina e transferir o criocorte para dentro do tubo. Repetir até que as secções reunidas pesar 30 mg ou a profundidade do tecido desejado seja alcançado.
      NOTA: Para uma tibial anterior de ratinho adulto, recolha de profundidade de tecido de aproximadamente 400 a 4000 uM produz tipicamente 25 - 40 mg. Utilizando uma pinça de metal para transferir seções para o tubo de recolha não é recomendado como as seções tendem a ficar e aglutinar-se na superfície do metal.
   2. Se a incorporação de resina envolve o criocorte muscular, bloquear o travão de mão e usar uma lâmina de barbear pararaspar pequenos pedaços de resina até que haja apenas uma camada fina ao redor da parte superior do músculo. resina Sempre corte com a lâmina angulada de distância a partir do músculo.
      NOTA: Uma camada fina da incorporação de resina não prejudique substancialmente a preparação de RNA a jusante. Se mais espessa resina incorporação está presente, use escovas para provocá-lo longe do músculo antes de mover o criocorte para dentro do tubo de coleta.
   3. Em alternativa, as seções piscina no porta-lâminas e transferência em massa para o tubo de recolha.
      NOTA: No entanto, este método tende a ser mais lento, e as secções são mais propensos a manter e se aglomeram, o que pode reduzir a eficiência de homogeneização agulha em etapas posteriores.
   4. colocar rapidamente o tubo criocorte combinados num grupo de equilíbrio e tubo de registro do peso analítica. devolver imediatamente o tubo para a câmara de criostato frio para manter a temperatura da secção de perto de -20 ° C. Calcule o peso das secções reunidas.
      NOTA: Se o isolamento do RNA ocorrerá em anúnciodia ifferent, armazenar o tubo criocorte reunidos à temperatura de -80 ° C até à sua utilização.
4. Recolha criosecções para histologia.
   1. Pressione o botão espessura de corte de finos de secção e use as setas para definir a espessura de corte criostato a 7 mm (ou outra espessura de corte apropriado, tipicamente 6 a 10 mm).
      NOTA: Diluente secções (6-10 uM) deve ser utilizado para aplicações histológicas para assegurar que os reagentes de coloração pode penetrar na profundidade da secção de tecido. Secções finas pode ser feita a partir de qualquer profundidade durante a cryosectioning, mas secções mais profundos são os preferidos porque a incorporação de resina, o que aumenta com a profundidade do tecido, não afecte a coloração histológica.
   2. Cortar e descartar 4 a 7 secções para obter uma superfície consistente, mesmo tecido. Anote a profundidade do tecido.
   3. Cortar uma secção e orientá-la sobre a superfície do suporte de lâmina. Pegar a seção de por rapidamente e gentilmente tocar a quente (temperatura ambiente) lâmina de microscópioa seção sobre o portador da lâmina. Devolver a gaveta à temperatura ambiente. Continuar até se obter o número de lâminas desejados. Anote a profundidade do tecido final.
      NOTA: Coletando uma segunda secção (duplicado) para cada tecido é recomendado.
   4. Com o corte completo, engate o freio de roda de mão, devolver o espécime para a posição traseira mais, e remover o mandril de tecidos. Use o elemento de calor criostato para derreter a resina incorporação segurando a rolha de tecido na bucha espécime. Remover cortiça tecido, seque com o tecido, e voltar para armazenamento.
   5. Repita a partir do passo 2.1.2 para cada tecido remanescente. Permitir que as lâminas secar durante 20 minutos após o último tecido é montado. Em seguida, usar lâminas para análise histológica ou coloração de imunofluorescência ou congelamento a -80 ° C numa caixa de corrediça até que seja necessário.

3. Isolamento de ARN a partir da mistura Cortes congelados

1. extração de RNA
   1. tubo de movimento (s) de criosecções reunidas para gelo. Imediatamente adicionar umreagente de extracção de ARN orgânico em uma proporção de cerca de 1 ml de reagente por 50 mg de peso criocorte, tipicamente de 600 uL por tubo.
      CUIDADO: reagentes de isolamento de RNA são tóxico, corrosivo e irritante. Siga as instruções do fabricante para um manuseamento seguro.
   2. Usando uma seringa de 1 ml com uma agulha de calibre 18, extrair o ARN de extracção líquido-se e lavar as paredes do tubo até que todo o tecido é suspenso na solução. Tente minimizar bolhas de ar durante a homogeneização da agulha.
   3. Utilizar a ponta da agulha para misturar e dispersar quaisquer criocortes aglutinado e peças que aderem à parede do tubo. Triturar a homogeneizar por fazer passar a amostra cima e para baixo através da agulha para cinco cursos, e depois voltar a amostra em gelo. Repita os passos tanto de três a cinco vezes, ou tantas vezes quanto for necessário para perturbar todos os aglomerados e facilmente fazer passar a amostra através da agulha.
   4. Retire a agulha de calibre 18 e substituí-lo com uma agulha de calibre 22. cuidadosamente triturate a amostra para cinco cursos, e depois voltar a amostra em gelo. Repetir a trituração de três a quatro vezes para atingir um homogenato de tecido muito finamente disperso.
      NOTA: Se as partículas de tecidos começar a bloquear a agulha aquando da elaboração da amostra, expulsar todas as amostras da seringa e voltar para a agulha de calibre 18 para posterior homogeneização. Um passo adicional de trituração com uma agulha de calibre 25 ou 26 pode ser adicionado para se obter um rendimento máximo. No entanto, a agulha pode ficar obstruído, então há um risco de derramamento da amostra.
   5. Mover a amostra de gelo até à temperatura ambiente. Incubar durante 5 min a perturbar complexos moleculares.
   6. Numa hotte, adicionar 0,1 ml de 1-bromo-3-cloropentano (BCP) por 1 ml de reagente de isolamento de ARN utilizado (passo 3.1.1), tipicamente 60 ul por tubo. Agitar o tubo vigorosamente à mão durante 15 segundos (não vortex). Incubar a amostra à temperatura ambiente durante 2 a 3 min. Em seguida, centrifuga-se durante 15 min a 12000 xg e 4 ° C.
      CUIDADO: BCP é inflamável e tóxico. Pega em um exaustor e usar luvas, jaleco e óculos de segurança.
   7. Recolher cuidadosamente a fase aquosa superior (incolor) contendo ARN e transferi-lo para um tubo limpo. Adicionar um volume igual de etanol a 70% (em água com DEPC) e agitar com vortex para misturar. Incubar à temperatura ambiente durante até 10 min.
      NOTA: interfase meio e fases de fenol-BCP inferiores podem ser processadas para o ADN genómico e proteína, respectivamente, de acordo com as instruções do fabricante ou recolhidos em um recipiente de resíduos perigosos fenol-BCP para descarte apropriado.
2. purificação de ARN.
   1. Siga as instruções do fabricante para a ligação de exemplo, lavagem e eluição com pequenas variações ^8. Por exemplo:
   2. Coloque uma alíquota de água DNase / RNase em um banho C 37 ° ou incubadora para pré-aquecer para a etapa 3.2.4.
   3. Adicionar a amostra de ARN a partir de 3.1.8 acima para uma coluna de purificação e centrifugar a amostra durante 15 sega 12.000 x g à temperatura ambiente. Verter o fluxo através de volta para a mesma coluna e re-centrifugação. Repetir um tempo adicional para maximizar a ligação de RNA, e em seguida, descartar o fluxo final através.
   4. Executar passos de lavagem de acordo com as instruções do fabricante ^8. Aplicar 700 ul de tampão de lavagem (sem etanol) para a coluna, centrifugação durante 15 segundos a 12000 x g, e descartar o fluxo através.
   5. Adicionar 500 ul de tampão de lavagem (com etanol) para a coluna, centrifugação durante 15 segundos a 12000 x g, e descartar o fluxo através. Repita este passo uma vez.
   6. Girar a coluna vazia durante 1 min a 12000 xg para secar a membrana.
   7. Transferir a coluna de rotação a um RNase- limpo, tubo livre de DNase. Adicionar 40 ul de DNase água pré-aquecida até / livre de RNase (a partir de 3.2.1) para o centro da membrana da coluna. À temperatura ambiente, incubar durante 2 min e, em seguida, centrifuga-se durante 2 min a 12.000 x g.
      NOTA: O volume de eluição de 40 mL é de aproximadamente 1,3 mL por mg de originaistecido para 30 mg de criocortes reunidas. Ajustar o volume de eluição, conforme apropriado para diferentes pesos de tecido de partida, mas não reduza abaixo de 32 ul. Uma segunda eluição, utilizando-se cerca de 0,7 mL por mg de tecido original, podem ser adicionados para aumentar o rendimento de ARN total.
   8. Analisar o ARN (eluição em coluna) para a concentração e a pureza por um espectrofotómetro, electroforese, e / ou um Bioanalyzer. Armazenar o ARN a -80 ° C até ser necessário para aplicações a jusante, tais como a transcrição reversa para a PCR quantitativa ^4.
      NOTA: Um tratamento DNase é recomendada antes de usar o RNA em aplicações a jusante. Este tratamento pode ser realizado em algumas colunas de purificação de ARN antes do passo de lavagem, neste ponto específico na sequência de eluição em coluna ou sobre uma parte alíquota do ARN como o primeiro passo para qualquer aplicação a jusante. O ARN deve ser estável durante vários anos.

4. Análise histológica por imunofluorescência StaininCortes congelados g de músculo

1. protocolo de imunofluorescência simples.
   1. Use uma caneta hidrofóbica dar a volta ao grupo de seções em cada slide. Gentilmente cair PBS na área circulada (aproximadamente 80 mL para uma pequena área de superfície até 500 mL de uma grande área de superfície), tomando cuidado para não tocar os tecidos. Incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
      NOTA: Se estiver usando lâminas congeladas, retirar as lâminas de -80 ° C congelador e incubar à temperatura ambiente por 20 a 30 minutos para descongelar e seca, em seguida, proceder como acima. Pelo menos duas lâminas são necessários: uma corrediça experimental a ser incubada em anticorpo primário e secundário; e uma lâmina de controlo para o qual o anticorpo primário é excluído, o "único secundário" controle.
   2. Dica do slide para deitar fora PBS. Adicionam-se 5% de soro de burro em PBS (solução de bloqueio) à zona assinalada; ter cuidado para garantir que as seções musculares não sequem. Incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos (ou até várias horas numa câmara de humidade).
   3. Preparar a solução de anticorpo primário para analisar a regeneração muscular. Misturar a solução de bloqueio, com um anticorpo eMHC (01:40) e um anticorpo ColVI (1: 1000). Prepare cerca de 150 ul, 300 ul ou 500 ul para pequenas, médias ou grandes áreas de deslizamento, respectivamente. Vortex durante 5 segundos, e, em seguida, centrifuga-se durante 2 min a 15000 xg para sedimentar qualquer precipitado.
   4. Para slides experimentais, a ponta da lâmina para derramar off solução de bloqueio e, em seguida, adicione a solução de anticorpo primário a partir 4.1.3. Para a lâmina de controlo secundário, derrubar o slide para deitar fora solução de bloqueio e, em seguida, adicionar solução de bloqueio fresco (sem anticorpo). Incubar as lâminas numa câmara húmida a 4 ° C durante a noite.
      Nota: Quando as soluções de anticorpo pipetando em lâminas, sempre puxar o líquido a partir do topo do tubo de solução de anticorpo primário, não perturbar qualquer precipitado no fundo do tubo.
   5. Dica desliza para derramar off solução. Adicionar PBS gota a gota, a região circulada de cada slide para lavar, ponta para derramaroff, em seguida, adicionar mais PBS e incubar durante 3 a 5 min. Repetir para um total de três lavagens.
      NOTA: O tempo de lavagem é bastante flexível e pode ser alongado até 20 min, se desejar. Geralmente, o número de mudanças de solução é mais importante do que o tempo.
   6. Preparar a solução de anticorpo secundário para todas as lâminas (incluindo a lâmina de controlo secundário), utilizando uma diluição 1: 500 de anticorpos secundários acoplados-fluoróforo verde e vermelha para detectar IgG1 de ratinho (eMHC) e IgG de coelho (ColVI) e 1: 10000 de diluição de DAPI nuclear mancha.
      1. Por exemplo, mistura 1 ml de DAPI com 9 ul de _ddH2O para obter uma diluição de 1:10 de solução DAPI. Então, para um volume final de 500 ul, adicionar 1,0 ul de anti-IgG1 de ratinho-vermelha + 1,0 ul de anti-IgG de coelho-verde + 0,5 mL de 01:10 DAPI para 447,5 ul de solução de bloqueio. Vortex para misturar e centrifugar durante 2 minutos a 15,000 xg para sedimentar qualquer precipitado.
         NOTA: Idealmente, todos os anticorpos secundários devem ser da mesma espécie hospedeira.
   7. Dica os slides para deitar fora a última lavagem PBS. Adicionar solução de anticorpo secundário para cobrir todos os tecidos. Cobrir as lâminas para as proteger da luz e incubar à temperatura ambiente durante 30 min.
      NOTA: Todos os anticorpos secundários devem ser validados para ter reatividade cruzada mínima com outras espécies em experiências de marcação dupla.
   8. Lavar as lâminas, tal como descrito em 4.1.5. Após a última lavagem, a ponta da lâmina para deitar fora da PBS e definir o slide em um tecido. Adiciona-se 3 a 4 gotas de um meio de montagem aquoso ao longo de um lado.
   9. Definir a aresta de uma lamela de vidro apenas para a borda externa do meio de montagem. Utilizando uma pinça, abaixe lentamente a lamela para os tecidos e, em seguida, solte a lamela e bata suavemente em sua posição. Finalmente, pressione suavemente cada canto da lamela para estabilizá-lo.
   10. Proteger os slides da luz e armazenar a 4 ° C até o uso.
       NOTA: Para o armazenamento a longo prazo, aplicar uma camada fina de unha polonês ao longo da borda do the lamela para ajudar a prevenir o slide de secagem.
2. A avaliação histológica.
   1. Imagem os slides usando um epifluorescência ou microscópio confocal com filtros adequados para detectar eMHC (vermelho); ColVI (verde); e núcleos (azul) DAPI-manchado, tipicamente utilizando uma objectiva de 20X ^1,5.
   2. Confirmar que o sinal de fluorescência a partir de lâminas experimentais é diferente a partir da lâmina de controlo secundário para demonstrar a especificidade do eMHC e ColVI detecção ^4.
      NOTA: eMHC fibras em regeneração positivos deve ser visível a partir de cerca de 2 a 7 dias após uma lesão muscular e variavelmente em camundongos com distrofia muscular. Collagen VI está presente na matriz extracelular que rodeia as fibras musculares, vasos sanguíneos, nervos e e nos feixes de tecido conjuntivo maiores de peri- e epimísio. corante nuclear DAPI é útil para identificar as fibras musculares com núcleos centrais contra núcleos periféricos indicando a regeneração da fibra, e a presença de infiltrating células. fibras necróticas ou feridos podem manchar fracamente com o anticorpo secundário IgG de ratinho devido à detecção de IgG endógeno que penetra nas fibras do músculo através de membranas danificadas.
   3. Para quantificar a regeneração, tomar sobrepostas microscópio fotos com cada filtro fluorescente por toda a imagem. Unir as imagens eMHC, ColVI e DAPI para cada local e em seguida, alinhe as imagens para reconstruir um mapa de toda a secção ^1,5.
   4. Utilizando um software de análise, contar o número de fibras eMHC positivos e o número de fibras no total para calcular a regeneração recente (100 * (# eMHC + fibras / fibras no total) #). Além disso, a contagem do número de fibras para fora centralmente nucleadas do total de fibras para medir a regeneração durante um período mais longo (fibras 100 * (# fibras NC + / # total) ^1,5).

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Resultados

RNA criocorte muscular está em alta qualidade e proporciona um rendimento suficiente para a maioria das aplicações

As análises de dezasseis preparações de ARN do músculo esquelético estão apresentados na Tabela 1, utilizando 19,4 a 41 mg do músculo tibial anterior em pool (TA) a partir de 8 ratinhos de controlo. Tanto para a esquerda (L) e direito (R músculos) TA foram preparados em experiências de re...

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Discussão

Para obter os melhores resultados com este método, manter a incorporação de resina restrita ao terceiro ou inferior a metade do músculo durante a criopreservação de tecido porque o excesso de resina vai retardar a recolha dos criocortes reunidas e pode aumentar a incorporação de contaminação resina no isolamento de ARN. Além disso, muita atenção durante a homogeneização da agulha é importante para maximizar o rendimento e minimizar a probabilidade de entupimento da agulha. O protocolo pode ser modificado...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cork	VWR Scientific	23420-708	Cut into small squares with a sharp blade.
Plastic coverslip	Fisher Scientific	12-547	Used to orient the muscle during freezing.
Low temperature thermometer	VWR Scientific	89370-158
2-methylbutane	Sigma	M32631-4L	Caution: hazardous chemical. Store in flammable cabinet.
Embedding resin: "cryomatrix"	Thermo Fisher Scientific	6769006	Other embedding resins can be substituted for cryomatrix.
Cryostat	Thermo Fisher Scientific	microm HM550 with disposable blade carrier	Any working cryostat should be sufficient for the protocol.
Disposable cryostat blade	Thermo Fisher Scientific	3052835	Use an appropriate blade or knife for the cryostat to be used.
RNAse decontamination solution: "RNase Zap"	Thermo Fisher Scientific	AM9780
Analytical balance	Mettler Toledo	XS64
Paint brush	Daler Rowney	214900920	Use to handle cryosections. Can be found with in stores with simple art supplies.
Razor blade	VWR Scientific	55411-050
Microscope slide	VWR Scientific	48311600
RNA organic extraction reagent: TRIzol	Thermo Fisher Scientific	15596026	Caution: TRIzol is a hazardous chemical. Note: Only organic extraction reagents are recommended for RNA extraction from skeletal muscle.
18 gauge needle	VWR Scientific	BD305185
22 gauge needle	VWR Scientific	BD305155
26 gauge needle	VWR Scientific	BD305115	Optional. Can be used for a third round of sample trituration in the RNA extraction protocol.
1 ml syringe	VWR Scientific	BD309659	For very high value samples, a Luer-Lok syringe is recommended (e.g., VWR BD309628).
1-bromo-3-chloropentane (BCP)	Sigma	B9673
For 70% ethanol in DEPC water: 200 proof alcohol	Decon Laboratories, Inc.	+M18027161M	Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 ml DEPC water.
For 70% ethanol in DEPC water: DEPC-treated water	Thermo Fisher Scientific	AM9922	Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 ml DEPC water.
RNA purification kit: PureLink RNA minikit	Thermo Fisher Scientific	12183018A	Final steps of RNA preparation.
DNase/Rnase-free water	Gibco	10977	DEPC-treated water can also be used.
Spectrophotometer: Nanodrop 2000	Thermo Fisher Scientific	NanoDrop 2000
Dnase I	Thermo Fisher Scientific	AM2222	Treat purified RNA to remove any DNA contamination before downstream appications.
Hydrophobic pen	Thermo Fisher Scientific	8899
Dulbecco's PBS	Gibco	14190	PBS for immunofluorescence protocol.
Donkey serum	Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc	017-000-121	Rehydrate normal donkey serum stock according to the manufacturer's instructions, then dilute an aliquot to 5% for immunofluorescence.  Normal goat serum can also be used.
eMHC antibody	University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank	F1.652
Collagen VI antibody	Fitzgerald Industries	#70R-CR009x
Donkey anti-rabbit AlexaFluor488	Thermo Fisher Scientific	A21206
Goat anti-mouse IgG1 AlexaFluor546	Thermo Fisher Scientific	A21123
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	Thermo Fisher Scientific	D1306
Aqueous mounting media: Permafluor	Thermo Fisher Scientific	TA-030-FM	Only use mounting media designed for fluorescent applications with anti-fade properties.
Glass coverslip	VWR Scientific	16004-314	Use for mounting slides at the end of immunofluorescence protocl
Image analysis software: ImageProExpress	Media Cybernetics, Inc.	Image-Pro Express, or more advanced products	Freeware ImageJ should also work for manual counting. More advanced software with segmentation abiities may allow partial automation of the process; e.g., ImageProPremier.
Merge and map section images: Photoshop	Adobe	Photoshop
Cardiotoxin	Sigma	C9659	Sigma C9659 has been discontinued. Other options for cardiotoxin are EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; or Ge Script # RP17303; but these have not been validated.
reverse transcription kit: Superscript III First-strand synthesis system	Thermo Fisher Scientific	18080051	Any validated, high quality reverse transcription reagents can be used.
Standard PCR: GoTaq Flexi polymerase system	Promega	M8298	Any validated, high quality Taq polymerase system can be used. If DNA sequencing is to be used for any application downstream of the PCR, then a high fidelity PCR system should be used instead.
SYBR green	Thermo Fisher Scientific	S7585	For use in qPCR when not using a dedicated qPCR master mix. Use with SuperROX (for Applied Biosystems instruments) and GoTaq Flexi polymerase and buffers.
ROX: SuperROX, 15 mM	BioResearch Technologies, Inc. Novato CA	SR-1000-10	SuperROX is more stable in the PCR reaction, so it is preferred for use as a qPCR passive reference dye over ROX (carboxy-X-rhodamine). For qPCR with Applied Biosystems instruments
Real-time PCR	Applied Biosystems	7900HT