Isolierung von Typ I und Typ II Perizyten aus Maus Skelettmuskeln

Zusammenfassung

Diese Arbeit beschreibt ein FACS-basiertes Protokoll, das eine einfache und gleichzeitige Isolierung von Typ I und Typ II Perizyten aus Skelettmuskeln ermöglicht.

Zusammenfassung

Pericytes sind perivaskuläre multipotenten Zellen, die Heterogenität in verschiedenen Organen oder sogar innerhalb desselben Gewebes zeigen. In Skelettmuskeln gibt es mindestens zwei pericyte Subpopulationen (genannt Typ I und Typ II), die unterschiedliche molekulare Marker exprimieren und unterschiedliche Differenzierungsfähigkeiten aufweisen. Unter Verwendung von NG2-DsRed- und Nestin-GFP-Doppel-transgenen Mäusen wurden Typ I (NG2-DsRed ⁺ Nestin-GFP-) und Typ-II (NG2-DsRed ⁺ Nestin-GFP ⁺ ) Perizyten erfolgreich isoliert. Die Verfügbarkeit dieser doppelt-transgenen Mäuse verhindert jedoch die weit verbreitete Anwendung dieser Reinigungsmethode. Diese Arbeit beschreibt ein alternatives Protokoll, das die einfache und gleichzeitige Isolierung von Typ I und Typ II Perizyten aus Skelettmuskeln ermöglicht. Dieses Protokoll nutzt die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) -Technik und zielt auf PDGFRβ und nicht auf NG2 zusammen mit dem Nestin-GFP-Signal. Nach der Isolation geben Sie I und ty einPe II pericytes zeigen deutliche Morphologien. Darüber hinaus sind Typ I und Typ II Perizyte, die mit dieser neuen Methode isoliert wurden, wie diejenigen, die aus den doppelt-transgenen Mäusen isoliert wurden, adipogen und myogenisch. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieses Protokoll verwendet werden kann, um pericyte Subpopulationen aus Skelettmuskeln und möglicherweise aus anderen Geweben zu isolieren.

Einleitung

Muskeldystrophie ist eine Muskel-degenerative Erkrankung, die bisher keine wirksamen Behandlungen hat. Die Entwicklung von Therapien, die die Geweberegeneration fördern, war schon immer von großem Interesse. Geweberegeneration und Reparatur nach Schädigung hängen von residenten Stammzellen / Vorläuferzellen ab ¹ . Satellitenzellen sind myogene Vorläuferzellen, die zur Muskelregeneration beitragen ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7} . Ihre klinische Anwendung wird jedoch durch ihre begrenzte Migration und niedrige Überlebensrate nach der Injektion sowie durch ihre verminderte Differenzierungsfähigkeit nach in vitro Verstärkung ^{8 , 9 , 10 , 11} behindert. Zusätzlich zu satelliTe-Zellen, Skelettmuskeln enthalten auch viele andere Zellpopulationen mit myogenem Potenzial ^{12 , 13 , 14 , 15 , 16} , wie Plättchen-abgeleitete Wachstumsfaktor-Rezeptor-beta (PDGFRβ) -positive interstitielle Zellen. Es gibt Hinweise darauf, dass Muskel-abgeleitete PDGFRβ ⁺ -Zellen in der Lage sind, sich in myogene Zellen zu differenzieren und die Muskelpathologie und die Funktion ^{14 , 17 , 18 , 19 , 20} zu verbessern. PDGFRβ dominiert überwiegend Perizyten ²¹ , die perivaskuläre Zellen mit Pluripotenz ^{22 , 23 sind} . Zusätzlich zu PDGFRβ werden auch viele andere Marker, darunter Neuron-Glial 2 (NG2) und CD146, verwendetZirbeln ²¹ Es ist jedoch zu beachten, dass keiner dieser Marker pericytspezifisch ist. Jüngste Studien zeigten zwei Subtypen von Muskelpericyten, genannt Typ I und Typ II, die unterschiedliche molekulare Marker exprimieren und unterschiedliche Funktionen ausführen ^{19 , 24 , 25} . Biochemisch sind Typ I Perizyten NG2 ⁺ Nestin ^- , während Typ II Perizyten NG2 ⁺ Nestin ^{+ 19 , 24 sind} . Funktionell können Typ I Perizyten adipogene Differenzierung unterliegen, was zur Fettansammlung und / oder Fibrose beiträgt, während Typ-Periziten des Typs II entlang des myogenen Weges differenzieren können, was zur Muskelregeneration ^{19 , 24 , 25} beiträgt. Diese Ergebnisse zeigen, dass: (1) Typ I Perizyten kann bE in der Behandlung von fetthaltigen degenerativen Störungen / Fibrose gezielt, und (2) Typ II Perizyten haben ein großes therapeutisches Potential für die Muskeldystrophie. Eine weitere Untersuchung und Charakterisierung dieser Populationen erfordert ein Isolationsprotokoll, das die Trennung von Typ I und Typ II Perizyten auf einem hohen Reinheitsgrad ermöglicht.

Derzeit besteht die Isolierung von Pericyt-Subpopulationen auf NG2-DsRed- und Nestin-GFP-Doppel-transgenen Mäusen ^{19 , 24} . Die Verfügbarkeit von NG2-DsRed-Mäusen und die Qualität der meisten NG2-Antikörper begrenzen die weit verbreitete Anwendung dieser Methode. Da alle NG2 ⁺ pericytes auch PDGFRβ in den Skelettmuskeln ^{19 , 20 , 24} exprimieren, wird vermutet, dass NG2 durch PDGFRβ zur Isolierung von Perizyten und deren Subpopulationen ersetzt werden kann. Diese Arbeit beschreibt ein FACS-basiertes Protokoll, dasVerwendet PDGFRβ-Färbung und das Nestin-GFP-Signal. Diese Methode ist weniger anspruchsvoll für die Ermittler, weil: (1) es nicht den NG2-DsRed-Hintergrund erfordert und (2) es verwendet kommerziell erhältliche PDGFRβ-Antikörper, die gut charakterisiert sind. Darüber hinaus ermöglicht es die gleichzeitige Isolierung von Typ I und Typ II Perizyten in hoher Reinheit, was eine weitere Untersuchung der biologischen und therapeutischen Potenziale dieser Pericyt-Subpopulationen ermöglicht. Nach der Reinigung können diese Zellen in Kultur gezüchtet werden, und ihre Morphologien können sichtbar gemacht werden. Diese Arbeit zeigt auch, dass Typ I und Typ II Perizyme, die nach dieser Methode isoliert wurden, wie diejenigen, die aus doppelt-transgenen Mäusen gereinigt wurden, adipogene und myogene sind.

Protokoll

Wildtype und Nestin-GFP-transgene Mäuse wurden in der Tierfabrik an der University of Minnesota untergebracht. Alle experimentellen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der University of Minnesota genehmigt und waren im Einklang mit dem NIH Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren.

1. Muskel-Dissektion und Einzelzell-Isolation

1. Euthanisieren erwachsene Mäuse (6-10 Wochen, männlich und weiblich) mit Tribromethanol (250 mg / kg, ip) und sterilisieren ihre Bauchhaut mit 70% Ethanol.
   HINWEIS: Tribromethanol wurde hier anstelle von Ketamin für Anästhesie / Euthanasie verwendet, da Ketamin bekannt ist, mit den NMDA-Rezeptoren zu interagieren, was möglicherweise Auswirkungen auf die Studie haben könnte.
2. Legen Sie die Mäuse in die Rückenlage und verwenden Sie ein Skalpell, um einen horizontalen Schnitt auf der Bauchhaut zu machen. Ziehen Sie die Haut von Hand ab und ziehen Sie in entgegengesetzte Richtungen, um die Hinterbeinmuskeln auszusetzen.
3. CollecDie Muskeln von beiden Hinterbeinen mit Pinzette und Schere. Lagern Sie sie in steriler Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), ergänzt mit 1% Penicillin-Streptomycin (P / S) auf Eis.
4. Waschen Sie die seziertes Hindlimb-Muskeln in eiskaltem PBS, das mit 1% P / S zweimal ergänzt wird, und übertragen Sie es auf eine sterile 10 cm Platte.
5. Sorgfältig sezieren Nerven, Blutgefäße und Bindegewebe aus den Muskeln mit Pinzette und Schere unter einem Seziermikroskop bei 2facher Vergrößerung.
6. Die Muskeln in kleine Stücke (1-2 mm ³ ) mit sterilen Scheren und Klingen fein hacken und zerkleinern. Wenn nötig, füge eine kleine Menge Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) hinzu, um sicherzustellen, dass die Muskeln nicht ausgetrocknet sind.
7. Mechanisch das Gewebe durch Pipettieren auf und ab durch eine 10 mL serologische Pipette 10 mal brechen.
8. Fügen Sie frisch hergestellte Verdauungslösung (DMEM, ergänzt mit 0,2% Typ 2 Kollagenase) zu der Mischung hinzu. Inkubieren bei 37 ° C für 2 h mit GentlAufregung bei 35 Umdrehungen / min.
9. Triturat unter Verwendung einer 18 G-Nadel, um die Mischung zu homogenisieren. Dann bei 500 xg für 5 min zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und dann das Pellet in 0,25% Trypsin / EDTA resuspendieren. Inkubieren bei 37 ° C für 10 min. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt zwei weitere Male.
10. Zugabe von 10 ml DMEM, ergänzt mit 20% fötalem Rinderserum (FBS) zur Lösung und zentrifugieren bei 500 xg für 5 min. Den Überstand verwerfen und das Pellet in rotem Blutzellen-Lysepuffer (155 mM NH ₄ Cl, 10 mM KHCO ₃ und 0,1 mM EDTA) resuspendieren.
11. Zentrifuge bei 500 xg für 5 min. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in Sortierpuffer (20 mM HEPES, pH 7,0, 1 mM EDTA und 1% BSA in Ca / Mg ²⁺ -freiem PBS, pH 7,0). Filtriere die Mischung durch einen 40 μm-Zellsieb, um eine Einzeller-Suspension zu erhalten.
12. Zentrifuge bei 500 xg für 5 min. Den Überstand verwerfen und das Pellet in 1 ml Sortierpuffer resuspendieren.
13. Zähle dieZellzahl mit einem Hämocytometer und verdünnen die Einzeller-Suspension auf 5 x 10 ⁶ / ml in Sortierpuffer.

2. Zellfärbung und Sortierung

1. Bereiten Sie die Kontrollen und die Probe wie in Tabelle 1 beschrieben vor. Färben Sie die Einzelzellsuspension mit den jeweiligen Antikörpern auf Eis für 30 min, wie in Tabelle 1 beschrieben.
2. Bei 500 xg für 5 min zentrifugieren und die Pellets zweimal mit Sortierpuffer waschen.
3. Fügen Sie DAPI zu den Einzelzelllösungen hinzu, wie in Tabelle 1 angegeben. Verwenden Sie für die DAPI-Einfarbenkontrolle 5 μg / ml DAPI (Endkonzentration) und 1 μg / ml DAPI für die PDGFRβ-PE-FMO-Kontrolle und die Probe. Halten Sie alle Röhren auf Eis während des Experiments.
4. Schalten Sie den Sortierer und die Software ein. Scannen und Einfügen eines 100 μm Sortierchips, wenn Sie dazu aufgefordert werden.
5. Führen Sie die automatische Einrichtung ( dh Chip-Ausrichtung, Tröpfchen-Kalibrierung, Seitenstrom-Kalibrierung und Sortierverzögerung KalibrierungOn) durch Laden der automatischen Setup-Perlen, wenn Sie dazu aufgefordert werden.
6. Wenn das automatische Setup abgeschlossen ist, gehen Sie auf die Registerkarte "Experiment", klicken Sie auf "Neu" und wählen Sie die "Leere Vorlage" aus "Öffentliche Vorlagen".
7. Unter "Messeinstellungen" geben Sie "DAPI" für "FL1", "Nestin-GFP" für "FL2" und "PDGFRβ" für "FL3" ein. Deaktivieren Sie die Felder für "FL4" - "FL6".
8. Überprüfen Sie die Kästchen, um die 405, 488 und 561 Laser zu aktivieren und klicken Sie auf "Neues Experiment erstellen".
9. Wählen Sie den "Start Compensation Wizard" -Option und folgen Sie den "Compensation Wizard" Software-Aufforderungen, um die Kompensation einzurichten.
   1. Laden Sie das ungefärbte Steuerelement und klicken Sie auf "Start". Klicken Sie auf "Detector & Threshold Settings" und stellen Sie die Sensorverstärkung der FSC- und BSC-Detektoren ein, um die Population auf die Waage zu stellen.
   2. AnzeigeNur die Verstärkungsstufen der FL1-FL3 Fluoreszenzkanäle, um die negativen Populationen auf der linken Seite der Histogramme zu platzieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Record", um die Daten aufzuzeichnen.
   3. Laden Sie einfarbige Kontrollen eins nach dem anderen, wenn Sie dazu aufgefordert werden. Klicken Sie auf "Start und Record", um die Daten aufzuzeichnen. Passen Sie die Tore für die positiven Populationen an den Histogrammen an. Weiter klicken."
   4. Gehen Sie auf "Matrix berechnen" auf der Registerkarte "Kompensation" und klicken Sie im Feld "Berechnungsberechnung berechnen" auf "Berechnen", um die Kompensation durchzuführen. Klicken Sie auf "Finish", um den "Compensation Wizard" zu verlassen.
10. Laden Sie das PDGFRβ-PE-FMO-Steuerelement und klicken Sie auf "Start". Zeichnen Sie ein Polygon-Tor (Gate A) um die Zellen von Interesse unter dem "All Events" -Plot.
11. Doppelklicken Sie auf Gate A, um ein Kind zu erstellen. Ändern Sie die Y-Achse in DAPI und zeichnen Sie ein Polygon-Gate (Gate B) um lebende (DAPI- ^low ) Zellen. Doppelklicken Sie auf iNside Gate B, um ein Kind zu erstellen. Ändern Sie die X-Achse in FSC-H und die Y-Achse in FSC-W und ziehen Sie ein Polygon-Gate (Gate C) um die Singlets, um Dubletten zu eliminieren.
12. Doppelklicken Sie auf Gate C, um ein Kind zu erstellen. Ändern Sie die X-Achse zu Nestin-GFP und die Y-Achse zu PDGFRβ-PE. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Record", um die Daten aufzuzeichnen.
13. Laden Sie die Probe und wiederholen Sie die Schritte 2.11-2.12. Nach der Aufnahme klicken Sie auf "Pause", um das Sample zu behalten.
14. Definieren Sie die Gating-Grenzen für PDGFRβ ⁺ und Nestin-GFP ⁺ -Zellen auf Basis der PDGFRβ-PE-FMO-Kontrolle. Zeichnen Sie Tore für die PDGFRβ ⁺ Nestin-GFP- und PDGFRβ ⁺ Nestin-GFP ⁺ Populationen.
15. Unter "Sortiermethode" wählen Sie "2-Wege-Tubes" und weisen "PDGFRβ ⁺ Nestin-GFP-" - und "PDGFRβ ⁺ Nestin-GFP ⁺ " Zellen den linken und rechten Sammelröhren zuGesund Montieren Sie die Sortierpuffer-gefüllten 15 ml Sammelröhrchen auf der Sammelstufe und klicken Sie auf die Schaltfläche "Sammlung laden".
16. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Fortsetzen", um das Sample zu beenden. Klicken Sie auf "Start Sort", um PDGFRβ ⁺ Nestin-GFP ^- (Typ I Perizyten) und PDGFRβ ⁺ Nestin-GFP ⁺ (Typ II Perizyten) Zellen zu sammeln.

3. Nachsortierung von Analysen

1. Die sortierten Zellen bei 500 xg für 5 min zentrifugieren, das Pellet in 1 ml Pericyt- Medium resuspendieren (siehe Materialtabelle ) und die Zelldichte mit einem Hämocytometer zählen.
2. Samen Typ I und Typ II Perizyten auf Poly-D-Lysin (PDL) -beschichtete Deckgläser bei ~ 1 x 10 ⁴ Zellen / cm ² . In Perizy-Medium für 3 Tage bei 37 ° C mit 5% CO ₂ wachsen.
3. Am Tag 3 untersuchen Sie die Perizy-Morphologie (unter Phasenkontrast) und die endogene Nestin-GFP-Expression mit einem fluoreszierenden MikroUmfang (Anregungslaser: 488 nm, Anregungsfilter: 470/40 nm und Emissionsfilter: 515/30 nm). Nehmen Sie Bilder unter einem 20X Ziel (0.45 NA).
4. Ersetzen Sie das Pericyt-Medium durch adipogene (Maus-MSC-basale Medium + adipogene stimulatorische Ergänzung) und myogenes (DMEM + 2% Pferdeserum) Medium, um adipogene und myogene Differenzierung zu initiieren, wie zuvor beschrieben ²⁰ . Ändern Sie das Medium alle 2-3 Tage.
5. Fixieren Sie die Zellen am Tag 17 (14 Tage nach adipogener / myogener Differenzierung) in 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: Vorsicht, PFA ist ein Karzinogen.
6. Führen Sie die Immunzytochemie gegen Perilipin (Adipozytenmarker) und S-Myosin (reifer Myotube / Myofaser-Marker) durch, wie in früheren Publikationen ^{19 , 20} beschrieben.
   1. Die festen Zellen 3 mal in PBS für 10 min bei Raumtemperatur waschen.
   2. Blockierpuffer hinzufügen (PBSErgänzt mit 5% Eselserum, 3% BSA und 0,3% Triton X-100) und bei Raumtemperatur 1 h inkubieren.
   3. Inkubieren Sie die Zellen mit Anti-Perilipin (2 & mgr; g / ml) und / oder Anti-S-Myosin (2 & mgr; g / ml) Antikörper bei 4 ° C über Nacht.
   4. Die Zellen 3 mal in PBS für 10 min bei Raumtemperatur waschen.
   5. Inkubieren Sie die Zellen mit Alexa 555 Esel Anti-Kaninchen (4 μg / ml) und / oder Alexa555 Esel Anti-Maus (4 μg / ml) Antikörper bei Raumtemperatur für 1 h.
   6. Die Zellen 3 mal in PBS für 10 min bei Raumtemperatur waschen.
   7. Montieren Sie die immunfärbenden Zellen mit dem DAPI enthaltenden Befestigungsmedium (siehe Tabelle der Materialien). Untersuchen Sie die Perilipin- und S-Myosin-Expression mit einem Fluoreszenzmikroskop (Anregungslaser: 543 nm, 540/45 nm Anregung und 600/50 nm Emission) und nehmen Sie Bilder unter einem 40X-Objektiv (0,60 NA) auf.

Ergebnisse

FACS-Parameter, einschließlich Laserintensität und Kanalkompensation, werden auf der Grundlage der Ergebnisse der ungefärbten Steuerung und der einfarbigen Steuerung korrigiert. Die PDGFRβ-PE-FMO-Kontrolle wird verwendet, um das Gating für die PDGFRβ-PE ⁺ -Population einzustellen (Abbildung 1A ). Unter den PDGFRβ-PE ^- Zellen sind zwei Populationen, die Nestin-GFP ⁺ und Nestin-GFP ^- Zellen darstellen, klar ge...

Diskussion

Perizythen sind multipotenten perivaskulären Zellen ^{22 , 23, die} sich auf der abluminalen Oberfläche der Kapillaren ^{21 , 26 befinden} . In Skelettmuskeln können Perizyten entlang der adipogenen und / oder myogenen Wege ^{19 , 20 , 24} differenzieren. Jüngste Studien zeigten zwei Subpopulationen von Perizyten mit...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Sorter	Sony	SH800
Automatic Setup Beads	Sony	LE-B3001
DMEM	Gibco	11995
Avertin	Sigma	T48402
Pericyte Growth Medium	ScienCell	1201
MSC Basal Medium (Mouse)	Stemcell Technologies	5501
Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse)	Stemcell Technologies	5503
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000
Horse Serum	Sigma	H1270
Collagenase Type 2	Worthington	LS004176
0.25% Trypsin/EDTA	Gibco	25200
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140
PDL	Sigma	P6407
PDGFRβ-PE Antibody	eBioscience	12-1402
Perilipin Antibody	Sigma	P1998
S-Myosin Antibody	DSHB	MF-20
Alexa 555-anti-rabbit antibody	ThermoFisher Scientific	A-31572
Alexa 555-anti-mouse antibody	ThermoFisher Scientific	A-31570
Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
DAPI	ThermoFisher Scientific	D1306
HEPES	Gibco	15630
EDTA	Fisher	BP120
BSA	Sigma	A2058
NH4Cl	Fisher Scientific	A661
KHCO3	Fisher Scientific	P184
PBS	Gibco	14190
18G Needles	BD	305196
10ml Serological Pipette	BD	357551