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Resumo

Este trabalho descreve um protocolo baseado em FACS que permite o isolamento fácil e simultâneo de pericitos tipo I e tipo II dos músculos esqueléticos.

Resumo

Pericitos são células multipotentes perivasculares que mostram heterogeneidade em diferentes órgãos ou mesmo dentro do mesmo tecido. Nos músculos esqueléticos, há pelo menos duas subpopulações de pericitos (chamadas de tipo I e tipo II), que expressam diferentes marcadores moleculares e possuem distintas capacidades de diferenciação. Utilizando ratinhos duplamente transgénicos NG2-DsRed e Nestin-GFP, os pericitos de tipo I (NG2-DsRed + Nestin-GFP-) e de tipo II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ) foram isolados com sucesso. Contudo, a disponibilidade destes ratinhos duplamente transgénicos impede o uso generalizado deste método de purificação. Este trabalho descreve um protocolo alternativo que permite o isolamento fácil e simultâneo de pericitos tipo I e tipo II a partir de músculos esqueléticos. Este protocolo utiliza a técnica de triagem de células activada por fluorescência (FACS) e alvos PDGFRβ, em vez de NG2, juntamente com o sinal de Nestin-GFP. Após o isolamento, o tipo I e tyOs pericitos II apresentam morfologias distintas. Adicionalmente, os pericitos de tipo I e de tipo II isolados com este novo método, como os isolados a partir de ratinhos duplamente transgénicos, são adipogénicos e miogénicos, respectivamente. Esses resultados sugerem que este protocolo pode ser utilizado para isolar subpopulações de pericitos dos músculos esqueléticos e, possivelmente, de outros tecidos.

Introdução

A distrofia muscular é uma desordem músculo-degenerativa que não tem nenhum tratamento eficaz até agora. O desenvolvimento de terapias que promovem a regeneração de tecidos tem sido sempre de grande interesse. A regeneração e reparação dos tecidos após os danos dependem das células estaminais / células progenitoras residentes 1 . As células satélites são células precursoras miogénicas comprometidas que contribuem para a regeneração muscular 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . O seu uso clínico, no entanto, é dificultado pela sua migração limitada e baixa taxa de sobrevivência após a injecção, bem como pela sua diminuição da capacidade de diferenciação após a amplificação in vitro 8 , 9 , 10 , 11 . Além do satelliTe células, os músculos esqueléticos também contêm muitas outras populações de células com potencial miogénico 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , tais como as células intersticiais positivas ao receptor de factor de crescimento derivado de plaquetas beta (PDGFRp). Há evidências que demonstram que as células PDGFRβ + derivadas de músculo são capazes de se diferenciar em células miogênicas e melhorar a patologia e a função muscular 14 , 17 , 18 , 19 , 20 . O PDGFRβ rotula predominantemente os pericitos 21 , que são células perivasculares com pluripotência 22 , 23 . Além de PDGFRβ, muitos outros marcadores, incluindo Neuron-Glial 2 (NG2) e CD146, também são usados ​​para iDentify pericytes 21 . Deve-se notar, no entanto, que nenhum desses marcadores é pericítico-específico [ 21] . Estudos recentes revelaram dois subtipos de pericitos musculares, chamados de tipo I e tipo II, que expressam marcadores moleculares diferentes e exercem funções distintas 19 , 24 , 25 . Bioquimicamente, os pericitos do tipo I são NG2 + Nestin - , enquanto os pericídios do tipo II são NG2 + Nestin + 19 , 24 . Funcionalmente, os pericitos tipo I podem sofrer diferenciação adipogênica, contribuindo para acúmulo de gordura e / ou fibrose, enquanto que os pericitos de tipo II podem se diferenciar ao longo da via miogênica, contribuindo para a regeneração muscular 19 , 24 , 25 . Estes resultados demonstram que: (1) os pericitos de tipo I podem bE alvo no tratamento de transtornos degenerativos gordos / fibrose, e (2) pericitos de tipo II têm grande potencial terapêutico para a distrofia muscular. Outras investigações e caracterização destas populações requerem um protocolo de isolamento que permita a separação dos pericitos tipo I e tipo II com alto grau de pureza.

Atualmente, o isolamento de subpopulações pericíticas depende de camundongos duplamente transgênicos NG2-DsRed e Nestin-GFP 19,24. A disponibilidade de ratinhos NG2-DsRed ea qualidade da maioria dos anticorpos NG2 limitam o uso generalizado deste método. Dado que todos os pericitos NG2 + também expressam PDGFRβ nos músculos esqueléticos 19 , 20 , 24 , hipótese de que NG2 pode ser substituído por PDGFRβ para o isolamento de pericitos e suas subpopulações. Este trabalho descreve um protocolo baseado em FACS queUtiliza a coloração PDGFRβ e o sinal Nestin-GFP. Este método é menos exigente para os investigadores porque: (1) não requer o fundo NG2-DsRed e (2) utiliza anticorpos PDGFRβ comercialmente disponíveis, que são bem caracterizados. Além disso, permite o isolamento simultâneo de pericitos tipo I e tipo II com elevada pureza, permitindo uma investigação mais aprofundada da biologia e potencial terapêutico destas subpopulações de pericitos. Após purificação, estas células podem ser cultivadas em cultura, e as suas morfologias podem ser visualizadas. Este trabalho também mostra que os pericitos tipo I e tipo II isolados usando este método, como os purificados a partir de camundongos duplamente transgênicos, são adipogênicos e miogênicos, respectivamente.

Protocolo

Os ratinhos transgénicos de tipo selvagem e Nestin-GFP foram alojados na instalação animal na Universidade de Minnesota. Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Minnesota e estavam de acordo com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Dissecção muscular e isolamento de célula única

  1. Euthanize camundongos adultos (6-10 semanas, ambos do sexo masculino e feminino) com tribromoetanol (250 mg / kg, ip) e esterilizar a pele do abdômen com etanol 70%.
    NOTA: O tribromoetanol foi usado aqui em vez de cetamina para anestesia / eutanásia, já que a ketamina é conhecida por interagir com os receptores NMDA, o que poderia potencialmente ter um impacto no estudo.
  2. Coloque os ratos na posição supina e use um bisturi para fazer uma incisão horizontal na pele abdominal. Descasque a pele com a mão, puxando em direções opostas para expor os músculos dos membros posteriores.
  3. ColecionarT os músculos de ambos os membros posteriores usando fórceps e tesoura. Armazená-los em solução salina tamponada com fosfato (PBS) estéril suplementada com 1% de penicilina-estreptomicina (P / S) em gelo.
  4. Lavar os músculos do membro posterior dissecados em PBS gelado suplementado com P / S a 1% duas vezes e transferi-los para uma placa estéril de 10 cm.
  5. Cuidadosamente dissecar os nervos, vasos sanguíneos e tecido conjuntivo dos músculos usando pinças e tesoura sob um microscópio de dissecção em 2X ampliação.
  6. Cortar finamente e picar os músculos em pedaços pequenos (1-2 mm 3 ) usando tesouras estéreis e lâminas. Se necessário, adicionar uma pequena quantidade de Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) para garantir que os músculos não são secos.
  7. Quebrar mecanicamente o tecido por pipetagem para cima e para baixo através de uma pipeta serológica de 10 ml 10 vezes.
  8. Adicionar a solução de digestão recentemente preparada (DMEM suplementado com colagenase de tipo 2 a 0,2%) à mistura. Incubar a 37 ° C por 2 h com gentlAgitação a 35 revoluções / min.
  9. Triturar utilizando uma agulha de 18 G para homogeneizar a mistura. Em seguida, centrifugar a 500 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante e depois ressuspender o sedimento em 0,25% de tripsina / EDTA. Incubar a 37 ° C durante 10 min. Repita o passo de centrifugação mais duas vezes.
  10. Adicionar 10 mL de DMEM suplementado com 20% de soro fetal bovino (FBS) à solução e centrifugar a 500 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em tampão de lise de células vermelhas do sangue (NH4Cl 155 mM, KHCO3 10 mM e EDTA 0,1 mM).
  11. Centrifugar a 500 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em tampão de separação (HEPES 20 mM, pH 7,0, EDTA 1 mM e BSA a 1% em PBS livre de Ca / Mg2 + , pH 7,0). Filtrar a mistura através de um filtro de células de 40 um para obter uma suspensão de célula única.
  12. Centrifugar a 500 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 mL de tampão de separação.
  13. Conte oNúmero de células com um hemocitômetro e diluir a suspensão de célula única para 5 x 10 6 / mL em tampão de triagem.

2. Coloração e Classificação de Células

  1. Preparar os controlos ea amostra conforme descrito na Tabela 1 . Mancha a suspensão de célula única com os respectivos anticorpos em gelo durante 30 min, como descrito na Tabela 1 .
  2. Centrifugar a 500 xg durante 5 min e lavar os pellets duas vezes com tampão de separação.
  3. Adicionar DAPI às soluções de célula única, como indicado na Tabela 1. Utilizar 5 μg / mL de DAPI (concentração final) para o controlo de cor única DAPI e 1 μg / mL de DAPI para o controlo de PDGFRβ-PE-FMO e para a amostra. Manter todos os tubos em gelo durante todo o experimento.
  4. Ative o classificador e o software. Digitalize e insira um chip de classificação de 100 μm quando solicitado.
  5. Execute a configuração automática ( ie, alinhamento de chip , calibração de gotículas, calibração de fluxo lateral e calibração de atraso de classificaçãoOn) carregando os grânulos de configuração automática quando solicitado.
  6. Quando a configuração automática estiver concluída, vá para a guia "Experiência", clique em "Novo" e selecione o "Modelo em Branco" em "Modelos Públicos".
  7. Em "Configurações de medição", digite "DAPI" para "FL1", "Nestin-GFP" para "FL2" e "PDGFRβ" para "FL3." Desmarque as caixas de "FL4" - "FL6".
  8. Marque as caixas para ativar os lasers 405, 488 e 561 e clique em "Criar Experiência Nova".
  9. Selecione a opção "Start Compensation Wizard" e siga as instruções do software "Compensation Wizard" para configurar a compensação.
    1. Carregar o controle sem cor e clique em "Iniciar". Clique em "Detector & Threshold Settings" e ajuste o ganho do sensor dos detectores FSC e BSC para colocar a população na escala.
    2. de AnúnciosApenas os níveis de ganho dos canais de fluorescência FL1-FL3 para colocar as populações negativas no lado esquerdo dos histogramas. Clique no botão "Gravar" para gravar os dados.
    3. Carregar controles de uma cor um por um quando solicitado. Clique em "Iniciar e Gravar" para gravar os dados. Ajustar os portões para as populações positivas nos histogramas. Clique em "Avançar".
    4. Vá para "Calcular matriz" na guia "Compensação" e clique em "Calcular" no painel "Calcular configurações de compensação" para executar a compensação. Clique em "Concluir" para sair do "Assistente de compensação".
  10. Carregue o controle PDGFRβ-PE-FMO e clique em "Iniciar". Desenhe um portão de polígono (Portão A) em torno das células de interesse sob o gráfico "Todos os Eventos".
  11. Clique duas vezes dentro do portão A para criar um gráfico filho. Altere o eixo Y para DAPI e desenhe uma porta poligonal (Gate B) em torno de células vivas (DAPI low ). Clique duas vezes em iNside Gate B para criar um enredo filho. Mude o eixo X para FSC-H e o eixo Y para FSC-W e desenhe uma porta poligonal (Gate C) em torno dos singlets para eliminar dupletos.
  12. Clique duas vezes dentro do Gate C para criar um gráfico filho. Mudar o eixo X para Nestin-GFP e o eixo Y para PDGFRβ-PE. Clique no botão "Gravar" para gravar os dados.
  13. Carregue a amostra e repita os passos 2.11-2.12. Após a gravação, clique em "Pausar" para preservar a amostra.
  14. Definir os limites de passagem para as células PDGFRβ + e Nestin-GFP + com base no controlo PDGFRβ-PE-FMO. Draw portões para o PDGFRβ + Nestin-GFP - e PDGFRβ + Nestin-GFP + populações.
  15. Em "Método de classificação", selecione "Tubos de 2 vias" e atribua as células "PDGFRβ + Nestin-GFP - " e "PDGFRβ + Nestin-GFP + " aos tubos coletores esquerdo e direitoEspecificamente. Montar os tubos de recolha de 15 mL de tampão de triagem na fase de recolha e clicar no botão "Carregar colecção".
  16. Clique no botão "Continuar" para manter a amostra em execução. Clique em "Start Sort" para coletar as células PDGFRβ + Nestin-GFP - (tipo I) e células PDGFRβ + Nestin-GFP + (tipo II pericytes).

3. Análises pós-triagem

  1. Centrifugar as células classificadas a 500 xg durante 5 min, ressuspender a pastilha em 1 mL de meio pericito (ver Tabela de Materiais ) e contar a densidade celular utilizando um hemocitómetro.
  2. Os pericitos tipo I e tipo II de sementes em lamínulas revestidas com poli-D-lisina (PDL) a ~ 1 x 10 4 células / cm2. Crescer em meio pericíto durante 3 dias a 37 ° C com 5% de CO2.
  3. No dia 3, examinar a morfologia do pericito (sob contraste de fase) e endógena Nestin-GFP expressão utilizando um micro fluorescenteÂmbito (laser de excitação: 488 nm, filtro de excitação: 470/40 nm, e filtro de emissão: 515/30 nm). Tire as imagens com um objetivo de 20X (0,45 NA).
  4. Substituir o meio pericítico por meio adipogênico (meio basal MSC + suplemento estimulante adipogênico) e miogênico (DMEM + 2% soro de cavalo) para iniciar a diferenciação adipogênica e miogênica, respectivamente, conforme descrito anteriormente 20 . Alterar o meio a cada 2-3 dias.
  5. Fixar as células no dia 17 (14 dias após a diferenciação adipogénica / miogénica) em paraformaldeído a 4% (PFA) durante 20 min à temperatura ambiente.
    NOTA: Cuidado, PFA é um carcinógeno.
  6. Realizar imunocitoquímica contra perilipina (marcador de adipócito) e S-miosina (marcador de miotubo maduro / miofibra), conforme descrito em publicações anteriores 19 , 20 .
    1. Lavar as células fixas 3 vezes em PBS durante 10 min à temperatura ambiente.
    2. Adicionar tampão de bloqueio (PBSSuplementado com soro de burro a 5%, BSA a 3% e Triton X-100 a 0,3%) e incubar à temperatura ambiente durante 1 h.
    3. Incubar as células com anticorpos anti-perilipina (2 μg / mL) e / ou anti-S-miosina (2 μg / mL) a 4 ° C durante a noite.
    4. Lavar as células 3 vezes em PBS durante 10 min à temperatura ambiente.
    5. Incubar as células com anticorpos anti-coelho anti-coelho (4 μg / mL) e / ou Alexa555 anti-rato (4 μg / mL) de burro Alexa 555 à temperatura ambiente durante 1 h.
    6. Lavar as células 3 vezes em PBS durante 10 min à temperatura ambiente.
    7. Monte as células imunocoradas com meio de montagem contendo DAPI (ver tabela de materiais). Examine a expressão de perilipina e S-miosina utilizando um microscópio fluorescente (laser de excitação: 543 nm, excitação de 540/45 nm e emissão de 600/50 nm) e tome imagens sob um objetivo 40X (0,60 NA).

Resultados

Os parâmetros FACS, incluindo a intensidade do laser e a compensação do canal, são corrigidos com base nos resultados de controles sem cor e controles de cor única. O controlo PDGFRβ-PE-FMO é utilizado para definir o gating para a população de PDGFRβ-PE + ( Figura 1A ). Entre as células PDGFRβ-PE, duas populações que representam as células Nestin-GFP + e Nestin-GFP estão claramente separadas ( Figura...

Discussão

Os pericitos são células perivasculares multipotentes 22 , 23 localizadas na superfície abluminal dos capilares 21 , 26 . Nos músculos esqueléticos, os pericitos são capazes de diferenciar ao longo das vias adipogénicas e / ou miogénicas 19 , 20 , 24 . Estudos recentes revelaram duas subpopulações de p...

Divulgações

Todos os autores não têm conflito de interesse para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi parcialmente apoiado por um Fundo-A-Fellow subvenção da Myotonic Dystrophy Foundation (MDF-FF-2014-0013) eo Cientista Development Grant da American Heart Association (16SDG29320001).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell SorterSonySH800
Automatic Setup BeadsSonyLE-B3001
DMEMGibco11995
Avertin SigmaT48402
Pericyte Growth MediumScienCell1201
MSC Basal Medium (Mouse)Stemcell Technologies5501
Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse)Stemcell Technologies5503
Fetal Bovine SerumGibco16000
Horse SerumSigmaH1270
Collagenase Type 2WorthingtonLS004176
0.25% Trypsin/EDTA Gibco25200
Penicillin/StreptomycinGibco15140
PDLSigmaP6407
PDGFRβ-PE AntibodyeBioscience12-1402
Perilipin AntibodySigmaP1998
S-Myosin AntibodyDSHBMF-20
Alexa 555-anti-rabbit antibody ThermoFisher ScientificA-31572
Alexa 555-anti-mouse antibodyThermoFisher ScientificA-31570
Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200
DAPIThermoFisher ScientificD1306
HEPESGibco15630
EDTAFisherBP120
BSASigmaA2058
NH4ClFisher ScientificA661
KHCO3Fisher ScientificP184
PBSGibco14190
18G NeedlesBD305196
10ml Serological PipetteBD357551

Referências

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