CRISPR/Cas9-vermittelten gezielte Integration In Vivo mit einer Homologie-vermittelte Ende verbinden-basierte Strategie

Zusammenfassung

Die gruppierten regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen/CRISPR verbundenen Protein 9 (CRISPR/Cas9) System bietet ein viel versprechendes Instrument für Gentechnik und eröffnet die Möglichkeit, gezielte Integration der transgene. Wir beschreiben eine Homologie-vermittelte Ende verbinden (HMEJ)-basierte Strategie für effiziente DNA Integration in Vivo gezielte und gezielte Gentherapien verwenden CRISPR/Cas9.

Zusammenfassung

Als eine viel versprechende Genom-editing-Plattform hat das CRISPR/Cas9 System großes Potential für effiziente Genmanipulation, vor allem für die gezielte Integration von transgenen. Aufgrund der geringen Effizienz der homologen Rekombination (HR) und verschiedenen Indel Mutationen von nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ)-basierte Strategien in nicht-teilenden Zellen, in Vivo Genom Bearbeitung bleibt eine große Herausforderung. Hier beschreiben wir eine Homologie-vermittelte Ende verbinden (HMEJ)-basiertes CRISPR/Cas9 System zur effizienten in Vivo präzise gezielte Integration. In diesem System, das gezielte Genom und der Spender Vektor mit Homologie Arme (~ 800 bp) flankiert von einzelnen Guide RNA (SgRNA) Ziel Sequenzen sind durch CRISPR/Cas9 gespalten. Diese HMEJ-basierte Strategie erzielt effiziente Transgen Integration in Maus Zygoten sowie in Hepatozyten in Vivo. Darüber hinaus eine HMEJ-basierte Strategie bietet einen effizienten Ansatz zur Korrektur von Fumarylacetoacetate Hydrolase (Fah) Mutation in den Hepatozyten und rettet Fah-Mangel induziert Leberversagen Mäuse. Zusammen genommen, mit Schwerpunkt auf Integration ausgerichtet, diese HMEJ-basierte Strategie bietet ein viel versprechendes Instrument für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich der Erzeugung von gentechnisch veränderten Tiermodelle und gezielte Gentherapien.

Einleitung

Präzise, gezielte Genom-Bearbeitung ist oft für die Herstellung gentechnisch veränderter Tiermodellen und klinischen Therapien erforderlich. Viel Anstrengungen unternommen worden, um verschiedene Strategien für effiziente zielgerichtete Genom bearbeiten, wie z. B. Zink Nuklease (ZFN), Transkription Aktivator-ähnliche Effektor Nukleasen (TALENs) und CRISPR/Cas9 Systeme. Diese Strategien gezielte DNA-Doppel-Strangbrüchen (DSB) im Genom zu erstellen und profitieren Sie von inneren DNA-Reparatursysteme, wie homologe Rekombination (HR)^1,2, Microhomology-vermittelte Ende verbinden (MMEJ)^{3 , 4 , 5}und nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ)^6,7,8 , gezielte Integration der transgene^1,9zu induzieren. Die HR-Strategie ist derzeit die am häufigsten verwendeten Genom Bearbeitung Ansatz, der in Zell-Linien sehr effizient, aber nicht teilenden Zellen aufgrund seines beschränkten Auftretens in der Spätphase der S/G2 nicht ohne weiteres zugänglich ist. Der HR-Strategie gilt somit nicht für in Vivo Genom-Bearbeitung. Vor kurzem wurde die Grundstrategie des NHEJ für effiziente gen-Knock-in Maus Gewebe⁸entwickelt. Dennoch stellt die NHEJ-basierte Methode in der Regel Indels an den Verbindungsstellen, macht es schwierig, präzise Genom-Bearbeitung, vor allem wenn Sie versuchen, im Rahmen Fusion Gene⁸konstruieren zu generieren. MMEJ-basierte gezielte Integration ist in der Lage, präzise Genom-Bearbeitung. Es erhöht jedoch nur in bescheidenem Maße die gezielte Integration Effizienz in vorherigen Berichten⁵. Verbesserung der Effizienz der präzise gezielte Integration in Vivo ist daher für breite therapeutische Anwendungen³dringend erforderlich.

In einer kürzlich veröffentlichten Arbeit zeigten wir eine Homologie-vermittelte Ende verbinden (HMEJ)-basierte Strategie, die die höchste Effizienz der gezielte Integration in alle gemeldeten Strategien sowohl in Vitro und in Vivo¹⁰zeigte. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Einrichtung des HMEJ Systems, und auch der Bau der Einzel-Guide RNA (SgRNA) Vektoren gezielt das gen des Interesses und des Spenders Vektoren beherbergen SgRNA Ziel-Sites und ~ 800 bp Homologie Wappen (Abbildung 1) . In diesem Protokoll erläutern wir im folgenden die einzelnen Schritte zur Erzeugung von DNA-Knock-in Mäusen und kurze Schritte für die gezielte Integration in Geweben in Vivo. Darüber hinaus zeigte eine Proof-of-Concept-Studie über die HMEJ-basierte Strategie seine Fähigkeit, Fah Mutation zu korrigieren und Fah^{- / -} Leber Versagen Mäuse, die weiter seine therapeutische Potenzial offenbart zu retten.

Protokoll

Alle Verfahren einschließlich tierische Themen wurden von der biomedizinischen Forschung-Ethik-Kommission der Shanghai Institute für biologische Wissenschaften (CAS) genehmigt.

1. Aufbau des Spenders Plasmide

1. Auswahl des sgRNA
   1. Verwenden Sie Online-CRISPR-Design-Tools SgRNAs am Ziel Region^{11,12,13,14,15}vorherzusagen. Design für die Cdx2 Locus, sechs verschiedene SgRNAs (Cdx2-sgRNA1 ~Cdx2-sgRNA6) um die Haltestelle Codon mit höheren Rang und niedrigeren Potential aus-Ziele (Abb. 1A)¹⁶.
   2. Linearisieren Sie 2 µg Cas9-CMV-EGFP Expressionsvektoren und SgRNA durch BbsI Verdauung (1 µL der BbsI für 2 h bei 37 ° C auf eine Endkonzentration von 1 U/µL in einem Volumen von 20 µL). Dann reinigen Sie das Produkt durch Gel-Reinigung-Kit mit einem 1 % Agarose-Gel in 1 x TAE-Puffer.
   3. Die Oligo-Lösung mit einem Temperaturgradienten von 95 ° C bis 25 ° C mit einer Änderungsrate der Temperatur von 5 ° C/5 min (95 ° C für 5 min inkubieren Sie Mix ein paar SgRNA Oligonukleotide in 10 µL 1 × T4 DNA-Ligase Puffer, eine Endkonzentration von 50 µM. dann 90 ° C für 5 min, 85 ° C für 5 min, etc..), die wird die Oligos Tempern.
   4. Mix 4 µL Produkt, 2 µL der linearisierten Vektor mit 1 µL T4 DNA-Ligase in 10 µL 1 × T4 DNA-Ligase Puffer, geglüht und dann bei 22 ° C für 1-2 h (Abbildung 1B) verbinden.
2. Landvermesser Nuklease-Test von sgRNA
   Hinweis: Die targeting Effizienz der SgRNA für die Knock-in-Experiment verwendet wird ausgewertet, indem Surveyor Nuclease Assay (auch bekannt als T7 Endonuklease ich (T7EI) assay)¹⁷. Wählen Sie die SgRNA mit hoher DNA Spaltung Effizienz und einen geringen Abstand zwischen Ortsbild SgRNA schneiden und das Stopp-Codon.
   1. Cas9-SgRNA-EGFP Expressionsvektoren in N2a Zelllinien transfizieren kultiviert in DMEM mit 10 % fötalen Rinderserum ergänzt, 1 % PSG und 1 % nicht-essentielle Aminosäure durch die Transfektion kit (siehe Tabelle der Materialien). Inkubieren Sie die transfizierten Zellen bei 37 ° C in 5 % CO₂.
   2. Nach 48 h Inkubation, sammeln Sie 5.000 transfizierte Zellen (GFP⁺) durch Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) Verwendung nicht transfizierten Zellen als ein Steuerelement.
   3. Die gesammelten Zellen in 2 bis 5 µL Oflysis-Puffer (0,1 % Triton x-100, 0,1 % Tween 20 und 100 µg/mL Proteinase K) bei 56 ° C für 30 min zu verdauen, und dann Hitze inaktivieren Proteinase K bei 95 ° C für 10 Minuten.
   4. Die Probe von verschachtelten PCR (Tabelle 1) mit der Hersteller-Protokoll zu verstärken. Die Größe der PCR-Produkte wird auf 300-500 bp festgelegt.
      1. Mix 1 µL Lyse Produkt mit DNA-Polymerase und ein paar von äußeren Primern erkennen die Sequenz auf dem SgRNA-Ziel-Gelände (0,1 µM, Endkonzentration) (Tabelle 1), und führen Sie die primäre PCR in einem Volumen von 20 µL.
      2. DNA-Polymerase bei 95 ° C für 5 min zu aktivieren, und führen Sie die primäre PCR für 30 Zyklen bei 95 ° C für 30 s, 60 ° C für 30 s und 72 ° C für 24 s (1 min/1 kb), mit der letzten Erweiterung bei 72 ° C für 5 Minuten.
      3. Führen Sie die sekundäre PCR mit 1 µL des primären PCR-Produkt und ein paar verschachtelte innere Primer.
   5. Denaturieren und Tempern wieder 300-600 ng des gereinigten PCR-Produkt in 20 µL 1 × T7EI Reaktion Puffer (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT pH 7,9) mit einem Gefälle von Temperatur von 95 ° C bis 25 ° C mit einer Rate von 5 ° C/5 min.
   6. Die geglühten PCR-Produkte und Digest bei 37 ° C für 2 h 1 µL T7EI Enzym hinzufügen. Führen Sie dann die Verdauung Produkt auf 2 % Agarose-Gel in 1 × TAE Puffer bei 120 V 40 min, bis die Fragmente getrennt sind (siehe Tabelle der Materialien).
   7. Verwenden Sie ImageJ um die Band-Intensitäten von Schnitt und ungeschnitten DNA zu bestimmen. Berechnen Sie die Indel Frequenz mit den Methoden wie zuvor⁹ (Abbildung 1C) berichtet.
3. Bau des Spenders Vektor
   Hinweis: Um HMEJ Spender Vektoren für Cdx2 gen zu erzeugen, konstruieren einen Spender DNA (800 bp HAL-p2A-mCherry-800 bp HAR) flankiert mit 23 nt Cdx2-SgRNAs targeting-Sequenz an beiden Enden (Abbildung 1D und Abbildung 1E). Die PAM Zielsequenz grenzte an das Ende der homologen Arm. Gibson Montage empfiehlt sich für HMEJ Spender Klonen.
   1. Verstärken Sie die 800 bp linken Homologie Arm (HAL) mit forward Primer-1F (mit 15-20 nt Überlappung Sequenz von Vector, 23 nt Cdx2-SgRNA-targeting-Sequenz und etwa 20 nt-Sequenz von HAL) und reverse Primer-1R (mit 15-20 bp Überlappung Sequenz von p2A-mCherry und etwa 20 nt-Sequenz von HAL) bei 0,1 µM Endkonzentration mit Maus genomischer DNA bei 200 ng/µL (Abbildung 1D, Tabelle 1).
   2. Verstärken die p2A-mCherry Einfügung Fragment mit forward Primer-2F (mit 15-20 nt Überlappung Sequenz von HAL und etwa 20 nt-Sequenz aus Einfügung Fragment) und reverse Primer-2R (mit 15-20 nt Überlappung Sequenz von HAR und etwa 20 nt-Sequenz aus Das Fragment einfügen) bei 0,1 µM Endkonzentration mit genomische DNA oder Plasmid mit Reporter Sequenzen bei 100 ng/µL oder 30 ng/µL (Abbildung 1D, Tabelle 1).
   3. Verstärken der 800 bp richtige Homologie Arm (HAR) mit forward Primer-3F (mit 15-20 nt Überlappung Sequenz von Vector, 23 nt Cdx2-SgRNA-targeting-Sequenz und etwa 20 nt-Sequenz von HAR) und reverse Primer-3R (mit 15-20 nt Überlappung Sequenz von p2A-mCherry und etwa 20 nt-Sequenz von HAR) bei 0,1 µM Endkonzentration mit Maus genomischer DNA bei 200 ng/µL (Abbildung 1D, Tabelle 1).
   4. Laufen Sie die PCR-Produkte auf 1 % Agarosegel auf 1 x TAE-Puffer, und reinigen Sie die PCR-Produkte der erwarteten Größe Gel Extraction Kit, gemäß den Anweisungen des Herstellers (Tabelle 1).
   5. 50-100 ng eines Vektors Konstrukt mit KpnI und XbaI zu verdauen. Mix 2 µL der linearisierten Vektor auf 30-40 ng/µL mit drei PCR verstärkt Fragmente (1 µL für jedes, 100-200 ng/µL) 2 x Gibson Mischung. Fügen Sie H₂O um die letzte Lautstärke auf 10 µL.Incubate die Mischung bei 50 ° C für 60 min hinzu.
   6. Verwandeln Sie kompetente E. Coli Zellen mit dem montierten Produkt und Extrakt das Plasmid DNA Extraktion Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers baut. Überprüfen des HMEJ Spenders durch DNA-Sequenzierung.

(2) Genom-Bearbeitung in Mausembryonen mithilfe der HMEJ-basierte Methode

1. Produktion von Cas9 mRNA
   1. Vorbereitung der Cas9 mRNA fügen Sie T7 Promotorsequenz, der Cas9 Region durch PCR-Amplifikation mit der entsprechenden Primerpaar in Tabelle 1aufgeführten Codierung hinzu. Fügen Sie den Primer Cas9 F/R auf eine Endkonzentration von 0,1 µM und 20 ng des Cas9 mit dem Ausdruck Vektor 1 × High Fidelity DNA-Polymerase Mischung. Die letzte Lautstärke zu 50 µL mit H₂O.
   2. DNA-Polymerase bei 95 ° C für 5 min zu aktivieren, und führen Sie die PCR für 36 Zyklen bei 95 ° C für 30 s, 60 ° C für 30 s und 68 ° C für 4 min (1 min/1 kb), mit der letzten Erweiterung bei 68 ° C für 10 Minuten.
   3. T7-Cas9 PCR-Produkt für in-vitro- Transkription (IVT) zu reinigen, und dann transkribieren 0,5-1 µg DNA mRNA-Transkription-Kit bei 37 ° C für 8 h in einem Gesamtvolumen von 20 µL, gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien).
   4. Die Mischung der DNA Schablone bei 37 ° C für 15 min. Add ein Poly-A-Endstück für 45 min bei 37 ° C zu entfernen und Wiederherstellen der Cas9 mRNA durch RNA-Reinigung-Kit, gemäß den Anweisungen des Herstellers 1 µL DNase hinzufügen (siehe Tabelle der Materialien).
2. Herstellung von sgRNA
   1. Angetrieben von einem T7 Promotor mit High-Fidelity-DNA-Polymerase als oben SgRNA-Vorlage generieren. Wählen Sie ein SgRNA Gerüst mit Vektor als Vorlage. Die Primer verwendet, sind in Tabelle 1aufgeführt.
   2. Reinigen der T7-SgRNA PCR-Produkt und verwenden Sie 0,5-1 µg DNA als Vorlage für in-vitro- Transkription von SgRNA mit einem kurzen RNA Transkription-Kit bei 37 ° C für 6 Stunden in einem Gesamtvolumen von 20 µL, gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien < / c11 >).
   3. 1 µL DNase zur Mischung hinzugeben und weiter die Inkubation bei 37 ° C für 15 min, die DNA-Vorlage zu entfernen. Reinigen Sie die SgRNAs durch RNA-Reinigung-Kit, wie oben (siehe Tabelle der Materialien).
   4. Die SgRNA um 500 ng/µL RNase-freies Wasser zu verdünnen und die Proben bei −80 ° C bis zu 3 Monate lang zu speichern.
      Hinweis: CRISPR Ribonucleoproteins (RNPs) sind eine alternative Substitution mit besser schneiden Effizienz^18,19,20.
3. Embryo-Sammlung, Mikroinjektion und in-vitro- Kultur
   1. Superovulate weibliche B6D2F1 (C57BL/6 × DBA2J) Mäusen (ca. 7-8 Wochen alt) von trächtige Stute Serum Gonadotropin (PMSG), gefolgt von humanes Choriongonadotropin (hCG) 48 h später. Nach der hCG-Injektion Übernachtung Haus Frauen mit B6D2F1 Männchen.
   2. Die Weibchen durch CO₂ Narkose, 24 Stunden nach der hCG-Injektion zu opfern. Sammeln Sie die befruchteten Embryonen aus ihrer Eileiter (mit 30-50 Embryonen für jedes Weibchen) in M2 Medium.
   3. Ort der befruchteten Embryonen (ca. 300 Eiern für Tages-Injektion) in KSOM Medium (5,55 g/L NaCl, 0,19 g/L KCl, 0,05 g/L KH₂PO₄, 0,05 g/L MgSO₄•7H₂O, 0,04 g/L Glukose, 1,12 g/L Natrium Laktat, 2,1 g/L Nahco3₃ , 0,02 g/L Natrium Pyruvat, 0,25 g/L CaCl₂•2H₂O 0,004 g/L EDTA, 0,146 g/L L-Glutamin und 1 g/L Rinderserumalbumin) bei 37 ° C in einem Inkubator mit 5 % CO₂.
   4. Mix Cas9 mRNA (100 ng/µL), SgRNA (50 ng/µL), HMEJ Spender Vektor (100 ng/µL) und H₂O die letzte Lautstärke auf 10 µL. setzen Sie die Mischung auf dem Eis hinzufügen.
   5. Kapillare Nadeln (Außendurchmesser 1,0 mm, Innendurchmesser 0,78 mm mit Filament) ziehen mit einer Mikropipette Abzieher (Parameter: Wärme, 74, ziehen, 60, Geschwindigkeit, 80; Zeitverzögerung/200, Druck, 300. Siehe Tabelle der Materialien). Kommerzielle Nadeln wäre eine alternative Ersatz für die Mikroinjektion.
   6. Injizieren eine wahrscheinliche Volumen der Mischung in das Zytoplasma der Zygoten mit klar definierten Vorkerne in ein Tröpfchen HEPES-CZB Medium mit 5 µg/mL Cytochalasin B mit Hilfe eines Microinjector mit konstanten flow-Einstellungen (Abb. 2A) (siehe Tabelle der Materialien)²¹.
      Hinweis: Jede Gruppe von Zygoten injiziert werden sollten innerhalb von 20-30 min. Cytochalasin B könnte die Lebensfähigkeit der Maus Zygote nach der Injektion zu erhöhen. Mikroinjektion kann alternativ mit dem Piezo-System betrieben werden, wie zuvor beschrieben,²².
   7. Kultur der injizierten Zygoten in KSOM-Medium bei 37 ° C weniger als 5 % CO₂ bis Blastozyste Bühne nach 3,5 Tagen für Fluoreszenz-Beobachtung (Abbildungen 2 b und 2C).
4. Embryo-Transfer und Generierung von Mäusen
   1. Mate estrous ICR weibliche Mäuse mit vasektomierten ICR männliche Mäuse am selben Tag als Injektion.
   2. Kultur der injizierten Zygoten in das 2-Zell-Stadium bei 37 ° C unter 5 % CO₂und Transfer 25-30 2-Zellen Embryonen in den Eileiter pseudopregnant ICR-Weibchen bei 0,5 Tag Post Coitum (Dpc). Empfängers Mütter liefern Welpen zu 19,5 Dpc.
5. Maus-Genotypisierung
   1. Extrahieren Sie Maus genomischer DNA aus Zehe oder Schweif Proben mit einem DNA-Extraktion-Kit, gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien).
   2. Identifizieren der 5' und 3' Kreuzung von Knock-in Veranstaltungen mit 200-400 ng genomic DNA als Vorlage durch UV/Vis-Spektrometrie gemessen, die PCR Lautverstärkung durchzuführen.
      1. DNA-Polymerase bei 95 ° C für 5 min zu aktivieren, und führen Sie die PCR für 38 Zyklen bei 95 ° C für 30 s, 60 ° C für 30 s und 72 ° C für 1 min (1 min/1 kb), mit der letzten Erweiterung bei 72 ° C für 10 Minuten. Verwenden Sie für die 5' Kreuzung die forward Primer auf den vorgelagerten HAL, mit der Rückseite auf die Knock-in-Fragment (p2A-mCherry). 3' Kreuzung nutzen Sie die vorwärts Grundierung auf die Knock-in-Fragment (p2A-mCherry), mit der Rückseite eines auf die nachgelagerten HAR (Tabelle 1).
   3. 6 µL des PCR Produktes auf 1 % Agarose-Gel auf 1 x TAE-Puffer und prüfen, ob die erwarteten Fragmentgröße ausgeführt. Dann überprüfen sie durch DNA-Sequenzierung (Abbildung 2D).

3. HMEJ-basierte In-Vivo Genom Bearbeitung in Hepatozyten

1. Empfängers C57BL/6J Maus (8 Wochen) in eine Haltevorrichtung legen Sie und das Ende durch den Schlitz.
2. Mischen Sie HMEJ Spender Vektoren (30 µg) und spCas9 Expressionsvektoren (30 µg) in 2 mL Kochsalzlösung. Auszusetzen Sie für das Kontrollexperiment HMEJ Spender Vektoren (30 µg) in 2 mL Kochsalzlösung(Abbildung 3).
3. Reinigen Sie die Maus-Rute mit 70 % Ethanol. Setzen Sie die Nadel in das Heck Vene und injizieren die Plasmid-DNA-Lösung innerhalb von 5-7 s. die Nadel entfernen und lassen Sie die Maustaste aus der Haltevorrichtung.
4. Opfern Sie Mäuse durch CO₂ Narkose nach 5-9 Tage nach der Injektion. Die Mäuse Transcardially mit 0,9 % Kochsalzlösung durchspülen, gefolgt von 4 % Paraformaldehyd mittels einer peristaltischen Pumpe und beheben die Leber über Nacht bei 4 ° C.
5. Das Gewebe mit 30 % Saccharose über Nacht, bis es auf den Boden des Rohres sinkt zu entwässern.
6. Abschnitt des gefrorenen Gewebes bei einer Dicke von 10 µm für Leber Proben.
7. Spülen Sie die Abschnitte dreimal in 0,1 M Phosphat gepuffert (PB) und inkubieren sie mit primären Antikörper: Kaninchen-Anti-mCherry (in 5 % verdünnt NGS) über Nacht bei 4 ° C.
8. Waschen Sie Abschnitte dreimal in PB und inkubieren sie dann mit Sekundärantikörper: Cy3-AffiniPure Ziege IgG Anti-Kaninchen für 2 h bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler.
9. Gegenfärbung die Abschnitte mit DAPI für 20 min und Mount mit Glycerin auf Objektträgern für weitere Fluoreszenz Beobachtungen (Abbildung 3B).

Ergebnisse

HMEJ-basierte Genom-Bearbeitung in Mausembryonen: Um die Effizienz Knock-in der HMEJ-basierte Methode Maus Zygoten definieren, lieferten wir Cas9 mRNA, SgRNA gezielt das Gen Cdx2 und der HMEJ Spender in Maus Zygoten, die entworfen wurde, um ein Reportergen p2A-mCherry zu den letzten Codon Cdx2 Sicherung gen (Abbildung 2A). Die injizierten Zygoten entwickelte sich zu Blastozysten in der Kultur. Um die Knock-i...

Diskussion

Die wichtigsten Schritte beim Bau von HMEJ Spender Plasmide sind: (1) Wahl des SgRNA mit hoher DNA Spaltung Effizienz und geringe Abstand zwischen SgRNA schneiden Website und Stopp-Codon und (2) die ordnungsgemäße Errichtung der HMEJ Spender. CRISPR/Cas9-vermittelte Spaltung auf beide Transgen-Spender-Vektor (mit SgRNA-Ziel-Sites und ~ 800 bp Homologie Arme) und gezielte Genom ist notwendig für eine effiziente und präzise gezielte Integration in-vivo. Die wichtigsten Schritte der Generation von Knock-in Mäu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
pX330	Addgene	42230
pAAV vector	Addgene	37083
pX260	Addgene	42229
AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40	Addgene	97307	AAV vector for encoding a human codon-optimized SpCas9 driven by EFs promoter
AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA	Addgene	97308	HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Actb. EGFP driven by EF1a promoter and U6-driven sgRNAs targeting Actb. AAV backbone.
AAV_Cdx2 HMEJ donor	Addgene	97319	HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Cdx2.
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Life Technology	L3000015
Nuclease-Free Water	Life Technologies	AM9930
Bbs I	New England Biolabs	R0539S
NEB Buffer 2	New England Biolabs	B7002S
T7 endonuclease I	New England Biolabs	M0302L
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England Biolabs	E2621L
Plasmid EndoFree-Midi Kit	Qiagen	12143
MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA	Life Technologies	AM1345
MEGACLEAR KIT 20 RXNS	Life Technologies	AM1908
MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS	Life Technologies	AM1354
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-97	Micropipette Puller (parameters: heat, 74; pull, 60; velocity, 80; time/delay, 200; pressure, 300)
Borosilicate glass	Sutter Instrument	B100-78-10	type of capillaries (outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.78 mm with filament)
FemtoJet microinjector	Eppendorf
Freezing microtome	Leica	CM1950-Cryostat	thickness of 40 μm for brain, 10 μm for liver
Rabbit anti-mCherry	GeneTex
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG	Jackson Immunoresearch
DMEM	Gibco	11965092
FBS	Gibco	10099141
NEAA	Gibco	11140050
Pen,Strep,Glutamine	Gibco	10378016
Gel Extraction Kit	Omega	D2500-02
FACS	BD AriaII
PMSG	Ningbo Sansheng Medicine	S141004
HCG	Ningbo Sansheng Medicine	B141002
Cytochalasin B	Sigma	CAT#C6762
KSOM+AA with D-Glucose and Phenol Red	Millipore	CAT#MR-106-D
M2 Medium with Phenol Red	Millipore	CAT#MR-015-D
Mineral oil	Sigma