CRISPR/Cas9-중재 대상된 통합에서 Vivo에서 Homology 중재 끝에 합류 기반 전략을 사용 하 여

요약

클러스터는 정기적으로 짧은 구조 반복/CRISPR 관련 된 단백질 9 (CRISPR/Cas9) interspaced 시스템 유전 공학에 대 한 유망한 도구를 제공 하 고 transgenes 대상된 통합의 가능성을 엽니다. (HMEJ)에 가입 하는 homology 중재 끝 설명-효율적인 DNA 비보에 통합 대상 및 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 유전자 치료를 대상으로 전략을 기반으로.

초록

유망한 게놈 편집 플랫폼으로 서 CRISPR/Cas9 시스템 특히 transgenes 대상된 통합에 대 한 효율적인 유전자 조작에 대 한 큰 잠재력이 있다. 그러나, 동종 재결합 (HR)의 낮은 효율과 비 동종 끝 결합 (NHEJ)의 다양 한 indel 돌연변이 때문-기반 전략 비 분할 셀, vivo에서 게놈 남아 편집에 큰 도전. 여기, 우리가 설명 (HMEJ)에 가입 하는 homology 중재 끝-정확한 타겟 통합 효율적인 vivo에서 CRISPR/Cas9 시스템을 기반으로. 이 시스템에는 기증자와 타겟된 게놈 벡터 포함 하 상 동 팔 (~ 800 bp) 단일 가이드 RNA (sgRNA) 대상 시퀀스는 CRISPR/Cas9에 의해 죽 습에 의해 형벌. 이 HMEJ 기반 전략 마우스 zygotes, 뿐만 아니라 vivo에서hepatocytes에 효율적인 transgene 통합을 달성 한다. 또한, HMEJ 기반 전략은 hepatocytes에서 fumarylacetoacetate 가수분해 효소 (파) 돌연변이의 수정에 대 한 효율적인 접근 방식을 제공 하 고 파를 구출-결핍 유발 간부 쥐. 함께, 통합 대상에 초점을 맞추고,이 HMEJ 기반 전략 유전자 변형된 동물 모델 및 타겟된 유전자 치료의 세대를 포함 하는 응용 프로그램의 다양 한 유망 도구를 제공 합니다.

서문

정확 하 고 타겟 게놈 편집 하는 것은 종종 생산 하는 유전자 변형 동물 모델과 임상 치료 필요 합니다. 효율적인 타겟된 게놈 아연 손가락 nuclease (ZFN), 같은 녹음 방송 활성 제 같은 이펙터 nucleases (TALENs), 편집에 대 한 다양 한 전략을 개발 하기 위해 많은 노력 했다 및 CRISPR/Cas9 시스템. 이러한 전략 타겟된 DNA 두 배 물가 틈 (DSB) 게놈에서 만들고 동종 재결합 (HR)^1,2, microhomology-중재 끝 결합 (MMEJ)³ 등 본질적인 DNA 복구 시스템 ^{, 4 , 5}, 그리고 비 동종 끝 결합 (NHEJ)^6,,78 transgenes^1,9의 타겟된 통합을 유도 하 라. 시간 기반 전략은 현재 가장 일반적으로 사용 되는 셀 라인에 매우 효율적 이지만 비 분할 셀 후반 S/g 2 단계에서 제한 된 그것의 발생 때문에 쉽게 액세스할 수 없는 접근을 편집 하는 게놈. 따라서, 시간 기반 전략 vivo에서 게놈 편집에 대 한 적용 되지 않습니다. 최근, NHEJ 기반 전략에 대 한 효율적인 유전자 노크 마우스 조직⁸에서 개발 되었다. 그럼에도 불구 하 고, NHEJ 기반 방법 일반적으로 접합, 어렵게 정확한 게놈 편집, 프레임에 융합 유전자⁸를 구성 하려고 할 때 특히 생성에서 indels를 소개 합니다. MMEJ 기반 대상된 통합은 정확한 게놈 편집 가능 합니다. 그러나, 그것은 단지 겸손 하 게 이전 보고서⁵대상된 통합 효율성 증가. 따라서 vivo에서 정확한 타겟된 통합의 효율성 개선 시급히 필요 광범위 한 치료 응용 프로그램³합니다.

최근에 출판 된 작품에서 우리 시연 (HMEJ)에 가입 하는 homology 중재 끝-모든 보고 전략 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서¹⁰최고의 타겟된 통합 효율을 보여준 전략을 기반으로. 여기, 우리는 HMEJ 시스템의 설립을 위한 프로토콜을 설명 하 고 또한 관심과 기증자의 유전자를 대상으로 단일 가이드 RNA (sgRNA) 벡터의 벡터 은닉 sgRNA 대상 사이트와 ~ 800 bp 상 동 팔 (그림 1)의 . 이 프로토콜에서 우리 또한 vivo에서조직 대상된 통합에 대 한 DNA 노크에서 마우스와 간단한 단계의 세대에 대 한 자세한 내용은 설명합니다. 또한, HMEJ 기반 전략의 개념 증명 연구 Fah 돌연변이 수정 하 고 구조 파^-/- 간 실패 마우스, 더 치료 잠재력을 공개 하는 기능을 설명 했다.

프로토콜

동물 주제를 포함 한 모든 절차 생물 과학 (CAS) 상하이 연구소에서 생물 의학 연구 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다가지고.

1입니다. 기증자 플라스 미드의 디자인

1. SgRNA의 선택
   1. 온라인 CRISPR 디자인 도구를 사용 하 여 대상 지역^{11,12,13,,1415}에 sgRNAs를 예측. Cdx2 로커 스에 대 한 6 개의 서로 다른 sgRNAs 디자인 (Cdx2-sgRNA1 ~Cdx2-sgRNA6) 주위에 정지 codon 높은 순위 및 더 낮은 잠재력으로 오프-대상 (그림 1A)¹⁶.
   2. BbsI 소화 (1 µ L BbsI의 20 µ L의 볼륨에서 1 U / µ L의 최종 농도에서 37 ° C에서 2 시간에 대 한)에 의해 Cas9-CMV-EGFP 식 벡터와 sgRNA의 2 µ g를 선형화. 다음 1 × 태 버퍼에 1 %agarose 젤 젤 정화 키트에 의해 제품을 정화.
   3. 믹스 한 쌍 sgRNA oligonucleotides 50 µ M. 최종 농도를 1 × T4 DNA 리가 버퍼의 10 µ L에서의 온도 변화 속도 5 ° C/5 분 (5 분 동안 95 ° C 95 ° C에서 25 ° C의 온도 기울기를 사용 하 여 올리고 솔루션을 품 어 5 분, 5 분, 등등을 위한 85 ° C에 대 한 다음 90 ° C.),이 oligos anneal 것입니다.
   4. 혼합 4 µ L의 제품, 1 × T4 DNA 리가 버퍼의 10 µ L에 T4 DNA 리가의 1 µ L로 선형화 벡터의 2 µ L을 단련 하 고 1-2 h (그림 1B) 22 ° C에서 선.
2. SgRNA의 측량 nuclease 분석 결과
   참고: 노크에서 실험을 위해 사용 하는 sgRNA의 대상 효율 측량 nuclease 분석 결과 평가 (일컬어 T7 endonuclease 나 (T7EI) 분석 결과)¹⁷. 높은 DNA 분열 효율과 sgRNA 절단 사이트와 정지 codon 사이의 낮은 거리는 sgRNA를 선택 합니다.
   1. Cas9-sgRNA-EGFP 식 벡터 N2a 셀 라인에 transfect DMEM 보충 10% 태아 둔감 한 혈 청에서에서 교양, 1 %PSG, 그리고 1% 비 필수 아미노산은 transfection에 의해 키트 ( 재료의 표참조). 5% CO₂에서 37 ° C에서 transfected 세포를 품 어.
   2. 외피의 48 h 후 수집 5000 transfected 셀 (GFP⁺) 형광 활성화 (FACS) 정렬 제어로 비 페 셀을 사용 하 여.
   3. 2-5 µ L oflysis 버퍼 (0.1% 트라이 톤 X-100, 0.1% 트윈 20, 및 100 µ g/mL 가수분해 K) 30 분 동안 56 ° C에서 수집 된 세포를 소화 하 고 십 분 동안 95 ° C에 K 성분을 비활성화.
   4. 중첩 된 PCR (표 1) 제조업체의 프로토콜을 사용 하 여 샘플을 증폭. PCR 제품의 크기는 300-500 bp로 설정 됩니다.
      1. DNA 중 합 효소와 sgRNA 대상 사이트 (0.1 µ M, 최종 농도) 시퀀스를 인식 하는 외부 뇌관의 쌍 세포 제품의 믹스 1 µ L (표 1), 20 µ L의 볼륨에서 기본 PCR을 수행 하 고.
      2. 5 분 동안 95 ° C에서 DNA 중 합 효소를 활성화 하 고 30 95 ° C에서 30 사이클에 대 한 기본 PCR을 수행 s, 60 ° C 30에 대 한 s, 그리고 24 72 ° C s (1 분/1 킬로바이트), 5 분 동안 72 ° C에서 최종 확장.
      3. 1 µ L 기본 PCR 제품의 중첩 된 내부 뇌관의 쌍을 사용 하 여 2 차 PCR을 수행 합니다.
   5. 변성 고 다시 1 × T7EI 반응 버퍼 (50 m m NaCl, 10 mM Tris HCl, 10 m m MgCl₂, 1mm DTT pH 7.9)의 20 µ L에서 순화 된 PCR 제품의 300-600 기 anneal 속도/5 분의 5 ° C 95 ° C에서 25 ° C의 온도의 그라디언트를 사용 하 여.
   6. 단련 된 PCR 제품 및 다이제스트 2 h 37 ° C에서 T7EI 효소의 1 µ L를 추가 합니다. 파편 ( 재료의 표참조) 분리 될 때까지 다음 1 × 태 buffer 120 V 40 분 2 %agarose 젤에 소화 제품을 실행 합니다.
   7. ImageJ를 사용 하 여 잘라내기 및 포경된 DNA의 밴드 농도 결정. 메서드를 사용 하 여 이전 indel 빈도 보고⁹ (그림 1C)를 계산 합니다.
3. 기증자 벡터의 건설
   참고: Cdx2 유전자에 대 한 HMEJ 기증자 벡터를 생성 하려면 구성 DNA 기증자 (800 bp HAL-p2A-mCherry-800 bp 하겠다) 23 형벌 nt Cdx2 sgRNAs 타겟팅 (D 그림 1및 그림 1E) 양쪽에서 시퀀스. 대상 시퀀스의 PAM 동종 팔의 끝에 인접 했다. 깁슨 어셈블리 HMEJ 기증자 복제에 대 한 것이 좋습니다.
   1. 앞으로 뇌관-1 층으로 800 bp 왼쪽된 상 동 팔 (HAL)을 증폭 (벡터, 23에서에서 15-20 nt 중첩 시퀀스가 포함 된 nt Cdx2 sgRNA 대상 시퀀스, 그리고 HAL에서 약 20 nt 시퀀스) 및 뇌관-1 라운드 (15-20 bp 겹침 순서에서 포함 된 역 p2A mCherry와 HAL에서 약 20 nt 시퀀스) 0.1 µ M 최종 농도 200 ng / µ L (D그림 1, 표 1)에서 마우스 게놈 DNA를 사용 하 여에서.
   2. 앞으로 뇌관-2 층 (HAL에서 15-20 nt 겹침 순서와 삽입 부분에서 약 20 nt 시퀀스를 포함 하는)와 p2A mCherry 삽입 단편 증폭 하 고 뇌관-2R (포함 된 무기에서 15-20 nt 중첩 시퀀스에서 약 20 nt 순서 반전 삽입 부분)에서 0.1 µ M 최종 농도가 100 ng / µ L 또는 30 ng / µ L (D그림 1, 표 1)에서 기자 시퀀스 게놈 DNA 또는 플라스 미드를 사용 하 여.
   3. 앞으로 뇌관-3 층으로 800 bp 오른쪽 상 동 팔 (무기)를 증폭 (벡터, 23에서에서 15-20 nt 중첩 시퀀스가 포함 된 nt Cdx2 sgRNA 대상 시퀀스, 그리고 무기에서 약 20 nt 시퀀스) 반전 뇌관-3R (15-20에서 nt 중복 시퀀스를 포함 하 고 p2A mCherry 및 무기에서 약 20 nt 시퀀스) 0.1 µ M 최종 농도 200 ng / µ L (D그림 1, 표 1)에서 마우스 게놈 DNA를 사용 하 여에서.
   4. 1 × 태 버퍼에 1 %agarose 젤에 PCR 제품을 실행 하 고 제조업체의 지침 (표 1)에 따라 젤 추출 키트에 의해 예상 되는 크기의 PCR 제품을 정화.
   5. KpnI 및 XbaI 구조 벡터의 50-100 ng을 소화. 믹스 2 µ L 3 PCR와 30-40 ng / µ L에서 선형화 벡터의 깁슨 믹스 x 2에서 조각 (각, 100-200 ng / µ L에 대 한 1 µ L)를 증폭. H₂O 10 µL.Incubate 60 분 50 ° C에서 믹스를 최종 볼륨 조절 추가.
   6. 유능한 대장균 을 변형 모든 조립된 제품 및 플라스 미드 DNA 추출 키트 제조업체의 지침에 따라 하 여 구성 하는 추출 셀. DNA 시퀀싱에 의해 HMEJ 기증자를 확인 합니다.

2. 게놈 HMEJ 기반 메서드를 사용 하 여 마우스 배아에서 편집

1. Cas9 mRNA의 생산
   1. Cas9 mRNA 준비, T7 발기인 순서는 Cas9 표 1에 나열 된 적절 한 뇌관 쌍을 사용 하 여 PCR 증폭에 의해 지역 코딩을 추가 합니다. 0.1 µ M의 최종 농도 20에서 뇌관 Cas9 F/R 추가 1 × 고 충실도 DNA 중 합 효소 혼합에 벡터를 표현 하는 Cas9의 ng. H₂o. 50 µ L 최종 볼륨을 조정
   2. 5 분 동안 95 ° C에서 DNA 중 합 효소를 활성화 하 고 30 95 ° C에서 36 사이클에 대 한 PCR을 수행 s, 60 ° C 30에 대 한 s, 그리고 4 분 (1 분/1 킬로바이트), 10 분 동안 68 ° C에서 최종 확장명이 68 ° C.
   3. 생체 외에서 전송 (IVT), T7 Cas9 PCR 제품을 정화 하 고 다음 녹음 0.5-1 µ g의 DNA mRNA 전사 키트 제조업체의 지침에 따라 20 µ L의 전체 볼륨에 8 h 37 ° C에 의해 ( 재료의 표참조).
   4. 15 분 추가 폴 리 A 꼬리 37 ° C에서 45 분 동안 37 ° C에서 DNA 템플렛을 제거 하 고 제조업체의 지침에 따라 RNA 정화 키트, 여 Cas9 mRNA를 복구 하는 혼합물에 DNase의 1 µ L를 추가 ( 재료의 표참조).
2. SgRNA의 생산
   1. 고 충실도 DNA 중 합 효소로 위에 T7 발기인에 의해 구동 sgRNA 서식 파일을 생성 합니다. 템플릿으로 벡터를 포함 하는 sgRNA 비 계를 선택 합니다. 사용 하는 뇌관은 표 1에 나열 됩니다.
   2. T7 sgRNA PCR 제품을 정화 하 고 0.5-1을 사용 하 여 µ g sgRNA 짧은 RNA 전사 키트를 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 20 µ L의 전체 볼륨에 6 h를 37 ° C에서의 녹음 방송 생체 외에서 에 대 한 템플릿으로 DNA ( 테이블의 자료를 참조 하십시오 < / c11 >).
   3. 1 µ L DNase의 혼합물에 추가 하 고 DNA 템플렛을 제거 하려면 15 분 동안 37 ° C에는 부 화를 계속. sgRNAs RNA 정화 키트에 의해 정화 ( 재료의 표참조) 이상으로.
   4. RNase 무료 물에 500 ng / µ L을 sgRNA를 희석 하 고 최대 3 개월까지 −80 ° C에서 샘플을 저장 합니다.
      참고: CRISPR ribonucleoproteins (RNPs)는 더 나은 절단 효율성^18,,1920대체 대체 됩니다.
3. 배아 컬렉션, microinjection 및 생체 외에서 문화
   1. 여성 B6D2F1 (C57BL/6 × DBA2J) 쥐 (7-8 주 이전) 임신 암 말 혈 청 생식 샘 자극 호르몬 (PMSG)에 의해 뒤에 인간의 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG) 48 h 후 superovulate HCG 주사 후 집 여성 B6D2F1 남성과 하룻밤.
   2. CO₂ 마 취, hCG 주사 후 24 h에 의해 여성을 희생. M2 매체에서 (30-50 배아 각 여성에 대 한)와 그들의 oviducts에서 수정 된 배아를 수집 합니다.
   3. 장소 KSOM 중간에 수정 된 배아 (약 300 달걀 1 일 주입에 대 한) (5.55 g/L NaCl, KCl, 0.05 g/L KH₂포₄, 0.05 g/L MgSO₄•7H₂O, 0.04 g/L 포도 당, 1.12 g/L 나트륨 0.19 g/L 젖이 나올, 2.1 g/L NaHCO₃ , 0.02 g/L 나트륨 pyruvate, 0.25 g/L CaCl₂•2H₂O, 0.004 g/L EDTA, 0.146 g/L L-글루타민, 및 1 g/L 소 혈 청 알 부 민) 5% CO₂배양 기에서 37 ° C에서.
   4. 혼합 Cas9 mRNA (100 ng / µ L), sgRNA (50 ng / µ L), 그리고 HMEJ 기증자 벡터 (100 ng / µ L), H₂O 10 µ L. 최종 볼륨을 조정 하는 얼음에 혼합물을 넣어 추가.
   5. 모 세관 바늘 (외부 직경 1.0 m m, 내경 필 라 멘 트와 0.78 m m)를 당겨 Micropipette 끌어당기는 사람을 사용 하 여 (매개 변수: 열, 74, 풀, 60, 속도, 80, 200 시간/지연, 압력, 300. 재료의 표참조). 상업적인 바늘은 microinjection에 대 한 대체 대체 될 것 이다.
   6. HEPES CZB 매체 포함 하는 5 µ g/mL cytochalasin 상수는 microinjector를 사용 하 여 B의 물방울에 잘 정의 된 pronuclei와 혼합물의 가능성이 볼륨 zygotes의 세포질으로 주입 흐름 설정 (그림 2A) (참조 재료의 표)²¹.
      참고: 각 그룹 zygotes의 주입 한다 20-30 분 내 Cytochalasin B는 주사 후 마우스 zygote의 생존 능력을 증대 시킬 수. 또는, microinjection²²위에서 설명한 대로 피에 조 시스템으로 동작할 수 있습니다.
   7. 37 ° C 미만 5% CO₂ 는 blastocyst까지 형광 관찰 (그림 2B , 2C)에 대 한 일 후 무대에서 KSOM 중간에 삽입 된 zygotes 문화.
4. 배아 전송 및 쥐의 생성
   1. 주입으로 같은 날에 vasectomized ICR 남성 마우스 estrous ICR 여성 쥐를 친구.
   2. 5% CO₂, 그리고 0.5 하루 게시물 coitum (dpc)에서 pseudopregnant ICR 여성의 oviducts로 전송 25-30 2 셀 배아에서 37 ° C에서 2 셀 단계에 주입된 zygotes 문화. 받는 사람 어머니 19.5 dpc에서 새끼를 제공합니다.
5. 마우스 유전형
   1. 제조업체의 지침에 따라 DNA 추출 키트를 사용 하 여 발가락 또는 꼬리 샘플에서 마우스 게놈 DNA를 추출 ( 재료의 표참조).
   2. 5'과 3' 접합 PCR amplification를 수행 하기 위해 템플릿으로 UV/vis 분 광 분석에 의해 측정 하는 genomic DNA의 200-400 ng를 사용 하 여 노크에서 이벤트를 식별 합니다.
      1. 5 분 동안 95 ° C에서 DNA 중 합 효소를 활성화 하 고 30 95 ° C에서 38 사이클에 대 한 PCR을 수행 s, 60 ° C 30에 대 한 s, 그리고 10 분 동안 72 ° C에서 최종 확장으로 1 분 (1 분/1 킬로바이트), 72 ° C. 5' 접합, 노크-조각 (p2A-mCherry)에 반대 한 HAL의 업스트림에서 앞으로 뇌관을 사용 합니다. 3' 접합로 노크-조각 (p2A-mCherry)에 앞으로 뇌관을 사용 하 여 무기 (표 1)의 하류에 반대 하나.
   3. 1 × 태 버퍼 및 예상된 조각 크기에 대 한 확인에 1 %agarose 젤에 PCR 제품의 6 µ L를 실행 합니다. 다음 DNA 시퀀싱 (그림 2D)으로 그들을 확인 합니다.

3. HMEJ-기반 Vivo에서 게놈 Hepatocytes에서 편집

1. 금지 장치에 받는 사람 C57BL/6J 마우스 (8 주)를 배치 하 고 슬릿을 통해 꼬리를 넣어.
2. HMEJ 기증자 벡터 (30 µ g)과 spCas9 식 벡터 (30 µ g) 염의 2 개 mL에 혼합. 제어 실험에 대 한 염 (그림 3A)의 2 ml HMEJ 기증자 벡터 (30 µ g)을 일시 중단 합니다.
3. 70% 에탄올과 마우스 꼬리를 청소. 삽입 꼬리에 바늘 정 맥 및 플라스 미드 DNA 솔루션 5-7 미에서 주사 바늘을 제거 하 고 억제 장치에서 마우스를 놓습니다.
4. 주입 후 5-9 일 후 CO₂ 마 취에 의해 쥐를 희생. 0.9% 식 염 수와 쥐 transcardially perfuse, 4 %paraformaldehyde 연동 펌프를 사용 하 여 및 4 ° c.에 하룻밤 간 수정
5. 하룻밤, 튜브의 바닥에 싱크 될 때까지 30% 자당을 사용 하 여 조직을 탈수.
6. 섹션 간 샘플 10 µ m의 두께에 냉동된 조직.
7. 0.1 M 인산 버퍼 (PB)에 세 번 섹션 린스와 1 차 항 체로 그들을 품 어: 안티-mCherry 토끼 (5%에 희석 NGS) 4 ° c.에서 하룻밤
8. 세 번에 PB, 섹션을 세척 하 고 다음 2 차 항 체로 그들을 품 어: Cy3-AffiniPure 염소-토끼 IgG 궤도 셰이 커에 실 온에서 2 h에 대 한.
9. 20 분 동안 DAPI와 섹션 및 형광 관찰 (그림 3B)에 대 한 유리 슬라이드에 글 리세 린과 산 counterstain.

결과

HMEJ 기반 게놈 마우스 배아에서 편집: 마우스 zygotes에서 노크에 HMEJ 기반 방법의 효율성을 정의 우리 Cas9 mRNA, Cdx2 의 마지막 codon에 p2A mCherry 취재 원 유전자를 융합 설계 되었습니다 sgRNA 마우스 zygotes에 HMEJ 기증자와 Cdx2 유전자를 대상으로 전달 유전자 (그림 2A). 주입 된 zygotes blastocysts 문화에로 발전. 노크에 효?...

토론

HMEJ 기증자 플라스 미드의 건축에서 가장 중요 한 단계는: (1) 높은 DNA 분열 효율과 낮은 거리 sgRNA 절단 사이트와 정지 codon, 및 (2) 적절 한 건설 HMEJ 기증자의 간의 sgRNA의 선택. CRISPR/Cas9-중재 분열 (sgRNA 대상 사이트와 ~ 800 bp 상 동 팔 포함) 모두 transgene 기증자 벡터에 타겟된 게놈은 효율적이 고 정확한 타겟된 통합에 필요한 vivo에서. HMEJ 기반 방법을 사용 하 여 노크에서 쥐의 세대의 가장 중?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
pX330	Addgene	42230
pAAV vector	Addgene	37083
pX260	Addgene	42229
AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40	Addgene	97307	AAV vector for encoding a human codon-optimized SpCas9 driven by EFs promoter
AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA	Addgene	97308	HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Actb. EGFP driven by EF1a promoter and U6-driven sgRNAs targeting Actb. AAV backbone.
AAV_Cdx2 HMEJ donor	Addgene	97319	HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Cdx2.
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Life Technology	L3000015
Nuclease-Free Water	Life Technologies	AM9930
Bbs I	New England Biolabs	R0539S
NEB Buffer 2	New England Biolabs	B7002S
T7 endonuclease I	New England Biolabs	M0302L
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England Biolabs	E2621L
Plasmid EndoFree-Midi Kit	Qiagen	12143
MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA	Life Technologies	AM1345
MEGACLEAR KIT 20 RXNS	Life Technologies	AM1908
MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS	Life Technologies	AM1354
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-97	Micropipette Puller (parameters: heat, 74; pull, 60; velocity, 80; time/delay, 200; pressure, 300)
Borosilicate glass	Sutter Instrument	B100-78-10	type of capillaries (outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.78 mm with filament)
FemtoJet microinjector	Eppendorf
Freezing microtome	Leica	CM1950-Cryostat	thickness of 40 μm for brain, 10 μm for liver
Rabbit anti-mCherry	GeneTex
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG	Jackson Immunoresearch
DMEM	Gibco	11965092
FBS	Gibco	10099141
NEAA	Gibco	11140050
Pen,Strep,Glutamine	Gibco	10378016
Gel Extraction Kit	Omega	D2500-02
FACS	BD AriaII
PMSG	Ningbo Sansheng Medicine	S141004
HCG	Ningbo Sansheng Medicine	B141002
Cytochalasin B	Sigma	CAT#C6762
KSOM+AA with D-Glucose and Phenol Red	Millipore	CAT#MR-106-D
M2 Medium with Phenol Red	Millipore	CAT#MR-015-D
Mineral oil	Sigma