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Method Article
* Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen
Diese Methode beschreibt die Platzierung der Zwischenschaltung Vene Transplantationen bei Kaninchen, die Transduktion der Grafts und die Erreichung des dauerhaften Transgene Ausdruck. Dies ermöglicht die Untersuchung der physiologischen und pathologischen Rollen von transgenen und deren Proteinprodukte in veredelten Adern und Prüfung der Gentherapien für Venenleiden Transplantat.
Ader-Transplantat-Bypass-Chirurgie ist eine gemeinsame Behandlung für arterielle Verschlusskrankheit; langfristiger Erfolg wird jedoch durch Transplantat Versagen aufgrund von Arteriosklerose, Thrombose und Intima-Hyperplasie begrenzt. Das Ziel dieses Artikels ist zu zeigen, ein Verfahren zur bilateralen venösen Zwischenschaltung Transplantate in ein Kaninchen zu platzieren, dann transducing die Transplantate mit einem Gen-Transfer-Vektor, der dauerhafte Transgene Ausdruck erreicht. Die Methode ermöglicht die Untersuchung der biologischen Rollen von Genen und deren Proteinprodukte in normalen Vene Transplantat Homöostase. Es erlaubt auch das Testen von transgenen für Aktivitäten, die Vene Transplantat Versagen, z.B.verhindern könnte., ob der Ausdruck ein Transgen verhindert das Wachstum von Neointimal, reduziert die vaskuläre Entzündung oder reduziert Atherosklerose bei Kaninchen gefüttert mit einer fettreichen Diät. Während einer Operation zunächst überleben sind die Segmente des rechten und linken äußeren Halsschlagader herausgeschnitten und bilateral als umgekehrte Ende-zu-Seite Gemeinsame Halsschlagader Zwischenschaltung Transplantate platziert. Während einer zweiten überleben operiert, 28 Tage später jeder der Grafts ist isoliert aus dem Kreislauf mit vaskulären Clips und die Lumen (über eine arteriotomie) mit einer Lösung, die Helfer-abhängige adenoviralen Vektor (ADHD) gefüllt sind. Nach einer 20-min Inkubation die Vektor-Lösung wird abgesaugt, die arteriotomie repariert und Strömung wird wiederhergestellt. Geerntet werden die Venen zu Zeitpunkten einzelne experimentelle Protokolle diktiert. Die 28-Tage Verzögerung zwischen der Transplantat-Platzierung und die Transduktion ist notwendig, um die Anpassung des Transplantats Vene, die arterielle Durchblutung zu gewährleisten. Diese Anpassung verhindert schnellen Verlust der Transgen-Ausdruck, der in Vene Transplantationen ausgestrahlt vor oder unmittelbar nach der Transplantation auftritt. Die Methode ist einzigartig in seiner Fähigkeit, dauerhafte, stabile Transgene Ausdruck in veredelten Adern zu erreichen. Im Vergleich zu anderen großen Tieren Vene Transplantat Modelle, haben Kaninchen Vorteile von niedrigen Kosten und einfache Handhabung. Im Vergleich zu Nagetier Vene Transplantat Modelle, haben Kaninchen größer und leichter zu manipulieren Blutgefäße, die reichlich Gewebe zur Analyse zur Verfügung zu stellen.
Arteriosklerose ist eine chronische entzündliche Erkrankung, die in der Lipid-Akkumulation und Entzündungen in der Gefäßwand zur Verengung des Schiffes Lumen, Herzinfarkt, Schlaganfall und Verlust von Gliedmaßen1,2 führen. Perkutane Eingriffe (zB., Angioplastie und Stentimplantation) und medikamentöse Therapie (zB., Statine und thrombozytenaggregations-Agenten) gibt nützliche Behandlungen für Arteriosklerose; Sie sind jedoch oft unwirksam bei der Behandlung von schweren obstruktiven Erkrankungen in der koronaren und peripheren Zirkulation. Bypass-Operation, mit autogenen Venen Segmenten, bleibt ein gemeinsames Verfahren für die Behandlung von Patienten mit schweren, diffuse koronare und periphere arterielle Verschlusskrankheit3,4. Jedoch Vene Transplantate in beide die Herzkranzgefäße gelegt und peripheren Auflagen haben schlechte Durchgängigkeit Langzeittarife. In der Herz-Kreislauf sind etwa 10-20 % der Vene, die Transplantate mit 1 Jahr und 50 % verdeckt sind durch 10 Jahre5,6verdeckt. In die periphere Durchblutung sind Vene Transplantat Ausfallraten 30-50 % bei 5 Jahren7.
Gentherapie ist ein attraktiver Ansatz zur Prävention von Vene Transplantat scheitern, weil es eine therapeutische Genprodukt genau an die Stelle der Krankheit liefern kann. Dementsprechend haben zahlreiche präklinische Studien Vene Transplantat Gen Therapie8,9getestet. Aber haben im Wesentlichen alle diese Studien geprüft, die Wirksamkeit bei frühen Zeit Punkte (2-12 Wochen)10,11,12,13,14,15, 16 , 17. wir kennen keinen Beweis, daß Gentherapie Interventionen dauerhaft zur Verfügung stellen können (Jahre) Schutz gegen Ende Vene Transplantat einrichten, die in der Regel aus Neointimal Hyperplasie und Atherosklerose4resultiert. Wir entwickelten eine Methode, die erlaubt langlebige Transgene Ausdruck in veredelten Venen und damit erlaubt das Testen der Gentherapie Interventionen zu spät sowie frühen Zeitpunkten. Um dauerhafte Transgene Ausdruck zu erreichen, beinhaltet die Methode ADHD Vektoren und eine verzögerte Transduktion Strategie. ADHD Vektoren bieten verlängerte Transgene Ausdruck, weil sie virale Gene ermangeln, verhindern die Anerkennung und Ablehnung von ausgestrahlt Zellen durch das Immunsystem18,19,20, 21. verzögerte Transduktion (durchgeführten 28 Tage nach der Transplantation Platzierung) verhindert den Verlust von Zellen ausgestrahlt während des Arterialization-Prozesses, der früh nach dem Pfropfen22auftritt.
Andere Methoden, die therapeutische Transgene Ausdruck in der Vene Transplantat Wand zu erreichen setzen auf die Transduktion des Transplantats Vene zum Zeitpunkt der Transplantation Platzierung10,11,12,15,16 ,17. Wenn seriell gemessen, lehnt Transgene Ausdruck mit diesem Ansatz schnell nach der Transduktion22,23. Dementsprechend haben Studien mit diesem Ansatz nicht die Wirksamkeit jenseits von 12 Wochen nach der Vene Aufpfropfen, mit der Beurteilung nicht Wirksamkeit über 4 Wochen untersucht. Im Gegensatz dazu unsere Methode erreicht Vene Transplantat Transgene Ausdruck, der weiterhin stabil für mindestens 24 Wochen und basierend auf ähnliche Studien Arterien-wahrscheinlich weiterhin viel länger22,24. Wir kennen keine andere Vene Transplantat Gen Therapie Intervention, die stabile Transgene Ausdruck dieser Dauer erreicht.
Ein Kaninchen-Modell verwendet, um unsere Methode zu entwickeln. Andere haben Nagetiere, Kaninchen, verwendet oder größere Tiere Ader testen Transplantat Gen Therapie10,11,12,15,16,17,25, 26. Im Vergleich zu Nager-Modelle, Kaninchen sind teurer und unterliegen strengeren regulatorischen Anforderungen. Jedoch im Vergleich zu größeren Tieren (z. B.., Schweine und Hunde), Kaninchen sind weit weniger teuer zu kaufen und zu Haus und viel einfacher zu handhaben. Darüber hinaus Kaninchen Schiffe ähneln menschlichen Schiffe physiologisch27, sie sind groß genug, dass sie können perkutane Eingriffe28,29zu Testzwecken verwendet werden, und sie ausreichend Gewebe, die bieten mehrere Endpunkte (zB., Histologie, Protein, RNA) können mit einem einzigen Blutgefäß Probe22,30geprüft werden. Darüber hinaus, wenn die Kaninchen mit Vene Transplantationen mit einer fettreichen Diät gefüttert werden, entwickeln sie Vene Transplantat Atherosklerose31,32, ist eine häufige Ursache für koronare Bypass Vene Transplantat Ausfall4,5 . Diese arteriosklerotischen Kaninchen Vene Transplantate dient als Substrat für die Gentherapie Interventionen geliefert mit dieser Methode zu testen. Das angegebene Protokoll kann helfen, Ermittler, die nötige Fachkompetenz, langlebige Transgene Ausdruck in Kaninchen Vene Transplantationen zu erreichen zu meistern.
Alle tierischen Protokolle und Studien wurden von der University of Washington Büro Tierschutz genehmigt.
(1) vor der Operation (für alle Operationen)
(2) Vene Graft Chirurgie (Überleben)
3. Transkutane Ultraschall
(4) Gentransfer operiert ~ 28 Tage nach der Transplantation Platzierung (Überleben Chirurgie)
5. Ernte Chirurgie (Terminal)
Die technische Leistungsfähigkeit eines neuen Betreibers muss überprüft werden, bevor der Betreiber diese Methode verwenden kann, um experimentelle Daten zu generieren. Der erste Meilenstein, den ein neuer Betreiber zu erreichen, müssen ist konsequente Vene Transplantat Durchgängigkeit nach der ersten Vene Pfropfung Operation und die anschließende verzögert Transduktion Chirurgie. Über 90 % Durchgängigkeit nach jeder der Operationen wünschenswert und realisierbar ist. Die Durchg...
Wichtige Schritte in diesem Protokoll gehören die Verwaltung der Anästhesie, Antikoagulation, chirurgische Manipulation der Vene Arterie/veredelt und hämodynamische Messungen der veredelten Ader. Ordnungsgemäße Verwaltung der Anästhesie ist von entscheidender Bedeutung in diesem mehrere überleben Chirurgie Modell mit zwei relativ langen Operationen (in der Regel 3-3,5 h für bilaterale Vene Pfropfen und 1,5-2,5 h für bilaterale Transplantat Transduktion). Wir haben Anästhesie über eine Nosecone und durch endotr...
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Disposables | |||
3mL syringe with 24G needle | Becton Dickinson | 309571 | 2x for vein graft surgery; 2x for gene transfer surgery |
1 mL syringe with 27G needle | Becton Dickinson | 309623 | 2x for vein graft surgery, 5x for gene transfer surgery |
19G needle | Becton Dickinson | 305187 | Gene transfer surgery |
20 mL syringe, luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
Catheters, 24Ga x 3/4” | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
21G needle | Becton Dickinson | 305165 | Gene transfer surgery and for 20 mL syringe of saline |
Gauze 4” x 4” | Dynarex | 3242 | ~10-15 per surgery |
3-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-244 | |
5-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-182 | |
7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8703P | Vein graft surgery |
7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8648P | Gene transfer surgery |
5-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 421A | |
3-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 398A | |
Alcohol swabs | Covidien Ltd. | 6818 | For the placement of I.V. line |
Catheter plug | Vetoquinol | 411498 | |
Ketamine HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | 5098916106 | |
Xylazine, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
Lidocaine, 20 mg/mL | Pfizer | 409427702 | |
Marcaine 0.5% | Pfizer | 409161050 | |
Beuthanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | Harvest surgery only |
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | |
Saline IV bag, 0.9% sodium chloride | Baxter | 2B1309 | |
Heparin (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | |
Papaverine (3.5 mg/ml) | American Reagent Inc. | NDC 0517-4002-25 | Diluted from 30mg/mL stock; Use 1 mL maximum |
Fentanyl patch, 25 mcg/h | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | |
Isoflurane | Multiple vendors | Catalog number not available | |
Viral vector | Gene transfer surgery only | ||
Surgical Instruments | |||
Metzenbaum needle holder 7" straight | Roboz | RS-7900 | |
Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt | Roboz | RS-6828 | |
Needle holder /w suture scissors | Miltex | 8-14-IMC | |
Castroviejo scissors | Roboz | RS-5658 | |
Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock | Roboz | RS-6412 | |
Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt | Roboz | RS-5943 | |
Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs | Roboz | RS-6514 | 2x |
Backhaus towel clamp 3.5" | Roboz | 4x | |
Micro clip setting forceps 4.75" | Roboz | RS-6496 | |
Micro vascular clips, 11 mm | Roboz | ||
Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm length |
Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width | Roboz | RS-5210 | |
Dumont #3 forceps Inox tip size .17 × .10 mm | Roboz | RS-5042 | |
Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8 mm tip | Roboz | RS-5280 | |
Halstead mosquito forceps, 5" straight, 1.3 mm tips | Roboz | RS-7110 | 2x |
Halstead mosquito forceps, 5" curved, 1.3mm tips | Roboz | RS-7111 | |
Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips | Roboz | RS-7117 | |
Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips | Roboz | RS-7305 | |
Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width | Roboz | RS-8162 | |
Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip width | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
Adson forceps, 12 cm, serrated, straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
Veterinary electrosurgery handpiece and electrode | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
Surgical Suite Equipment | |||
Circulating warm water blanket and pump | Multiple vendors | Catalog number not available | |
Bair hugger warming unit | 3M | Model 505 | |
IV infusion pump | Heska | Vet IV 2.2 | |
Isoflurane vaporizer and scavenger | Multiple vendors | Catalog number not available | |
Veterinary multi-parameter monitor | Surgivet | Surgivet Advisor | |
Veterinary electrosurgery unit | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
Surgical microscope | D.F. Vasconcellos | M900 | 25X magnification for vein graft surgery; 16X magnification for gene transfer surgery |
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