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Resumo

Este método descreve a colocação de enxertos de veia interposição em coelhos, a transdução de enxertos e a realização da expressão do transgene durável. Isso permite que a investigação de papéis fisiológicos e patológicos de transgenes e seus produtos de proteína nas veias transplantadas e teste de terapias do gene para a doença do enxerto de veia.

Resumo

Cirurgia de bypass enxerto de veia é um tratamento comum para a doença arterial obstrutiva; no entanto, sucesso a longo prazo é limitado pela insuficiência de enxerto devido a trombose, hiperplasia da íntima e aterosclerose. O objetivo deste artigo é demonstrar um método para a colocação de enxertos de interposição venosa bilateral em um coelho e, em seguida, transducing os enxertos com um vetor de transferência do gene que atinge a expressão do transgene durável. O método permite a investigação das funções biológicas de genes e seus produtos de proteína na homeostase de enxerto de veia normal. Ele também permite que o teste de transgenes para as atividades que possam impedir a falha de enxerto de veia, por exemplo., se a expressão de um transgene impede o crescimento de neointimal, reduz a inflamação vascular ou reduz aterosclerose em coelhos alimentados com uma dieta de alto teor de gordura. Durante uma cirurgia de sobrevivência inicial, os segmentos de veia jugular externa direita e esquerda são extirpados e colocados bilateralmente como invertida enxertos de interposição da artéria carótida comum fim-a-lado. Durante uma segunda cirurgia de sobrevivência, realizada de 28 dias mais tarde, cada um dos enxertos é isolado da circulação com clips vasculares e os lúmens são preenchidos (através de uma arteriotomia) com uma solução contendo um vetor auxiliar-dependente de (HDAd) adenovírus. Após uma incubação de 20 min, a solução do vetor é aspirada, a arteriotomia é reparada e fluxo é restaurado. As veias são colhidas nos pontos de tempo ditados pelos protocolos experimentais individuais. O atraso de 28 dias entre a colocação do enxerto e a transdução é necessário para garantir a adaptação do enxerto de veia para a circulação arterial. Esta adaptação evita a rápida perda de expressão do transgene que ocorre em enxertos de veia transformados antes ou imediatamente após a enxertia. O método é único em sua capacidade de atingir a expressão do transgene durável, estável nas veias transplantadas. Comparado a outros modelos de enxerto de veia de animais grandes, coelhos têm vantagens de baixo custo e fácil manuseio. Em relação aos modelos de enxerto de veia de roedores, coelhos têm a maiores e mais fácil-para-manipular os vasos sanguíneos que fornecem abundante tecido para análise.

Introdução

A aterosclerose é uma doença inflamatória crônica, em que o acúmulo de lipídios e inflamação na parede do vaso sanguíneo levam a estreitamento do lúmen do vaso, ataques cardíacos, derrames e perda de membros1,2. Intervenções percutâneas (EG., angioplastia e implante de stent) e terapia médica (ex., agentes de estatinas e antiplaquetária) são tratamentos úteis para aterosclerose; no entanto, muitas vezes são ineficazes no tratamento da grave doença obstrutiva na circulação coronária e periférica. Enxerto de bypass, usando segmentos de veia autógena, continua a ser um procedimento comum para tratamento de pacientes com severa, difusa doença vascular periférica e coronariana,3,4. No entanto, veia enxertos colocados em ambas as coronárias e circulação periférica tem pobre perviedade a longo prazo. Na circulação coronária, aproximadamente 10-20% da veia enxertos são ocluídos em 1 ano e 50% são ocluídas por 10 anos5,6. Na circulação periférica, taxas de falha de enxerto de veia são 30-50% em 5 anos7.

Terapia gênica é uma abordagem atraente para a prevenção de falha de enxerto de veia porque ele pode entregar um produto de gene terapêutico precisamente no local da doença. Por conseguinte, numerosos estudos pré-clínicos testei veia enxerto gene terapia8,9. No entanto, essencialmente todos estes estudos examinaram a eficácia no início tempo pontos (2-12 semanas)10,11,12,13,14,15, 16 , 17. estamos cientes de nenhuma evidência de que as intervenções de terapia genética podem fornecer bens proteção (anos) contra tarde falha de enxerto de veia que normalmente resulta da neointimal hiperplasia e aterosclerose4. Desenvolvemos um método que permite a expressão do transgene durável nas veias transplantadas e desse modo permite o teste de intervenções de terapia genética em pontos de tempo de atraso, bem como início. Para atingir a expressão do transgene durável, o método incorpora HDAd vetores e uma estratégia de transdução retardada. HDAd vetores fornecem expressão do transgene prolongada porque lhes falta genes virais, impedindo o reconhecimento (e rejeição) das células transduzidas por18,o sistema imunológico,19,20, 21. transdução atrasada (realizada de 28 dias após a colocação do enxerto) evita a perda de células transduzidas durante o processo de arterialization que ocorre mais cedo após a enxertia,22.

Outros métodos que alcançar expressão do transgene terapêutico na parede de enxerto de veia dependem da transdução do enxerto de veia no momento do enxerto colocação10,11,12,15,16 ,17. Quando medido em série, expressão do transgene usando esta abordagem declina rapidamente após a transdução22,23. Nesse sentido, estudos utilizando esta abordagem já não analisou a eficácia além de 12 semanas após o enxerto de veia, com mais não avaliar eficácia além de 4 semanas. Em contrapartida, nosso método alcança o enxerto de veia expressão do transgene que persiste estàvel pelo menos 24 semanas e baseados em estudos semelhantes realizados em artérias-provável continua muito mais22,24. Estamos cientes de nenhuma outra veia enxerto gene intervenção terapêutica que atinge a expressão do transgene estável de tanto tempo.

Usamos um modelo de coelho para desenvolver nosso método. Outros autores utilizaram roedores, coelhos, ou animais maiores para testar a veia do enxerto gene terapia10,11,12,15,16,17,25, 26. Em comparação com modelos de roedores, coelhos são mais caros e estão sujeitos a requisitos regulamentares mais rigorosos. No entanto, em comparação com animais maiores (EG., porcos e cães), os coelhos são muito menos caro para comprar e casa e muito mais fácil de manipular. Além disso, os navios coelho se assemelham a vasos humanos fisiologicamente27, eles são suficientemente grandes que eles podem ser usados para testar intervenções percutâneas28,29, e eles fornecem tecido suficiente que vários pontos de extremidade (por exemplo., histologia, proteínas, RNA) podem ser examinados usando um único vaso sanguíneo espécime22,30. Além disso, quando os coelhos com enxertos de veia são alimentados com uma dieta high-fat, eles desenvolvem veia enxerto aterosclerose31,32, que é uma causa comum de artéria coronária desvio veia enxerto falha4,5 . Estes enxertos de veia coelho aterosclerótica podem servir como um substrato para intervenções de terapia genética entregadas com este método de teste. O protocolo fornecido pode ajudar os investigadores a dominar as habilidades técnicas necessárias para atingir a expressão do transgene durável em enxertos de veia de coelho.

Protocolo

Todos os animais protocolos e estudos foram aprovados pela Universidade de Washington escritório de bem-estar Animal.

1. pré-operação (para todas as cirurgias)

  1. Anestesia o coelho com xilazina ketamina e 1,5 mg/kg de 30 mg/kg por injeção intramuscular (IM) na musculatura paraespinhal.
    Nota: Comida e água não são restritos antes da cirurgia.
  2. Enquanto aguarda o suficiente profundidade da anestesia, configure as tabelas na sala de preparação e sala de operações (OR).
    1. Prepare a sala de preparação para barbear o pescoço do coelho e o posicionamento do porto por via intravenosa (IV) na orelha (somente para cirurgia de sobrevivência). Coloque o patch fentanil (cirurgia de sobrevivência), máquina de cortar cabelo, pomada oftálmica, almofada da preparação do álcool, 24-G x ¾" cateter, orifício de injecção e esparadrapo na mesa de preparação.
    2. Na sala de operações, configurar o equipamento de monitorização e associados sondas (eletrocardiograma (EKG), oximetria de pulso (SpO2) e temperatura). Preparar a bomba IV com uma bolsa de soro salina 100ml com uma agulha de 18 G ou 19-G e definir a taxa de fluxo como 10 mL/h/kg (somente para cirurgia de sobrevivência). Configure o equipamento de oxigênio e isoflurano com um cone de nariz (cirurgias de enxertia ou colheita veia).
      1. Para ajudar a fixar o cone do nariz para o coelho, loop uma tira de gaze ao redor do tubo que fornece gás para o cone do nariz. Esse loop deve cercar o tubo que é ligada ao cone do nariz. As extremidades livres da faixa de gaze ambos devem demorar cerca de 45 cm. Coloque o cone do nariz (com gaze anexado) na ponta cabeça da tabela.
    3. Ligar a água circulante e/ou cobertor na tabela OR de aquecimento de ar forçado. A manta de aquecimento, coloque uma toalha enrolada como um suporte de pescoço e coloque a placa do eletrodo dispersivo de eletrocautério.
    4. Como um analgésico local, combinar em uma seringa de 1 mL de lidocaína a 2% HCl e 1 mL de bupivacaína a 0,5% HCl. diluir o vírus para a concentração desejada (aqui, usar 2 x 1011 partículas virais/mL para HDAd) em DMEM estéril e manter no gelo (somente cirurgia de transferência de gene).
    5. Depois de uma adequada profundidade anestésica é alcançada, prepare o coelho para a cirurgia.
      Nota: Teste para a falta de um reflexo de retirada do pedal para garantir a adequada profundidade anestésica. Continue a acompanhar o reflexo pedal durante a cirurgia.
      1. Aplica a pomada oftálmica de olhos de coelho.
      2. Para permitir a colocação de uma sonda de temperatura retal, pressione com os dedos com a luva, logo acima do reto e mover os dedos em direção do ânus para remover um bufo do rabo do coelho.
      3. Raspe o coelho do notch esterno até a borda da mandíbula. Raspe uma orelha para a colocação de IV e orelha oposta para administração de patch fentanil (somente para cirurgia de sobrevivência). Raspe os traseiros meio dedos do pé esquerdos para a colocação da sonda SpO2 .
    6. Para a operação de infusão do vector, entube o coelho. Use um O.D./3 4 mm mm tubo endotraqueal identificou as algemas, roscada sobre um artroscópio. Coloque o coelho em prostração esternal e hiperestender o pescoço. Mantenha a boca do coelho bem aberto e use o artroscópio para visualizar as glote e laringe pregas. Durante a inspiração, insira cuidadosamente o tubo endotraqueal através da laringe e na traqueia.
    7. Para as cirurgias de sobrevivência, coloque e fixe um cateter IV de 24-G na veia do ouvido esquerdo do coelho e tampá-lo com um orifício de injecção. Aplica um patch de 25 µ g/h fentanil a orelha direita do coelho.
      Nota: O protocolo é um cirurgião posicionado do lado direito do coelho. Se o cirurgião estará no lado esquerdo do coelho, inverta os lados nesta etapa para manter os fios e IV em frente do cirurgião. Alterne os lados em futuras etapas conforme necessário.
    8. Para as cirurgias de enxertia e colheita de veia, administrar anestesia geral com um cone de nariz; para a cirurgia de infusão de vetor, administre anestesia geral através de um tubo endotraqueal.
      Nota: A intubação pode ser usada para todas as cirurgias.  Em nossa experiência, no entanto, os riscos de complicações do trauma laríngea e traqueal durante a intubação podem superam os benefícios de intubação.  A cirurgia que inclui a transferência de genes de um enxerto (particularmente em coelhos alimentados com colesterol) é a única cirurgia na qual intubação parece fornecer um benefício líquido.
    9. Levar o coelho para o OR. Coloque o coelho em uma posição supina na mesa de operação com a toalha de apoio de pescoço posicionada logo abaixo a cabeça do coelho. Estenda suavemente o pescoço do coelho até é reta e horizontal aproximadamente.
    10. Coloque o cone do nariz para o coelho (cirurgias de enxertia e colheita veia) ou conecte o tubo endotraqueal (cirurgia de infusão de vetor) com O2 a 1 L/min e inicie o isoflurano. Se usando um cone de nariz, fixá-lo envolvendo as extremidades das tiras gaze anexado ao redor da toalha de apoio de pescoço do coelho. Ajuste a concentração de isoflurano conforme necessário (geralmente 1-2%) para manter um nível cirúrgico de anestesia.
    11. Centro a placa do eletrodo dispersivo eletrocautério em volta do coelho. Introduzir a sonda de temperatura retal e aplique o SpO2 sonda e EKG leva o coelho.
    12. Conecte a linha IV salina à porta cateter na orelha esquerda do coelho e ligue a bomba de infusão IV a 10 mL/h/kg. Depois de 1 h, reduzir a taxa de infusão de solução salina a 5 mL/h/kg.
    13. Amarre frouxamente pernas dianteiras do coelho para a mesa de operações como um dispositivo de retenção.
      Nota: Opcionalmente, uma pequena mesa de plástico pode ser colocada sobre o coelho para evitar o cirurgião do pressionando peito/abdômen do coelho e potencialmente causando aspiração e refluxo gastroesofágico.
    14. Injetar lidocaína/bupivacaína (2ml, mistura 50/50, passo 1.2.4) por via subcutânea (SQ) no pescoço ao longo da linha de incisão prevista, para a anestesia local.
    15. Tenho o assistente desinfectar o cirúrgico site com 3 alternando esfrega de gluconato de clorexidina e isopropanol e, em seguida, pulverizar o local com iodo-povidona. Tenho o esfoliante de cirurgião, vestido e luvas, seguindo princípios assépticos.
      1. Realize cirurgias de sobrevivência sob condições assépticas. Tem o assistente lidar com todos os itens não-estéril e assepticamente passar material esterilizado para o cirurgião ou assepticamente, coloque-os sobre a mesa de instrumento drapeado.
      2. Tenho as cirurgião uso toalhas estéreis assepticamente manipular equipamentos não esterilizados, tais como o microscópio. Com o cirurgião usa 2 x lupas cirúrgicas durante a realização da primeira metade da cirurgia.

2. veia cirurgia de enxerto (sobrevivência)

  1. Prepare os instrumentos e o campo estéril.
    1. Tenho o assistente abrir pacotes estéril (um pano de mesa, uma cortina de papel e 6 toalhas) e em condições assépticas, transferir o conteúdo para o cirurgião.
    2. Cubra a mesa do instrumento. Coloque a cortina de papel e toalhas estéreis sobre a mesa de instrumento drapeado. Com 4 toalhas, cubra o coelho, deixando apenas o sítio cirúrgico no pescoço exposto. Colocar a cortina de papel sobre o coelho. Uma toalha será usada mais tarde, e o último é um backup.
    3. Tenho o assistente abre a mochila de instrumento esterilizado e assepticamente, passar a bandeja de instrumento para o cirurgião. Disponha os instrumentos sobre a mesa do instrumento.
    4. Ter o assistente abrir os seguintes equipamentos e assepticamente passá-lo para o cirurgião ou coloque-a sobre a mesa de instrumento: uma seringa de 1 mL, uma seringa de 3 mL, uma seringa de 20 mL, uma agulha 21G, sutura de (PGA) de ácido poliglicólico 3-0, sutura PGA de 5-0 , sutura de polipropileno de 7-0 e um cateter IV 24.
    5. Prenda o cabo do eletrocautério ao lençol cobrindo o coelho, usando um 7,25" Kantrowitz fórceps. Largue a Conecte a ponta do cabo sobre a borda da mesa de operações para ser ligado à unidade de eletrocirurgia e ativada pelo assistente.
    6. Encha uma seringa de 20 mL com soro fisiológico estéril de um saco de solução salina ou frasco realizada pelo assistente. Use esta solução salina conforme necessário para evitar a desidratação do tecido exposto durante a operação.
    7. Prepare-se 5 mL de solução salina fisiológica heparinizada adicionando 0,1 mL de heparina 5.000 UI/mL a 5 mL de solução salina, i. e., heparina de 100 UI/mL, em uma tigela pequena e cirúrgica. Use esta solução para liberar o enxerto de veia e artéria carótido regularmente durante o procedimento de enxerto.
    8. Faça um furo no papel drapejar sobre o local cirúrgico no pescoço do coelho. Toalha de usar grampos para fixar os cantos do buraco no lugar para as toalhas subjacentes.
  2. Dissecação vascular
    Nota: Use 2 lupas cirúrgicas de x para ajudar com esta parte da cirurgia.
    1. Cortar a pele com eletrocautério ao longo da linha média entre o entalhe esternal e a mandíbula (aproximadamente 7-9 cm de comprimento) e prenda a pele do pescoço do coelho para as toalhas com as pinças de toalha. Na extremidade caudal, fazer um corte lateral curto através da fáscia com eletrocautério. Sem rodeios, disse sob a fáscia ao longo da linha média inteira usando uma tesoura grande. Corte a camada fascial dissecada ao longo da linha mediana com eletrocautério.
    2. Comece no lado direito. Disse entre o músculo sternohyoid sobrejacente a traqueia e o músculo sternocephalic em forma de V, para expor a artéria carótida comum.
    3. Disse cuidadosamente um segmento de 4 a 5 cm da artéria carótida comum e seus ramos maiores (tipicamente 1-2 em cada lado) livres de tecidos circundantes. Estenda a dissecação da base do pescoço, proximalmente ao cruzamento do nervo faríngeo distalmente. Uso do silicone cirúrgico loops para ajudar na retração durante a dissecção da artéria carótida. Ligam os maiores ramos da artéria carótida comum com suturas de seda 5-0 antes de cortar cada ramo distalmente.
      Nota: Tenha cuidado para não perturbar o nervo vago que iguala a artéria carótida comum, ou os nervos menores que cruzam a artéria.
    4. Repita a dissecação do lado esquerdo (passo 2.2.3).
    5. Use fórceps de retenção de tecido para fechar temporariamente a camada de tecido subcutâneo. Disse a fáscia superficial da pele do lado direito até a veia jugular externa é exposta. Dissecar um segmento de 4 a 5 cm da veia jugular externa e livre de seus ramos no tecido circundante, ligando pequenos ramos com suturas de seda 5-0, antes de cortar o galho.
    6. Repita a dissecação do lado esquerdo (passo 2.2.5).
    7. Injetar heparina (150 UI/kg) no cateter IV e lavar com 10 mL de solução salina.
    8. Medir um segmento de 3 cm da veia jugular externa do lado direito e ligate extremidade caudal do segmento com sutura seda 5-0. Permitir a veia encher com sangue e, em seguida, ligar a extremidade cranial do segmento de veia. Dividir a extremidade cranial do segmento de veia jugular externa, Lave cuidadosamente o recipiente com soro heparinizado (100 U/mL) utilizando uma seringa de 3 mL, anexada a um 24-IV-cateter. Divida o segmento de veia em sua extremidade caudal. Lugar no segmento de veia em uma posição padronizada, na qual as extremidades cranianas e caudais são inequivocamente identificáveis.
  3. Enxerto de veia
    1. Deixe o assistente remova as lupas cirúrgicas o cirurgião e o microscópio cirúrgico (25 X) posicionem-se.
      Nota: O cirurgião deve armar uma toalha estéril sobre o microscópio. Isto permite ao cirurgião para manipular o microscópio, mantendo a esterilidade.
    2. Grampeie a artéria carótida comum direita em cada extremidade do segmento isolado com mini grampos, colocando o grampo craniano primeiro para permitir a artéria de enchimento e, em seguida, colocar a braçadeira do caudal.
    3. Corte um pedaço de papel duro (disponível a partir do empacotamento esterilizados para suturas) cm de 1 × 2 e colocá-lo sob a artéria carótida comum, para melhorar a exposição.
    4. Execute uma arteriotomia só cranial para a caudal braçadeira (a arteriotomia caudal). O comprimento da arteriotomia deverá ser igual ao diâmetro da extremidade cranial do segmento de veia. Insira a seringa com o cateter IV através a arteriotomia caudal e irrigue o lúmen da artéria carótida com soro fisiológico heparinizado normal.
    5. Suture extremidade cranial da veia para a arteriotomia caudal, usando sutura de polipropileno de 7-0 com pontos simples (Figura 1).
      1. Coloque o primeiro ponto para suturar a extremidade caudal da arteriotomia caudal à extremidade cranial do segmento de veia. Coloque o segundo ponto de 180° em relação ao primeiro ponto, a sutura craniana final da arteriotomia caudal à extremidade cranial do segmento de veia.
      2. Coloque o terceiro ponto em um ponto equidistante dos dois primeiros pontos, no lado lateral da anastomose. Coloque o quarto ponto no lado medial da anastomose, equidistante dos dois primeiros pontos e em frente o terceiro ponto. Coloque 4 pontos adicionais (pontos 5-8) entre cada um dos pontos 1-4.
      3. Execute a arteriotomia craniana no lado caudal do clipe craniano. A distância entre a extremidade cranial da arteriotomia cranial e caudal final da arteriotomia caudal deve ser o mesmo que o comprimento do segmento de veia. O comprimento da arteriotomia craniana é igual ao diâmetro da extremidade caudal do segmento de veia.
    6. Estenda a veia cranialmente de anastomose, deitado-lo em cima da carótida, sem introduzir qualquer torções. Lave a artéria carótida e da veia com soro fisiológico heparinizado normal através da arteriotomia craniana. A solução salina irá fluir através da artéria, no interior da veia através da anastomose caudal e sairá da extremidade livre e unsutured da veia. Flushing a veia também impede que torcer.
    7. Suture extremidade caudal da veia para a arteriotomia craniana (Figura 1).
      1. Coloque um primeiro ponto para suturar a extremidade caudal da arteriotomia cranial à extremidade caudal do segmento de veia. Coloque um segundo ponto para sutura craniana final da arteriotomia cranial à extremidade caudal do segmento de veia. Conforme descrito na etapa 2.3.5.2, complete a anastomose. Pouco antes do último nó é amarrado na anastomose craniana, brevemente, abra o grampo na extremidade cranial do segmento da artéria carótida comum dissecado, para permitir a volta-sangramento que lava para fora o ar na artéria carótida e veia transplantada. Em seguida, aperte o último nó.
    8. Solte o grampo craniano para permitir o enchimento de enxerto de veia com sangue e em seguida, solte o grampo caudal. Pulsações fresco devem ser vistas no enxerto de veia. Aplique uma pressão suave com uma gaze seca para parar qualquer sangramento nas anastomoses.
    9. Ligar as duas extremidades do segmento de artéria carótida comum que conecta as anastomoses com uma sutura de seda 3-0 e dividir a carótida, a meio caminho entre as ligaduras (Figura 1). Aplica algumas gotas de papaverina (3,5 mg/mL) para a adjacente a cada anastomose da artéria carótida.
    10. Injetar o cateter de orelha IV heparina (75 UI/kg) e lavar com 10 mL de solução salina. Neste momento, injete buprenorfina (SQ, 0,02 mg/kg) para fornecer analgesia pós-operatória até o patch fentanil forneceu os níveis plasmáticos de analgésico de fentanil.
      Nota: Uma injeção adicional de buprenorfina (SQ, 0,02 mg/kg) pode ser necessário 6 h após a primeira injeção para manter analgesia até fentanil plasma atinge uma concentração terapêutica.
    11. Repeti o enxerto do lado esquerdo (etapas 2.2.8, 2.3.2-2.3.9).
    12. Feche o tecido subcutâneo com sutura de PGA 5-0, usando um padrão contínuo. Feche a pele com sutura de PGA 3-0, usando um padrão intradérmico. Enterre os maçaricos em ambas as extremidades.
  4. Cuidados, limpeza e recuperação pós-operatória
    Nota: Permitir que o coelho a recuperar da anestesia em um ambiente calmo e tranquilo. Monitore o coelho continuamente para adequada oxigenação e a temperatura corporal até que ele se recuperou totalmente.
    1. Desligue isoflurano e oxigênio e desconecte a máquina da anestesia do coelho. Desconecte o tubo de fluido IV do coelho, mas deixar o porto de IV na veia da orelha para acesso emergente.
    2. Transportar o coelho a uma gaiola de recuperação e colocá-lo de lado. Fornece apoio térmico com água quente cobertor (ou aquecimento de ar forçado). Dar O2 pelo cone do nariz até SpO2 é estável.
    3. Até o coelho pode sentar e deambular em sua jaula, vire o coelho para seu outro lado cada 15 min. Em seguida, remover a cânula IV de orelha e retornar o coelho para sua gaiola. Retorne o coelho para a companhia de outros animais, só depois que ele está totalmente recuperado da anestesia.
    4. Descarte quaisquer resíduos seguintes protocolos adequados para eliminação de resíduos de risco biológico e farelos.
    5. No pós-operatório, verificar integridade do coelho e ferida cirúrgica cada dia. Administre a buprenorfina como preciso para dor não gerenciado pelo patch fentanil. Remova o patch fentanil no 3º dia pós-operatório.

3. transcutânea ultra-som

  1. Para avaliar a patência do enxerto, realizar exame de ultrassom em não-anestesiados coelho 5-7 dias após a cirurgia de enxerto de veia e cirurgia de transferência de genes.
    1. Enrole o coelho não-anestesiados com segurança em um cobertor e coloque o coelho em decúbito dorsal em uma veterinária V-calha com o pescoço estendido. Rapar o pescoço, ou se necessário, remova os pelos com um agente depilatório. Aplicar o gel de ultra-som no pescoço e realizar um exame de ultra-som.
      Nota: Um exame de ultra-som é também realizado em coelhos anestesiados, no momento da cirurgia de transferência do gene e a cirurgia de colheita de enxerto terminal para examinar a patência do enxerto e para medir o diâmetro do lúmen de enxerto. O exame é feito antes de esfregar o pescoço e é realizado de maneira semelhante como para os coelhos não-anestesiados.

4. Gene transferência cirurgia realizada ~ 28 dias após a colocação do enxerto (cirurgia de sobrevivência)

  1. Prepare os instrumentos e o campo estéril.
    1. Siga os passos 2.1.1-2.1.3. na cirurgia de enxerto de veia.
    2. Deixe o assistente abrir os seguintes equipamentos e também assepticamente passá-lo para o cirurgião, ou coloque-a sobre a mesa do instrumento: 6 seringas de 1 mL (com agulha), uma seringa de 3 mL, uma seringa de 20 mL, uma agulha 21G, uma agulha 19-G, sutura de PGA 3-0 , 5-0 PGA sutura, sutura de polipropileno de 7-0, dois Cateteres IV de 24 G e uma sonda de fluxo de sangue estéril.
    3. Siga os passos 2.1.5-2.1.6. na cirurgia de enxerto de veia.
    4. Preparar uma seringa de 1 mL com 1 mL DMEM para lavar o enxerto de artéria e veia e preparar duas 1-mL-seringas com solução de vírus (~ 0.5-0.7 enxerto de veia/solução de vírus mL). Deixe o assistente descongelar o vírus e diluí-la em DMEM. Prepare uma seringa de 3 mL com 0,5 mL de lidocaína/bupivacaína (mistura de 50/50 de passo 1.2.4).
    5. Siga o passo 2.1.8 em cirurgia de enxerto de veia.
  2. Isolamento de enxertos de veia e artérias carótidas adjacentes
    Nota: 2 x lupas cirúrgicas deve ser usado para esta parte.
    1. Cortar a pele com eletrocautério ao longo da linha média entre o entalhe esternal e a mandíbula (aproximadamente 7-9 cm de comprimento) e apertar a pele aberta com braçadeiras de toalha. Aplica 0,5 mL de lidocaína/bupivacaína (mistura de 50/50 de passo 1.2.4) no tecido subcutâneo.
    2. Na extremidade caudal, fazer um corte lateral curto através da fáscia com eletrocautério. Sem rodeios, disse sob a fáscia ao longo da linha média inteira. Com eletrocautério, corte a fáscia dissecada ao longo da linha mediana.
    3. Comece no lado direito. Disse entre o músculo sternohyoid sobrepondo a traqueia e o músculo sternocephalic em forma de V, para expor o enxerto de veia. Cuidadosamente, isole o enxerto de veia e 1,5-2,0 cm da artéria carótida adjacente ao enxerto em ambos os lados, cranianos e caudais.
    4. Repita a dissecação do lado esquerdo, seguindo passo 4.2.3.
  3. Medir o fluxo de sangue nos enxertos de veia.
    1. Preencha a cavidade da ferida cirúrgica no lado direito com solução salina normal para permitir a transmissão de ondas sonoras. Mergulhe uma sonda de fluxo 2mm perivascular (conectada a um medidor de fluxo-volume) em solução salina na cavidade da ferida e definir a taxa de fluxo para zero.
    2. Coloque a sonda de fluxo ao redor da artéria carótida, caudal ou cranial ao enxerto de veia. Registrar os dados da sonda fluxo com um sistema de aquisição de dados eletrônicos.
    3. Repita a medição de fluxo no lado esquerdo, seguindo passo 4.3.2.
    4. Calcule o pulsatility com base na taxa de fluxo de pressão sistólica de pico, taxa de fluxo diastólico mínima e vazão média. Também Calcule a tensão de cisalhamento laminar, com base na taxa de fluxo e o diâmetro do lúmen (medida com ultra-som transcutâneo).
  4. Infundir solução de vetor nos enxertos de veia
    Nota: Um microscópio cirúrgico (16x) é usado como necessário para a punção, infusão e reparo da artéria carótida.
    1. Tenho o assistente remover lupas cirúrgicas do cirurgião e posicionem-se o microscópio cirúrgico. Com o cirurgião armar uma toalha estéril sobre o microscópio. A toalha estéril permite ao cirurgião para manipular o microscópio, mantendo a esterilidade.
    2. Tem o assistente heparina (150 UI/kg) de injetar no cateter IV e lave com soro fisiológico.
    3. Usar um driver de agulha grande para dobrar a agulha 21G a aproximadamente 80° acima de bisel (Não dobre o bisel; Figura 2A).
    4. Grampeie a artéria carótida comum em cada extremidade do enxerto de veia com mini grampos, colocando o grampo craniano primeiro para permitir a artéria de enchimento e, em seguida, colocar o clipe de caudal. Lugar do clipe caudal caudal para a anastomose, cerca de 10 mm para deixar algum espaço para a arteriotomia.
    5. Colocar duas gravatas de seda em torno da artéria só caudal ao enxerto e amarrar um único nó de laçada em cada - sem apertá-los.
    6. Punção da artéria carótida caudal ao enxerto com a agulha 21 G torta só craniana do caudal clipe vascular. Tenha cuidado para não perfurar as paredes laterais ou traseiras. Avance a agulha dentro do lúmen e trás duas vezes para garantir que o lúmen é claro e, em seguida, Retire cuidadosamente a agulha.
      Notas: A perfuração na carótida comum pode ser auxiliada por segurando adventitia arterial com pinça fina e levantar delicadamente a parede frontal ao introduzir a ponta da agulha só caudal ao ponto de elevador(Figura 2). Isso reduz o risco de bater a parede do fundo com a agulha.
    7. Com vários gaze desdobrado, crie um ninho para colocar a seringa utilizada para infusões. Coloque este ninho de gaze caudal ao local da cirurgia.
    8. Colocar um 24 G IV-cateter na seringa com somente DMEM e aperte o cateter na seringa apenas o suficiente para impedir o escapamento (a seringa será removida mais tarde nesta cirurgia) e dobre o cateter ~ 4 mm da ponta para que a curva detém cerca de 75 ° depois que for lançado.
    9. Insira o cateter IV a arteriotomia carótida comum até o ponto de curva e lavar o lúmen do enxerto de veia duas vezes com 0,5 mL de DMEM. Para cada repetição, encha o enxerto de veia com DMEM. Remova o DMEM do enxerto, pressionando levemente com um dedo protegido por luva na extremidade cranial do enxerto. Cuidadosamente, deslize o dedo em direção a extremidade caudal da prótese para expulsar o conteúdo luminal através a arteriotomia.
    10. Remova a seringa DMEM do cateter, deixando o cateter no vaso. Conecte a seringa contendo a solução de antivírus, certificando-se de que nenhum ar entra o cateter. Mova que a seda frouxamente atada amarra para baixo a artéria até que eles estão ao redor da ponta do cateter, mas não aperte-os.
    11. Infundi 0,03 mL de solução de antivírus para empurrar o restante DMEM fora o cateter. Remova todos os fluidos do lúmen do enxerto de veia com o dedo, pressionando suavemente de cranial para caudal.
    12. Aperte os dois laços em torno da artéria e cateter ponta para selar o lúmen. Administrar a solução de vírus até a veia é distendida. Deite suavemente a seringa no ninho de gaze.
      Nota: É vital que o enxerto de veia expande ao seu calibre de pre- transdução e continua a ser inflado durante a infusão de vírus. Se não, será diminuída significativamente a quantidade de transferência de genes.
    13. Deixe a solução contendo vírus no lúmen do enxerto de veia por 20 min e em seguida, substituir a seringa contendo vírus anexada ao cateter com uma seringa vazia. Aspire suavemente a solução contendo vírus do enxerto até o navio entra em colapso. Remova a seringa, deixando o cateter no lugar. Corte e desamarre as suturas de seda e retirar o cateter da nave. Retire o cateter da artéria carótida com cuidado para não danificar o endotélio.
    14. Com o auxílio do microscópio cirúrgico, feche a arteriotomia com sutura de polipropileno de 7-0 usando um X-padrão (Figura 2B).
      1. Segure a sutura com uma porta-agulha, introduza o navio no canto inferior-direito da arteriotomia e saída do navio no canto inferior esquerdo. Atravessar a abertura do lado de fora do navio e fazer a segunda passagem do topo-direito ao canto superior esquerdo.
      2. Antes de apertar a sutura, brevemente lançamento do clipe vascular craniano para liberar o ar e vírus residual do enxerto de veia e artéria. Sangue fluirá fora a arteriotomia quando o grampo está liberado.
      3. Feche a arteriotomia puxando suavemente a sutura termina e amarrá-los junto com 2 nós de praça.
        Nota: Puxando a sutura apertada causará ajuntamento do tecido que irá perturbar o fluxo, aumentar o risco de trombose e potencialmente introduzir variáveis descontroladas.
    15. Solte o grampo vascular craniano e, em seguida, o clipe de caudal. Pare qualquer sangramento usando gaze aplicar leve pressão.
    16. Em torno deste tempo, injete buprenorfina (SQ, 0,02 mg/kg) para fornecer analgesia pós-operatória até o patch fentanil forneceu fentanil analgésico níveis plasmáticos.
      Nota: Uma injeção adicional de buprenorfina (SQ, 0,02 mg/kg) pode ser necessário 6 h após a primeira injeção para manter analgesia até fentanil plasma atinge uma concentração terapêutica.
    17. Repeti o protocolo de infusão de vírus no lado esquerdo, seguir passos 4.4.5-4.4.15.
  5. Fechamento da ferida
    1. Feche o tecido subcutâneo com sutura PGA de 5-0, usando um padrão contínuo. Feche a pele com sutura de PGA 3-0, usando um padrão intradérmico. Enterre os maçaricos em ambas as extremidades.
  6. Cuidados, limpeza e recuperação pós-operatória
    1. Siga o passo 2.4.

5. colheita de cirurgia (Terminal)

  1. Prepare os instrumentos e o local cirúrgico.
    1. Siga as etapas 2.1.1-2.1.3 em cirurgia de enxerto de veia.
    2. Deixe o assistente abrir e assepticamente coloque sobre a mesa do instrumento (ou passar para o cirurgião): uma seringa de 20 mL, uma agulha 21G, sutura de seda 3-0 e uma sonda de fluxo de sangue estéril.
    3. Siga os passos 2.1.5-2.1.6 e 2.1.8 cirurgia de enxerto de veia.
  2. Isolamento das artérias carótidas comuns e enxertos de veia
    1. Cortar a pele com eletrocautério ao longo da linha média entre o entalhe esternal e a mandíbula (aproximadamente 7-9 cm de comprimento) e prenda a pele do pescoço do coelho para as toalhas com braçadeiras de toalha.
    2. Na extremidade caudal, fazer um corte lateral curto através da fáscia com eletrocautério. Sem rodeios, disse sob a fáscia ao longo da linha média inteira. Corte a fáscia dissecada ao longo da linha mediana com eletrocautério.
    3. Comece no lado direito. Disse entre o músculo sternohyoid sobrejacente a traqueia e os músculos em forma de V sternocephalic para expor o enxerto de carótida e a veia comum.
    4. Disse o enxerto de veia direita e artéria carótida comum livre os tecidos circundantes. Use os loops de silicone cirúrgico de retração durante a dissecção da artéria e o enxerto de veia.
    5. Repita a dissecação do lado esquerdo, seguindo os passos 5.2.3-5.2.4.
  3. Fazer medições de fluxo seguindo passos 4.3.1-4.3.3 em cirurgia de transferência do gene.
  4. Colheita de enxertos da veia
    1. Com sutura de seda 3-0, ligate a artéria carótida comum direita cranial ao enxerto. Então ligate a carótida caudal ao enxerto.
    2. Excisar o enxerto de veia certa, dividindo-se a artéria carótida adjacente entre cada um da ligadura e a anastomose adjacente. Retire o coelho com o enxerto de veia e irrigue o lúmen com soro fisiológico.
    3. Apare a artéria carótida e anastomose de ambas as extremidades do enxerto de veia. Aparar fora excesso de tecido adventícia do enxerto de veia e cortar o enxerto em segmentos conforme necessário para análise de ponto de extremidade diferente.
    4. Colha o enxerto de veia esquerda, repetindo os passos 5.4.1-5.4.3.
  5. Injecte 1 mL de fenitoína/pentobarbital IV a eutanásia do coelho.
  6. Descarte quaisquer resíduos seguintes protocolos adequados para eliminação de resíduos de risco biológico e farelos.

Resultados

A competência técnica de um novo operador deve ser validada antes o operador pode usar esse método para gerar dados experimentais. O primeiro marco que deve atingir um novo operador é a patência do enxerto de veia consistente após a cirurgia de enxerto de veia inicial e a cirurgia subsequente de atraso-transdução. Sobre 90% permeabilidade após cada uma das cirurgias é desejável e realizável. A permeabilidade pode ser avaliada de forma não-invasiva usando ultra-som transcutân...

Discussão

Passos críticos no presente protocolo incluem a gestão de anestesia, manipulação cirúrgica, anticoagulação da veia artéria/enxertados e medidas hemodinâmicas da veia transplantada. A gestão adequada da anestesia é crítica neste modelo de cirurgia de sobrevivência múltiplos que inclui duas operações relativamente longas (normalmente 3-3.5 h para enxerto de veia bilateral e 1,5-2,5 h para transdução de enxerto bilateral). Nós temos administrada anestesia através de um cone de nariz e por intubação end...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Disposables
3mL syringe with 24G needleBecton Dickinson3095712x for vein graft surgery; 2x for gene transfer  surgery
1 mL syringe with 27G needleBecton Dickinson3096232x for vein graft surgery, 5x for gene transfer surgery
19G needleBecton Dickinson305187Gene transfer surgery
20 mL syringe, luer lockNipro Medical CorpJD+20L
Catheters, 24Ga x 3/4”Terumo Medical ProductsSROX2419V
21G needleBecton Dickinson305165Gene transfer surgery and for 20 mL syringe of saline
Gauze 4” x 4”Dynarex3242~10-15 per surgery
3-0 silk sutureCovidien Ltd.S-244
5-0 silk sutureCovidien Ltd.S-182
7-0 polypropylene sutureCP Medical8703PVein graft surgery
7-0 polypropylene sutureCP Medical8648PGene transfer surgery
5-0 polyglycolic acid sutureCP Medical421A
3-0 polyglycolic acid sutureCP Medical398A
Alcohol swabsCovidien Ltd.6818For the placement of I.V. line
Catheter plugVetoquinol411498
Ketamine HCl, 100 mg/mLVedco Inc.5098916106
Xylazine, 100 mg/mLAkorn Inc.4821
Lidocaine, 20 mg/mLPfizer409427702
Marcaine 0.5%Pfizer409161050
Beuthanasia D-SpecialIntervet Inc.NDC 00061047305Harvest surgery only
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mLPatterson Veterinary12496075705
Saline IV bag, 0.9% sodium chlorideBaxter2B1309
Heparin  (5000 U/mL)APP PharmaceuticalsNDC 63323-047-10
Papaverine (3.5 mg/ml)American Reagent Inc.NDC 0517-4002-25Diluted from 30mg/mL stock; Use 1 mL maximum
Fentanyl patch, 25 mcg/hApotex Corp.NDC 60505-7006-2
IsofluraneMultiple vendorsCatalog number not available
 Viral vectorGene transfer surgery only
Surgical Instruments
Metzenbaum needle holder 7" straightRobozRS-7900
Operating scissors 6.5" straight blunt/bluntRobozRS-6828
Needle holder /w suture scissorsMiltex8-14-IMC
Castroviejo scissorsRobozRS-5658
Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lockRobozRS-6412
Stevens scissors 4.25" curved blunt/bluntRobozRS-5943
Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongsRobozRS-65142x
Backhaus towel clamp 3.5"Roboz4x
Micro clip setting forceps 4.75"RobozRS-6496
Micro vascular clips, 11 mmRoboz
Surg-I-LoopScanlan International1001-81M5 cm length
Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip widthRobozRS-5210
Dumont #3 forceps Inox tip size .17 × .10 mmRobozRS-5042
Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8 mm tipRobozRS-5280
Halstead mosquito forceps,  5" straight, 1.3 mm tipsRobozRS-71102x
Halstead mosquito forceps,  5" curved, 1.3mm tipsRobozRS-7111
Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tipsRobozRS-7117
Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tipsRobozRS-7305
Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip widthRobozRS-8162
Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip widthFine Science Tools11092-122x
Adson forceps, 12 cm, serrated, straightFine Science Tools11006-12
Veterinary electrosurgery handpiece and electrodeMACAN ManufacturingHPAC-1; R-F11
Surgical Suite Equipment
Circulating warm water blanket and pumpMultiple vendorsCatalog number not available
Bair hugger warming unit3MModel 505
IV infusion pumpHeskaVet IV 2.2
Isoflurane vaporizer and scavengerMultiple vendorsCatalog number not available
Veterinary multi-parameter monitorSurgivetSurgivet Advisor
Veterinary electrosurgery unitMACAN ManufacturingMV-9
Surgical microscopeD.F. VasconcellosM90025X magnification for vein graft surgery; 16X magnification for gene transfer surgery

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