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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo metodo descrive il posizionamento degli innesti della vena di interposizione in conigli, la trasduzione degli innesti e il raggiungimento dell'espressione del transgene durevole. Questo permette l'indagine su ruoli fisiologici e patologici di transgeni e loro prodotti proteici nelle vene innestate e il test di terapie geniche per la malattia dell'innesto della vena.

Abstract

Chirurgia di bypass dell'innesto della vena è un trattamento per la malattia occlusiva arteriosa; Tuttavia, il successo a lungo termine è limitata dalla guasto dell'innesto a causa di trombosi, iperplasia intimale ed aterosclerosi. L'obiettivo di questo articolo è quello di illustrare un metodo per posizionare gli innesti bilaterali interposizione venosa in un coniglio, poi trasducendo gli innesti con un vettore di trasferimento del gene che raggiunge l'espressione del transgene durevole. Il metodo consente l'indagine dei ruoli biologici di geni e loro prodotti proteici nell'omeostasi dell'innesto della vena normale. Inoltre permette il testing di transgeni per le attività che potrebbero impedire il guasto dell'innesto di vena, ad es., se l'espressione di un transgene impedisce la crescita di neointimale, riduce l'infiammazione vascolare o riduce l'aterosclerosi in conigli alimentati con una dieta ad alta percentuale di grassi. Durante un intervento chirurgico di sopravvivenza iniziale, i segmenti di destra e di sinistra della vena giugulare esterna sono asportati e messi bilateralmente come invertita innesti di interposizione dell'arteria carotica comune di fine--lato. Durante un secondo intervento di sopravvivenza, effettuato 28 giorni più successivamente, ciascuno degli innesti è isolato dalla circolazione con clip vascolari e i lumen sono pieni (tramite un'arteriotomia) con una soluzione contenente un vettore (HDAd) adenovirale helper-dipendente. Dopo 20 min di incubazione, la soluzione di vettore è aspirata, arteriotomia viene riparato e flusso viene ripristinato. Le vene si raccolgono a intervalli di tempo dettate da singoli protocolli sperimentali. Il ritardo di 28 giorni tra il posizionamento dell'innesto e la trasduzione è necessario garantire l'adeguamento dell'innesto della vena per la circolazione arteriosa. Questo adattamento evita rapida perdita di espressione del transgene che si verifica negli innesti di vena trasformati prima o immediatamente dopo l'innesto. Il metodo è unico nella sua capacità di raggiungere l'espressione del transgene durevole, stabile nelle vene innestate. Rispetto ad altri modelli di innesto di grande vena animali, conigli hanno vantaggi di basso costo e facile movimentazione. Rispetto ai modelli dell'innesto della vena del roditore, conigli sono più grandi e più facile da manipolare vasi sanguigni che forniscono abbondante tessuto per l'analisi.

Introduzione

L'aterosclerosi è una malattia infiammatoria cronica in cui accumulo di lipidi e di infiammazione nella parete del vaso sanguigno portano a restringimento del lume vascolare, attacchi cardiaci, ictus e perdita di arti1,2. Interventi percutanei (ad es., angioplastica e stenting) e terapia medica (ad es., agenti di statine e antipiastriniche) sono trattamenti utili per aterosclerosi; Tuttavia, essi sono spesso inefficaci nel trattamento della malattia ostruttiva severa sia nelle circolazioni coronariche e periferiche. L'innesto di esclusione, utilizzando segmenti di vena autogena, rimane una procedura comune per il trattamento di pazienti con malattia vascolare coronaria e periferica severa e diffusa3,4. Tuttavia, vena innesti collocati in entrambi la coronaria e periferiche circolazioni hanno tassi di pervietà a lungo termine poveri. Nella circolazione coronaria, circa il 10-20% della vena innesti sono occlusi a 1 anno e 50% sono occluse da 10 anni5,6. Nella circolazione periferica, tassi di guasto dell'innesto della vena sono 30-50% a 5 anni7.

La terapia genica è un approccio attraente per la prevenzione di guasto dell'innesto della vena perché può fornire un prodotto del gene terapeutico proprio presso il sito della malattia. Di conseguenza, numerosi studi preclinici hanno testato la vena dell'innesto gene terapia8,9. Tuttavia, essenzialmente tutti questi studi hanno esaminato l'efficacia al tempo punti (2-12 settimane)10,11,12,13,14,iniziali15, 16 , 17. siamo a conoscenza di alcuna prova che gli interventi di terapia genica possono fornire durevole protezione (anni) contro tardo guasto dell'innesto della vena che in genere deriva da neointimale iperplasia e aterosclerosi4. Abbiamo sviluppato un metodo che permette l'espressione del transgene durevole nelle vene innestate e quindi permette la sperimentazione di interventi di terapia genica in ritardo così come primi momenti. Per ottenere l'espressione del transgene durevole, il metodo incorpora HDAd vettori e una strategia di trasduzione in ritardo. Giuseppe vettori forniscono l'espressione del transgene prolungata mancanza di geni virali, impedendo il riconoscimento (e rifiuto) di cellule trasdotte dal sistema immunitario18,19,20, 21. Delayed trasduzione (effettuata 28 giorni dopo il posizionamento dell'innesto) previene la perdita di cellule trasdotte durante il processo di arterializzazione che si verifica all'inizio dopo l' innesto22.

Altri metodi che ottenere l'espressione del transgene terapeutico nella parete dell'innesto della vena si affidano la trasduzione dell'innesto della vena al momento dell'innesto posizionamento10,11,12,15,16 ,17. Quando misurati in serie, utilizzando questo approccio l'espressione del transgene diminuisce rapidamente dopo la trasduzione22,23. Di conseguenza, gli studi che utilizzano questo approccio non hanno esaminato l'efficacia oltre le 12 settimane dopo l'innesto della vena, con più non ha valutato l'efficacia oltre 4 settimane. Al contrario, il nostro metodo raggiunge innesto della vena l'espressione del transgene che persiste stabile per almeno 24 settimane e basato su studi simili effettuati in arterie-probabile continua molto più lungo22,24. Siamo consapevoli di nessun altro vena gene terapia intervento di innesto che raggiunge l'espressione del transgene stabile di questa durata.

Abbiamo usato un modello del coniglio per sviluppare il nostro metodo. Altri hanno utilizzato roditori, conigli, o più grandi animali per testare la vena dell'innesto gene terapia10,11,12,15,16,17,25, 26. Rispetto ai modelli di roditori, conigli sono più costosi e sono soggetti a requisiti normativi più severi. Tuttavia, rispetto ad animali più grandi (ad es., maiali e cani), i conigli sono molto meno costosi da acquistare e casa e molto più facile da gestire. Inoltre, vasi di coniglio assomigliano umani vasi fisiologicamente27, sono sufficientemente grandi, che possono essere utilizzati per testare gli interventi percutanei28,29, e forniscono sufficiente tessuto che più endpoint (ad es., istologia, proteine, RNA) può essere esaminato tramite un singolo vaso sanguigno esemplare22,30. Inoltre, quando i conigli con gli innesti della vena sono alimentati con una dieta ricca di grassi, sviluppano vena innesto aterosclerosi31,32, che è una causa comune dell'arteria coronaria bypass vena innesto guasto4,5 . Questi innesti di vena di coniglio aterosclerotica possono servire come substrato per gli interventi di terapia genica consegnati con questo metodo di test. Il protocollo fornito può aiutare gli investigatori a padroneggiare le competenze tecniche necessarie per ottenere l'espressione del transgene durevole negli innesti di vena di coniglio.

Protocollo

Tutti i protocolli animale e gli studi sono stati approvati dall'Università di Washington Office of Animal Welfare.

1. pre-operazione (per tutti gli interventi chirurgici)

  1. Anestetizzare il coniglio con 30 mg/kg xylazina ketamina e 1,5 mg/kg per via intramuscolare (IM) nei muscoli paraspinali.
    Nota: Cibo e acqua non sono limitate prima della chirurgia.
  2. In attesa di sufficiente profondità dell'anestesia, è possibile impostare le tabelle in preparazione camera e sala operatoria (OR).
    1. Preparare la stanza di preparazione per la rasatura del collo del coniglio e il posizionamento della porta per via endovenosa (IV) nell'orecchio (solo chirurgia di sopravvivenza). Collocare l'unguento oftalmico, patch fentanil (chirurgia di sopravvivenza), tosatrici, preparazione tampone imbevuto di alcool, 24 G x ¾" catetere, iniezione e nastro chirurgico sul piano di preparazione.
    2. In sala operatoria, istituiti le apparecchiature di monitoraggio e associati sonde (elettrocardiogramma (ECG), pulsossimetria (SpO2) e temperatura). Preparare la pompa IV con una sacca di IV 100 mL soluzione fisiologica con un ago da 18 G o 19-G e impostare la velocità di flusso come 10 mL/h/kg (solo chirurgia di sopravvivenza). Impostare l'apparecchiatura dell'ossigeno e isoflurano con una punta conica (vena l'innesto o raccolto interventi chirurgici).
      1. Per proteggere la punta conica al coniglio, ciclo una striscia di garza attorno al tubo che fornisce gas per la punta conica. Questo ciclo dovrebbe circondare il tubo dove si attacca per la punta conica. Le estremità libere della striscia di garza entrambi dovrebbero essere lunga circa 45 cm. Posizionare la punta conica (con annesso garza) sul finale della testa della tabella.
    3. Accendere l'acqua di circolazione e/o riscaldamento coperta sul tavolo OR aria forzata. Sulla coperta riscaldante, posizionare un asciugamano arrotolato come un supporto per il collo e posizionare la piastra elettrodo dispersivo elettrocauterio.
    4. Come un analgesico locale, si combinano in una siringa da 1 mL di lidocaina 2% HCl e diluire 1 mL di bupivacaina 0,5% HCl. il virus fino alla concentrazione desiderata (qui, uso 2 x 1011 virale particelle/mL per HDAd) in DMEM sterile e continuare su ghiaccio (solo chirurgia di trasferimento gene).
    5. Dopo aver raggiunto un'adeguata profondità anestetica, preparare il coniglio per la chirurgia.
      Nota: Test per la mancanza di un riflesso di ritiro pedale per garantire un'adeguata profondità anestetica. Continuare a monitorare il riflesso pedale durante la chirurgia.
      1. Applicare unguento oftalmico agli occhi del coniglio.
      2. Per consentire il posizionamento di una sonda di temperatura rettale, premere con le dita guantate appena sopra il retto e spostare le dita verso l'ano per rimuovere defecatorie dal retto del coniglio.
      3. Radere il coniglio dalla tacca sternal al bordo della mandibola. Radere un orecchio per il posizionamento del IV e l'orecchio opposto per la somministrazione di fentanil patch (solo chirurgia di sopravvivenza). Radere la dita posteriore sinistra per il posizionamento della sonda2 SpO.
    6. Per la chirurgia di infusione di vettore, intubare il coniglio. Utilizzare un 4 mm O.D./3 mm I.D. uncuffed tubo endotracheale, infilati sopra un Artroscopio. Posizionare il coniglio in decubito sternale e iper-estendere il collo. Tenere bocca del coniglio spalancata e consente di visualizzare la glottide e laringe piega l'artroscopio. Durante l'ispirazione, inserire delicatamente il tubo endotracheale attraverso la laringe e la trachea.
    7. Per gli interventi chirurgici di sopravvivenza, posizionare e fissare un catetere di IV 24-G in vena di sinistra dell'orecchio del coniglio e dirla con un foro di iniezione. Applicare una patch di 25 µ g/h fentanil per orecchio destro del coniglio.
      Nota: Il protocollo è per un chirurgo posizionato sul lato destro del coniglio. Se il chirurgo sarà sul lato sinistro del coniglio, invertire i lati in questo passaggio per tenere i fili e IV fronte del chirurgo. Se necessario, passare i lati in passi futuri.
    8. Per gli interventi di innesto e raccolto della vena, amministrare l'anestesia generale con una punta conica; per la chirurgia di infusione di vettore, amministrare l'anestesia generale tramite un tubo endotracheale.
      Nota: L'intubazione può essere utilizzato per tutti gli interventi chirurgici.  Nella nostra esperienza, tuttavia, i rischi di complicazioni da trauma laringeo e trachea durante l'intubazione possono superare i benefici di intubazione.  L'intervento chirurgico che include il trasferimento del gene ad un innesto (particolarmente nei conigli di colesterolo-federazione) è l'unico intervento chirurgico in cui intubazione sembra fornire un beneficio netto.
    9. Portare il coniglio in sala operatoria. Posizionare il coniglio in una posizione supina sul tavolo operatorio con l'asciugamano di supporto collo posizionato appena sotto la testa del coniglio. Estendere delicatamente collo del coniglio fino a quando è dritto e circa orizzontale.
    10. Posizionare la punta conica al coniglio (vena innesto e raccolto ambulatori) o collegare il tubo endotracheale (vettore infusione chirurgia) con O2 a 1 L/min e iniziare isoflurano. Se si utilizza una punta conica, fissarla avvolgendo le estremità delle strisce di garza annesso intorno asciugamano di supporto collo del coniglio. Regolare la concentrazione di isoflurane secondo necessità (in genere 1-2%) per mantenere un livello chirurgico dell'anestesia.
    11. Centro la piastra elettrodo dispersivo elettrocauterio dietro la schiena del coniglio. Inserire la sonda di temperatura rettale e applicare la SpO2 sonda ed EKG conduce al coniglio.
    12. Collegare la linea IV Salina alla porta catetere nell'orecchio sinistro del coniglio e avviare la pompa di infusione IV a 10 mL/h/kg. Dopo 1 h, ridurre il tasso di infusione salina a 5 mL/h/kg.
    13. Legare senza stringere gambe anteriori del coniglio al tavolo operatorio come un sistema di ritenuta.
      Nota: Facoltativamente, un piccolo tavolo di plastica può essere posizionato sopra il coniglio per evitare che il chirurgo da premendo sul torace/addome del coniglio e potenzialmente causare aspirazione e malattia da reflusso gastroesofageo.
    14. Iniettare lidocaina/bupivacaina (2 mL, mix 50/50, punto 1.2.4) per via sottocutanea (SQ) nel collo lungo la linea di incisione pianificata, per l'anestesia locale.
    15. Sono l'Assistente di disinfettare la chirurgica del sito con 3 alternando scrub di clorexidina gluconato e isopropanolo, quindi spruzzare il sito con povidone-iodio. Sono chirurgo scrub, abito e guanto, seguendo principi asettici.
      1. Eseguire interventi chirurgici di sopravvivenza in condizioni asettiche. Hanno l'assistente gestire eventuali elementi non sterili e asetticamente passare materiali sterili al chirurgo o asetticamente metterli sul portamoduli drappeggiato.
      2. Avere il chirurgo di uso asciugamani sterili per manipolare in modo asettico attrezzature non sterili come il microscopio. Avere il chirurgo indossare lenti di ingrandimento chirurgiche: 2x durante l'esecuzione della prima metà della chirurgia.

2. vena chirurgia dell'innesto (sopravvivenza)

  1. Preparare gli strumenti e il campo sterile.
    1. Fare l'assistente in confezioni sterili (un drappo di tabella, un drappo di carta e 6 asciugamani) e Trasferire asetticamente i contenuti per il chirurgo.
    2. Drappo portamoduli. Posizionare il drappo di carta e asciugamani sterili sul tavolo strumento drappeggiato. Con 4 asciugamani, drappo il coniglio, lasciando solo il sito chirurgico sul collo esposto. Posare il telo di carta sopra il coniglio. Un asciugamano verrà utilizzato in seguito, e l'ultimo è una copia di backup.
    3. Avere l'assistente aprire la confezione sterile strumento e asetticamente passare il vassoio dello strumento per il chirurgo. Disporre gli strumenti sul portamoduli.
    4. Sono l'Assistente di aprire le seguenti attrezzature e asetticamente passarlo al chirurgo o posizionarla sul tavolo per strumenti: una siringa da 1 mL, una siringa da 3 mL, una siringa da 20 mL, un ago 21G, sutura (PGA) l'acido poliglicolico di 3-0, sutura PGA 5-0 , 7-0 suturare del polipropilene e un catetere IV di 24 G.
    5. Fissare il cavo di elettrocauterio il telo che copre il coniglio, utilizzando una Kantrowitz forcipe 7.25". Cadere l'estremità del cavo con spina sopra il bordo del tavolo operatorio per essere collegato all'unità elettrochirurgia e attivata dall'assistente.
    6. Riempire una siringa da 20 mL con soluzione salina sterile da una sacca di soluzione fisiologica o flaconcino tenuto dall'assistente. Utilizzare questa soluzione salina come necessario per evitare la disidratazione del tessuto esposto durante l'operazione.
    7. Preparare 5 mL di soluzione salina fisiologica eparinizzata aggiungendo 0,1 mL di eparina 5.000 UI/mL a 5 mL di soluzione fisiologica, cioè., eparina di 100 UI/mL, in una piccola ciotola chirurgica. Utilizzare questa soluzione per svuotare l'innesto della vena e dell'arteria carotica regolarmente durante la procedura d'innesto.
    8. Tagliare un buco nel drappo di carta sopra il sito chirurgico sul collo del coniglio. Uso asciugamano morsetti per fissare gli angoli del foro nel posto in cui gli asciugamani sottostanti.
  2. Dissezione vascolare
    Nota: Utilizzare 2 lenti di ingrandimento chirurgiche x per aiutare con questa parte della chirurgia.
    1. Tagliare la pelle con l'elettrocauterio lungo la linea mediana tra la tacca di sternal e la mandibola (circa 7-9 cm di lunghezza) e la fascetta della pelle del collo del coniglio per gli asciugamani con i morsetti di asciugamano. Verso l'estremità caudale, fare un breve taglio laterale attraverso la fascia con l'elettrocauterio. Senza mezzi termini sezionare sotto la fascia lungo il midline intero utilizzando forbici grandi. Tagliare lo strato Fascia sezionato lungo la linea mediana con l'elettrocauterio.
    2. Iniziare sul lato destro. Sezionare tra il muscolo sternohyoid sovrastante la trachea e il muscolo a forma di V sternocephalic, per esporre l'arteria carotica comune.
    3. Accuratamente sezionare un segmento di 4-5 cm dell'arteria carotica comune e dei relativi rami più grandi (in genere 1-2 per lato) liberi dai tessuti circostanti. Estendere la dissezione dalla base del collo prossimalmente all'incrocio del nervo pharyngeal distale. Uso chirurgico silicio loop per facilitare la retrazione dell'arteria carotica durante la dissezione. Lega i più grandi rami dell'arteria carotica comune con suture seta 5-0 prima di tagliare ogni ramo distale.
      Nota: Fare attenzione a non disturbare il nervo vago che affianca l'arteria carotica comune, o i più piccoli nervi che attraversano sopra l'arteria.
    4. Ripetere la dissezione sul lato sinistro (punto 2.2.3).
    5. Utilizzare tessuto-holding pinze per chiudere temporaneamente lo strato di tessuto sottocutaneo. Sezionare la fascia superficiale della pelle sul lato destro fino a quando la vena giugulare esterna è esposta. Sezionare un segmento di 4-5 cm della vena giugulare esterna e libera i suoi rami dal tessuto circostante, legando i piccoli rami con suture seta 5-0 prima di tagliare il ramo.
    6. Ripetere la dissezione sul lato sinistro (punto 2.2.5).
    7. Iniettare l'eparina (150 UI/kg) del catetere IV e a filo con 10 mL di soluzione fisiologica.
    8. Misurare un segmento di 3 cm della vena giugulare esterna sul lato destro e legare l'estremità caudale del segmento con sutura seta 5-0. Consentire la vena a riempirsi di sangue, poi legare le estremità cranica del segmento di vena. Dividere le estremità cranica del segmento della vena giugulare esterna, lavare delicatamente il vaso con soluzione salina eparinizzata (100 U/mL) utilizzando una siringa da 3 mL per un 24-G IV-catetere. Dividere il segmento di vena alla sua estremità caudale. Posizionare il segmento della vena in modo standardizzato, in cui le estremità caudale e craniale sono inequivocabilmente identificabili.
  3. L'innesto della vena
    1. Rimuovere le lenti di ingrandimento chirurgiche dal chirurgo e spostare il microscopio operatorio (25 X) in posizione, lasciare che l'assistente.
      Nota: Il chirurgo dovrebbe drappo un asciugamano sterile sopra il microscopio. Questo permette al chirurgo di manipolare il microscopio mantenendo la sterilità.
    2. Bloccare l'arteria carotica comune di destra ad ogni estremità del segmento isolato con mini-morsetti, ponendo il morsetto cranico in primo luogo per consentire arteria di riempimento, quindi posizionare il morsetto caudale.
    3. Tagliare un pezzo di cm × 2 1 di carta rigida (disponibile dalla confezione sterile sutura) e posizionarlo sotto l'arteria carotica comune, per migliorare l'esposizione.
    4. Eseguire un'arteriotomia appena craniale al morsetto caudale (arteriotomia caudale). La lunghezza di arteriotomia deve essere uguale al diametro dell'estremità cranica del segmento di vena. Inserire la siringa con il catetere IV attraverso arteriotomia caudale e lavare il lume dell'arteria carotica con soluzione salina eparinizzata.
    5. Suturare cranica fine della vena per l'arteriotomia caudale, con sutura in polipropilene 7-0 con punti di sutura singole (Figura 1).
      1. Posizionare il primo punto per suturare l'estremità caudale della arteriotomia caudale all'estremità cranica del segmento di vena. Posizionare il secondo punto 180° dal primo punto, suturare l'estremità cranica del arteriotomia caudale all'estremità cranica del segmento di vena.
      2. Posizionare il terzo punto in un punto equidistante dai primi due punti di sutura, sulla parte laterale dell'anastomosi. Posizionare il punto di quarto sul lato mediale dell'anastomosi, equidistante dai primi due punti e di fronte il terzo punto. Posto 4 ulteriori punti (punti 5-8) tra ciascuno dei punti 1-4.
      3. Eseguire l'arteriotomia cranica sul lato caudale del clip cranica. La distanza tra estremità cranica del arteriotomia cranica e l'estremità caudale della caudale arteriotomia dovrebbe essere lo stesso come la lunghezza del segmento di vena. La lunghezza di arteriotomia cranica è uguale al diametro dell'estremità caudale del segmento di vena.
    6. Estendere la vena cranialmente dall'anastomosi, ponendola in cima la carotide, senza introdurre alcun colpi di scena. Sciacquare la carotide e vena con soluzione fisiologica eparinata normale tramite arteriotomia cranica. La soluzione salina fluirà attraverso l'arteria, nella vena tramite l'anastomosi caudale e uscirà dall'estremità libera e unsutured della vena. Flushing la vena anche esso impedisce la torsione.
    7. Suturare l'estremità caudale della vena per l'arteriotomia cranica (Figura 1).
      1. Posto un primo punto per suturare l'estremità caudale della arteriotomia cranica all'estremità caudale del segmento di vena. Inserire un secondo punto per sutura cranica fine arteriotomia cranica all'estremità caudale del segmento di vena. Completare l'anastomosi come descritto nel passaggio 2.3.5.2. Poco prima che l'ultimo nodo è legato sull'anastomosi cranica, brevemente aprire il morsetto all'estremità cranica del segmento dell'arteria carotica comune sezionato, per consentire retro-sanguinamento che lava via l'aria nella carotide e vena innestata. Quindi, stringere il nodo ultimo.
    8. Allentare il morsetto cranico per consentire il riempimento dell'innesto della vena con il sangue e quindi allentare il blocco caudale. Brisk pulsazioni dovrebbero essere visto nell'innesto della vena. Applicare una leggera pressione con una garza asciutta per bloccare qualsiasi emorragia presso le anastomosi.
    9. Legare le due estremità del segmento dell'arteria carotica comune che collega le anastomosi con una sutura seta 3-0 e dividere la carotide a metà strada tra le legature (Figura 1). Applicare alcune gocce di papaverina (3,5 mg/mL) per l'adiacente ad ogni anastomosi dell'arteria carotica.
    10. Iniettare l'eparina (75 UI/kg) il catetere orecchio IV e a filo con 10 mL di soluzione fisiologica. In questo momento, iniettare buprenorfina (SQ, 0,02 mg/kg) per fornire l'analgesia postoperatoria fino a quando la patch fentanil ha fornito livelli plasmatici analgesico di fentanil.
      Nota: Un'iniezione di buprenorfina aggiuntive (SQ, 0,02 mg/kg) può essere necessario 6 h dopo la prima iniezione per mantenere l'analgesia, fino a quando il fentanil plasma raggiunge una concentrazione terapeutica.
    11. Ripetere l'innesto sul lato sinistro (passaggi 2.2.8, 2.3.2-2.3.9).
    12. Chiudere il tessuto sottocutaneo con sutura PGA 5-0 utilizzando un modello continuo. Chiudere la pelle con sutura PGA 3-0 utilizzando un modello intradermico. Seppellire i nodi su entrambe le estremità.
  4. Cura, pulizia e recupero post-operatorio
    Nota: Lasciare il coniglio recuperare dall'anestesia in un ambiente calmo e tranquillo. Monitorare il coniglio continuamente per la corretta ossigenazione e la temperatura corporea fino a completamente ha recuperato.
    1. Spegnere isoflurano e ossigeno e scollegare la macchina di anestesia del coniglio. Scollegare il tubo di fluidi IV del coniglio, ma lasciare il porto di IV nella vena orecchio per accesso emergente.
    2. Trasportare il coniglio in una gabbia di recupero e posizionarlo sul suo lato. Fornire supporto termico con un acqua calda coperta (o il riscaldamento ad aria forzata). Dare O2 di punta conica fino a SpO2 è stabile.
    3. Fino a quando il coniglio può sedersi e deambulare nella sua gabbia, capovolgere il coniglio al suo lato ogni 15 min. Quindi rimuovere la cannula IV di orecchio e tornare il coniglio alla sua gabbia. Restituire il coniglio per la compagnia di altri animali solo dopo che è completamente recuperato dall'anestesia.
    4. Smaltire qualsiasi rifiuti seguenti protocolli appropriati per biohazard e smaltimento dei rifiuti di sharps.
    5. Postoperatorio, controllare il coniglio salute e ferita chirurgica ogni giorno. Amministrare la buprenorfina come bisogno per dolore non gestiti dalla patch fentanil. Rimuovere la patch fentanil giorno postoperatorio 3.

3. transcutanea ultrasuono

  1. Per valutare l'evidenza dell'innesto, eseguire esame ecografico il coniglio non anestetizzato 5-7 giorni dopo la chirurgia di innesto della vena e trasferimento genico.
    1. Avvolgete il coniglio non anestetizzati saldamente in una coperta e il coniglio supina in un veterinario V-attraverso con il collo esteso. Radere il collo, o se necessario, rimuovere i peli con un agente depilatorio. Applicare il gel per ultrasuoni al collo ed eseguire un esame di ultrasuono.
      Nota: Un esame di ultrasuono viene eseguito anche su conigli anestetizzati al momento sia l'operazione di trasferimento del gene che la chirurgia dell'innesto terminale di raccolta per esaminare l'evidenza dell'innesto e per misurare il diametro del lume dell'innesto. L'esame avviene appena prima il lavaggio del collo e viene eseguita in modo analogo per quanto riguarda i conigli non anestetizzati.

4. Gene Transfer ambulatorio effettuato ~ 28 giorni dopo il posizionamento dell'innesto (sopravvivenza chirurgia)

  1. Prepara gli strumenti e il campo sterile.
    1. Seguire i passi 2.1.1-2.1.3. nella chirurgia dell'innesto della vena.
    2. Lasciate che l'assistente aprire le seguenti attrezzature e sia in modo asettico passarlo al chirurgo o posizionarla sul tavolo per strumenti: sei 1 mL siringhe (con ago), una siringa da 3 mL, una siringa da 20 mL, un ago 21G, un ago 19-G, sutura PGA 3-0 , Sutura PGA 5-0, 7-0 suturare del polipropilene, due cateteri IV di 24 G e una sonda di flusso di sangue sterile.
    3. Seguire i passi 2.1.5-2.1.6. nella chirurgia dell'innesto della vena.
    4. Preparare una siringa 1 mL con 1 mL DMEM per lavare l'innesto della vena e dell'arteria e preparare due siringhe-1-mL con soluzione virus (~ 0.5-0.7 dell'innesto di vena/soluzione di virus mL). Lasciate che l'assistente scongelare il virus e diluirlo in DMEM. Preparare una siringa da 3 mL con 0,5 mL di lidocaina/bupivacaina (mix 50/50, punto 1.2.4).
    5. Seguire il passaggio 2.1.8 in chirurgia dell'innesto della vena.
  2. Isolamento degli innesti della vena e arterie carotiche adiacente
    Nota: 2 x lenti di ingrandimento chirurgiche dovrebbero essere utilizzati per questa parte.
    1. Tagliare la pelle con l'elettrocauterio lungo la linea mediana tra la tacca di sternal e la mandibola (circa 7-9 cm di lunghezza) e la fascetta all'aperto di pelle con morsetti di asciugamano. Applicare 0,5 mL di lidocaina/bupivacaina (mix 50/50, punto 1.2.4) al tessuto sottocutaneo.
    2. Verso l'estremità caudale, fare un breve taglio laterale attraverso la fascia con l'elettrocauterio. Senza mezzi termini sezionare sotto la fascia lungo il midline intero. Con l'elettrocauterio, tagliare lungo la fascia sezionata lungo la linea mediana.
    3. Iniziare sul lato destro. Sezionare tra il muscolo sternohyoid sovrapponendo la trachea e il muscolo a forma di V sternocephalic, per esporre l'innesto della vena. Isolare accuratamente l'innesto della vena e 1.5-2.0 cm della carotide adiacente all'innesto su entrambi i lati craniali e caudali.
    4. Ripetere la dissezione sul lato sinistro seguendo passo 4.2.3.
  3. Misurare il flusso di sangue negli innesti di vena.
    1. Riempire la cavità di ferita chirurgica sul lato destro con normale soluzione fisiologica per consentire la trasmissione di onde sonore. Immergere una sonda di flusso 2mm perivascolare (collegata ad un misuratore di flusso di volume) nella soluzione fisiologica nella cavità della ferita e impostare la portata a zero.
    2. Posizionare la sonda di flusso intorno all'arteria carotica caudale o craniale per l'innesto della vena. Registrare i dati della sonda di flusso con un sistema di acquisizione dati elettronici.
    3. Ripetere la misura della portata sul lato sinistro dopo il punto 4.3.2.
    4. Calcolare la pulsatilità basato su portata sistolica di punta, portata minima diastolica e media portata. Anche calcolare la sollecitazione di taglio laminare, sulla base del tasso di flusso e diametro del lume (misurato con ecografia transcutanea).
  4. Infondere soluzione vettoriale negli innesti di vena
    Nota: Un microscopio chirurgico (16x) è utilizzato come necessario per la perforatura, infusione e la riparazione dell'arteria carotica.
    1. Sono l'Assistente di lenti di ingrandimento chirurgiche del chirurgo di rimuovere e spostare il microscopio operatorio in posizione. Sono il chirurgo drappo un asciugamano sterile sopra il microscopio. L'asciugamano sterile permette al chirurgo di manipolare il microscopio mantenendo la sterilità.
    2. Sono l'Assistente di iniettare l'eparina (150 UI/kg) del catetere IV e irrigare con soluzione fisiologica.
    3. Utilizzare un driver di grosso ago per piegare l'ago 21 G a circa 80° appena sopra la smussatura (non piegare la smussatura; Figura 2A).
    4. Bloccare l'arteria carotica comune ad ogni estremità dell'innesto della vena con mini-morsetti, ponendo il morsetto cranico in primo luogo per consentire arteria di riempimento, quindi posizionare il clip caudale. Posizionare la clip caudale circa 10 mm caudale all'anastomosi, per lasciare spazio per l'arteriotomia.
    5. Mettere due cravatte di seta intorno all'arteria caudale solo all'innesto e legare un singolo nodo alla marinara su ciascuno - senza stringerle.
    6. La carotide caudale all'innesto la puntura con l'ago 21 G piegato solo cranica della caudale clip vascolari. Fare attenzione a non forare le pareti posteriore o laterale. Fare avanzare l'ago nel lumen e indietro due volte per garantire che il lume è chiaro, quindi estrarre delicatamente l'ago.
      Note: Puntura carotica comune può essere aiutata da afferrando il adventitia arterioso con una pinzetta e si sollevano delicatamente la parete frontale mentre si inserisce la punta dell'ago appena caudale fino al punto di sollevamento (Figura 2A). Questo riduce il rischio di colpire la parete posteriore con l'ago.
    7. Con diversi rilievi di garza dispiegato, creare un nido per posizionare la siringa usata per infusioni. Posto questo nido di garza caudale al sito chirurgico.
    8. Mettere un 24 G IV-catetere sulla siringa con solo DMEM e stringere il catetere sulla siringa appena sufficiente per evitare perdite (la siringa verrà rimossa in seguito a questo intervento chirurgico) e piegare il catetere ~ 4 mm dalla punta affinché la curva tiene a circa 75° dopo il rilascio.
    9. Inserire il catetere IV arteriotomia carotidea comune fino al punto di curvatura e lavare il lume dell'innesto della vena due volte con 0,5 mL di DMEM. Per ogni ripetizione, riempire l'innesto della vena con DMEM. Quindi rimuovere il DMEM dall'innesto premendo leggermente con un dito guantato all'estremità cranica dell'innesto. Far scorrere delicatamente il dito verso l'estremità caudale dell'innesto per scovare il contenuto luminale tramite arteriotomia.
    10. Rimuovere la siringa DMEM dal catetere, lasciando il catetere nel vaso. Collegare la siringa contenente la soluzione di virus, assicurandosi che nessuna aria entra il catetere. Spostare che la seta senza bloccare annodata lega giù l'arteria fino a quando sono intorno alla punta del catetere, ma non serrarle.
    11. Infondere 0,03 mL di soluzione di virus per spingere il restante DMEM fuori il catetere. Rimuovere tutto il fluido dal lume dell'innesto della vena con un dito, premendo delicatamente da craniale a caudale.
    12. Stringere i due legami intorno alla punta dell'arteria e catetere per sigillare il lume. Iniettare la soluzione di virus fino a quando la vena è dilatata. Appoggiare delicatamente la siringa verso il basso sul nido di garza.
      Nota: È fondamentale che l'innesto della vena si espande al suo calibro pre-trasduzione e rimane gonfiato durante l'infusione di virus. In caso contrario, l'importo del trasferimento genico sarà diminuita significativamente.
    13. Lasciare la soluzione contenente virus nel lume dell'innesto della vena per 20 min e quindi sostituire la siringa contenente virus collegata al catetere con una siringa vuota. Fino a quando la nave collassa, delicatamente di aspirare la soluzione contenenti virus dall'innesto. Rimuovere la siringa, lasciando il catetere in posizione. Tagliare e sciogliere i punti di sutura seta e ritirare il catetere dalla nave. Rimuovere il catetere dall'arteria carotica attentamente per evitare di danneggiare l'endotelio.
    14. Con l'ausilio del microscopio chirurgico, è necessario chiudere l'arteriotomia con sutura in polipropilene 7-0 utilizzando un modello di X (Figura 2B).
      1. Afferrare la sutura con un porta-aghi, immettere il vaso in basso a destra di arteriotomia e uscire il vaso in basso a sinistra. Attraversare l'apertura all'esterno della nave e fare il secondo passaggio da in alto a destra in alto a sinistra.
      2. Prima di serrare la sutura, brevemente rilasciare la clip vascolare cranica per svuotare aria e virus residuo dall'innesto della vena e dell'arteria. Il sangue scorrerà fuori arteriotomia quando il morsetto viene rilasciato.
      3. Nelle vicinanze l'arteriotomia tirando delicatamente la sutura finisce e legarli insieme a 2 nodi quadrati.
        Nota: Tirare la sutura troppo stretta causerà Trefolatura del tessuto che disturba il flusso, aumenterà il rischio di trombosi e potenzialmente introdurre variabili incontrollate.
    15. Rilasciare la clip vascolare cranica, quindi il clip caudale. Bloccare qualsiasi emorragia utilizzando garza per applicare una leggera pressione.
    16. Intorno a questo tempo, iniettare buprenorfina (SQ, 0,02 mg/kg) per fornire l'analgesia postoperatoria fino a quando la patch fentanil ha fornito analgesico fentanil i livelli del plasma.
      Nota: Un'iniezione di buprenorfina aggiuntive (SQ, 0,02 mg/kg) può essere necessario 6 h dopo la prima iniezione per mantenere l'analgesia, fino a quando il fentanil plasma raggiunge una concentrazione terapeutica.
    17. Ripetere il protocollo di infusione di virus sul lato sinistro, seguenti passi 4.4.5-4.4.15.
  5. Chiusura della ferita
    1. Chiudere il tessuto sottocutaneo con sutura PGA 5-0, utilizzando un modello continuo. Chiudere la pelle con sutura PGA 3-0 utilizzando un modello intradermico. Seppellire i nodi su entrambe le estremità.
  6. Cura, pulizia e recupero post-operatorio
    1. Seguire il passaggio 2.4.

5. harvest chirurgia (Terminal)

  1. Prepara gli strumenti e il sito chirurgico.
    1. Seguire i passi 2.1.1-2.1.3 in chirurgia dell'innesto della vena.
    2. Lasciate che l'assistente aprire e asetticamente posto sul tavolo dello strumento (o passare al chirurgo): una siringa da 20 mL, un ago 21G, sutura seta 3-0 e una sonda di flusso di sangue sterile.
    3. Attenersi alla seguente procedura 2.1.5-2.1.6 e 2.1.8 chirurgia dell'innesto della vena.
  2. Isolamento delle arterie carotiche comuni e gli innesti della vena
    1. Tagliare la pelle con l'elettrocauterio lungo la linea mediana tra la tacca di sternal e la mandibola (circa 7-9 cm di lunghezza) e la fascetta della pelle del collo del coniglio per gli asciugamani con morsetti di asciugamano.
    2. Verso l'estremità caudale, fare un breve taglio laterale attraverso la fascia con l'elettrocauterio. Senza mezzi termini sezionare sotto la fascia lungo il midline intero. Tagliare lungo la fascia sezionata lungo la linea mediana con l'elettrocauterio.
    3. Iniziare sul lato destro. Sezionare tra il muscolo sternohyoid sovrastante la trachea e i muscoli a forma di V sternocephalic per esporre l'innesto carotico e vena comune.
    4. Sezionare l'innesto della vena destra e dell'arteria carotica comune libero dai tessuti circostanti. Utilizzare i loop di silicone chirurgico per la retrazione dell'arteria e l'innesto della vena durante la dissezione.
    5. Ripetere la dissezione sul lato sinistro, seguendo la procedura 5.2.3-5.2.4.
  3. Effettuare misure di flusso seguendo passaggi 4.3.1-4.3.3 nella chirurgia di trasferimento del gene.
  4. Raccolta degli innesti della vena
    1. Con sutura seta 3-0, legare l'arteria carotica comune di destra cranica all'innesto. Poi legare la carotide caudale all'innesto.
    2. Asportare l'innesto della vena destra dividendo la carotide adiacente tra tutte le legature e l'anastomosi adiacente. Rimuovere l'innesto della vena del coniglio e lavare il lume con soluzione fisiologica.
    3. Tagliare l'arteria carotica e l'anastomosi da entrambe le estremità dell'innesto della vena. Tagliare il tessuto adventitial in eccesso lontano dall'innesto della vena e tagliare l'innesto in segmenti come necessario per le analisi di endpoint di tipo diverso.
    4. Raccogliere l'innesto della vena sinistra ripetendo i passaggi 5.4.1-5.4.3.
  5. Iniettare 1 mL di fenitoina/pentobarbital IV per eutanasia il coniglio.
  6. Smaltire qualsiasi rifiuti seguenti protocolli appropriati per biohazard e smaltimento dei rifiuti di sharps.

Risultati

La competenza tecnica di un nuovo operatore deve essere convalidata prima che l'operatore può utilizzare questo metodo per generare dati sperimentali. La prima pietra miliare che deve realizzare un nuovo operatore è la pervietà dell'innesto della vena coerente dopo l'ambulatorio iniziale l'innesto della vena e la trasduzione in ritardo l'ambulatorio successivo. Oltre il 90% la pervietà dopo ciascuno degli ambulatori è auspicabile e realizzabile. L'evidenza può essere valutata in mod...

Discussione

Punti critici in questo protocollo comprendono la gestione dell'anestesia, anticoagulazione manipolazione chirurgica della vena arteria/innestato e misure emodinamiche della vena innestata. Corretta gestione dell'anestesia è critico in questo modello di chirurgia multipla di sopravvivenza che include due operazioni relativamente lunghe (in genere 3-3.5 h per l'innesto bilaterale della vena e 1.5-2.5 h per trasduzione dell'innesto bilaterale). Abbiamo amministrato l'anestesia con una punta conica e con intubazione endotr...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Disposables
3mL syringe with 24G needleBecton Dickinson3095712x for vein graft surgery; 2x for gene transfer  surgery
1 mL syringe with 27G needleBecton Dickinson3096232x for vein graft surgery, 5x for gene transfer surgery
19G needleBecton Dickinson305187Gene transfer surgery
20 mL syringe, luer lockNipro Medical CorpJD+20L
Catheters, 24Ga x 3/4”Terumo Medical ProductsSROX2419V
21G needleBecton Dickinson305165Gene transfer surgery and for 20 mL syringe of saline
Gauze 4” x 4”Dynarex3242~10-15 per surgery
3-0 silk sutureCovidien Ltd.S-244
5-0 silk sutureCovidien Ltd.S-182
7-0 polypropylene sutureCP Medical8703PVein graft surgery
7-0 polypropylene sutureCP Medical8648PGene transfer surgery
5-0 polyglycolic acid sutureCP Medical421A
3-0 polyglycolic acid sutureCP Medical398A
Alcohol swabsCovidien Ltd.6818For the placement of I.V. line
Catheter plugVetoquinol411498
Ketamine HCl, 100 mg/mLVedco Inc.5098916106
Xylazine, 100 mg/mLAkorn Inc.4821
Lidocaine, 20 mg/mLPfizer409427702
Marcaine 0.5%Pfizer409161050
Beuthanasia D-SpecialIntervet Inc.NDC 00061047305Harvest surgery only
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mLPatterson Veterinary12496075705
Saline IV bag, 0.9% sodium chlorideBaxter2B1309
Heparin  (5000 U/mL)APP PharmaceuticalsNDC 63323-047-10
Papaverine (3.5 mg/ml)American Reagent Inc.NDC 0517-4002-25Diluted from 30mg/mL stock; Use 1 mL maximum
Fentanyl patch, 25 mcg/hApotex Corp.NDC 60505-7006-2
IsofluraneMultiple vendorsCatalog number not available
 Viral vectorGene transfer surgery only
Surgical Instruments
Metzenbaum needle holder 7" straightRobozRS-7900
Operating scissors 6.5" straight blunt/bluntRobozRS-6828
Needle holder /w suture scissorsMiltex8-14-IMC
Castroviejo scissorsRobozRS-5658
Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lockRobozRS-6412
Stevens scissors 4.25" curved blunt/bluntRobozRS-5943
Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongsRobozRS-65142x
Backhaus towel clamp 3.5"Roboz4x
Micro clip setting forceps 4.75"RobozRS-6496
Micro vascular clips, 11 mmRoboz
Surg-I-LoopScanlan International1001-81M5 cm length
Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip widthRobozRS-5210
Dumont #3 forceps Inox tip size .17 × .10 mmRobozRS-5042
Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8 mm tipRobozRS-5280
Halstead mosquito forceps,  5" straight, 1.3 mm tipsRobozRS-71102x
Halstead mosquito forceps,  5" curved, 1.3mm tipsRobozRS-7111
Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tipsRobozRS-7117
Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tipsRobozRS-7305
Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip widthRobozRS-8162
Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip widthFine Science Tools11092-122x
Adson forceps, 12 cm, serrated, straightFine Science Tools11006-12
Veterinary electrosurgery handpiece and electrodeMACAN ManufacturingHPAC-1; R-F11
Surgical Suite Equipment
Circulating warm water blanket and pumpMultiple vendorsCatalog number not available
Bair hugger warming unit3MModel 505
IV infusion pumpHeskaVet IV 2.2
Isoflurane vaporizer and scavengerMultiple vendorsCatalog number not available
Veterinary multi-parameter monitorSurgivetSurgivet Advisor
Veterinary electrosurgery unitMACAN ManufacturingMV-9
Surgical microscopeD.F. VasconcellosM90025X magnification for vein graft surgery; 16X magnification for gene transfer surgery

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