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Résumé

Cette méthode décrit le placement des greffes de veine d’interposition chez le lapin, la transduction des greffons et la réalisation d’expression du transgène durables. Cela permet à l’enquête des rôles physiologiques et pathologiques des transgènes et leurs produits protéiques dans les veines greffées et essais de thérapies géniques pour veine du greffon.

Résumé

Pontage aorto-coronarien greffe veineuse est un traitement pour la maladie artérielle occlusive ; Cependant, les succès à long terme est limitée par échec de greffe à cause de la thrombose, l’hyperplasie intimale et l’athérosclérose. L’objectif de cet article est de démontrer une méthode pour placer greffes d’interposition veineuse bilatérale chez un lapin, puis transduction les greffons avec un vecteur de transfert de gène qui permet d’obtenir l’expression transgénique résistant. La méthode permet à l’enquête sur le rôle biologique des gènes et de leurs produits protéiques dans l’homéostasie greffe veine normale. Il permet également l’essai de transgènes pour les activités qui pourraient empêcher la défaillance d’une greffe veineuse, par exemple., si l’expression d’un transgène empêche la croissance néointimale, réduit l’inflammation vasculaire ou réduit l’athérosclérose chez les lapins nourris avec une alimentation riche en graisses. Au cours d’une chirurgie de survie initiale, les segments de droite et gauche veine jugulaire externe sont excisés et placés sur le plan bilatéral comme bout à l’autre inversé l’artère carotide commune greffes interposition. Au cours d’une deuxième chirurgie survie, 28 jours plus tard, chacun des greffons est isolé de la circulation avec clips vasculaires et les lumières sont remplis (via une artériotomie) avec une solution contenant le vecteur adénoviral (HDAd) dépendant d’assistance. Après une incubation de 20 min, la solution de vecteur est aspirée, l’artériotomie est réparé, et débit est rétabli. Les veines sont récoltés aux moments dictés par des protocoles expérimentaux. Le délai de 28 jours entre le placement de la prothèse et la transduction est nécessaire pour assurer l’adaptation de la prothèse de veine de la circulation artérielle. Cette adaptation permet d’éviter une perte rapide de transgene expression qui se produit dans la veine des greffes transduites avant ou immédiatement après la greffe. La méthode est unique dans sa capacité à atteindre l’expression TRANSGENIQUE durable et stable dans les veines greffées. Par rapport aux autres modèles de prothèse de grande veine animaux, lapins possèdent des avantages de manipulation facile et faible coût. Par rapport aux modèles de greffe de veine rongeurs, lapins ont de plus gros et plus facile-à-manipuler des vaisseaux sanguins qui fournissent des tissus abondante pour l’analyse.

Introduction

L’athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique dans laquelle l’accumulation de lipides et l’inflammation dans la paroi des vaisseaux sanguins conduisent au rétrécissement de la lumière du vaisseau, crises cardiaques, accidents vasculaires cérébraux et perte de membres1,2. Interventions percutanées (e.g., angioplastie et pose d’un stent) et un traitement médical (e.g., agents antiplaquettaires et de statines) est utile comme traitement pour l’athérosclérose ; Cependant, ils sont souvent inefficaces dans le traitement de maladie obstructive sévère dans les circulations coronaires et périphériques. La greffe de pontage, utilisant des segments de veine autogène, reste une procédure commune pour traiter les patients avec maladie vasculaire coronaire et périphérique sévère et diffuse3,4. Cependant, la veine greffons placés dans les deux les coronaires et des circulations périphériques ont de faibles taux de perméabilité à long terme. Dans la circulation coronaire, environ 10 à 20 % de veine greffes sont obstrués à 1 an et 50 % sont obstrués par 10 ans5,6. Dans la circulation périphérique, veine taux d’échec de greffe sont 30 à 50 % à 5 ans7.

La thérapie génique est une approche intéressante pour la prévention de l’échec de greffe veineuse car il peut fournir un produit de gène thérapeutique précisément sur le site de la maladie. En conséquence, de nombreuses études précliniques ont testé veine greffe génique thérapie8,9. Cependant, essentiellement, toutes ces études ont examiné l’efficacité au début temps points (2-12 semaines)10,11,12,13,14,15, 16 , 17. nous sommes au courant d’aucune preuve que les interventions de la thérapie génique peuvent fournir durable protection (années) contre fin échec de greffe veineuse résultant généralement d’athérosclérose et l’hyperplasie néointimale4. Nous avons développé une méthode qui permet l’expression transgénique résistant dans les veines greffées et permet ainsi l’essai des interventions de la thérapie génique aux moments mais aussi fin qu’au début. Pour atteindre l’expression du transgène durables, la méthode intègre HDAd vecteurs ainsi qu’une stratégie de transduction retardée. HDAd vecteurs fournissent prolongée transgene expression parce qu’ils manquent des gènes viraux, empêchant la reconnaissance (et le rejet) des cellules transduits par le système immunitaire18,19,20, 21. Delayed transduction (effectués 28 jours après la pose de prothèse) empêche la perte de cellules transduits au cours du processus d’arterialization qui se produit tôt après le greffage,22.

Autres méthodes qui atteignent l’expression de transgènes thérapeutiques dans la paroi de la prothèse veine s’appuient sur la transduction de la greffe veineuse au moment de la greffe placement10,11,12,15,16 ,,17. Lorsqu’elle est mesurée en série, transgene expression à l’aide de cette approche diminue rapidement après la transduction22,23. Par conséquent, en utilisant cette approche pas étudié l’efficacité au-delà de 12 semaines après la greffe de veine, plus ne pas évaluer l’efficacité au-delà de 4 semaines. En revanche, notre méthode réalise greffe veineuse continue de transgene expression qui persiste stable pendant au moins 24 semaines et axée sur les études similaires effectuées en artères-probablement beaucoup plus long22,24. Nous sommes au courant d’aucune autre veine greffon gène intervention orthophonique qui réalise l’expression du transgène stable de cette durée.

Nous avons utilisé un modèle de lapin pour développer notre méthode. D’autres ont utilisé des rongeurs, lapins, ou de plus grands animaux à veine d’essai de greffe génique thérapie10,11,12,15,16,17,25, 26. Par rapport aux modèles de rongeurs, les lapins sont plus chers et sont soumis à des exigences réglementaires plus strictes. Cependant, par rapport aux plus grands animaux (e.g., porcs et chiens), les lapins sont beaucoup moins cher à l’achat et la maison et beaucoup plus facile à gérer. En outre, vaisseaux du lapin ressemblent à des vaisseaux humains physiologiquement27, ils sont suffisamment importants, ils peuvent être utilisés pour l’essai des interventions percutanées28,29, qu’ils fournissent suffisamment tissu qui plusieurs points de terminaison (e.g., histologie, protéine, RNA) peuvent être examinées à l’aide d’un seul vaisseau sanguin spécimen22,30. En outre, lorsque les lapins avec veine greffes sont nourris avec une alimentation riche en graisses, elles développent veine greffon athérosclérose31,32, qui est une cause fréquente d’artères coronaires pontage veine greffon échec4,5 . Ces greffes de veine athéroscléreuse lapin peuvent servir comme un substrat pour l’essai des interventions de thérapie génique livrées avec cette méthode. Le protocole fourni peut aider les enquêteurs à maîtriser les compétences techniques nécessaires à la réalisation durable transgene expression dans les greffons de veine de lapin.

Protocole

Tous les protocoles de l’animales et les études ont été approuvées par l’Université de Washington Office de bien-être des animaux.

1. avant utilisation (pour toutes les chirurgies)

  1. Anesthésier le lapin avec 30 mg/kg de xylazine kétamine et 1,5 mg/kg par injection intramusculaire (IM) dans les muscles paraspinous.
    Remarque : Les aliments et l’eau sont limitent pas avant la chirurgie.
  2. En attendant une profondeur suffisante de l’anesthésie, mis en place les tables dans la salle de préparation et de la salle d’opération (OR).
    1. Préparer la salle de préparation pour raser le cou du lapin et du placement du port par voie intraveineuse (IV) dans l’oreille (chirurgie de survie uniquement). Placez la pommade ophtalmique, tondeuses à cheveux, patch de fentanyl (chirurgie de survie), tampon alcoolisé, 24-G x ¾" cathéter, port d’injection et ruban chirurgical sur la table de préparation.
    2. Dans l’OR, mettre en place les équipements de surveillance et d’associés de sondes (électrocardiogramme (ECG), oxymétrie de pouls (SpO2) et la température). Préparer la pompe IV avec une poche de IV 100 mL solution saline avec une aiguille 18 ou 19-G et de régler le débit que 10 mL/h/kg (chirurgie de survie uniquement). Mettre en place l’équipement d’oxygène et isoflurane avec une ogive (veine greffage ou récolte chirurgies).
      1. Pour aider à sécuriser l’ogive au lapin, enroulez une bande de gaze autour du tube qui fournit du gaz à la pointe. Cette boucle doit entourer le tube où il se fixe à la pointe. Les extrémités libres de la bande de gaze devraient tous deux être environ 45 cm de long. Placer l’ogive (avec de la gaze ci-joint) sur la tête de ligne du tableau.
    3. Faire couler l’eau circulante et/ou réchauffement de couverture sur la table d’OR à air pulsé. Sur la couverture de réchauffement de la planète, placez une serviette roulée comme un collier de soutien et placer la plaque électrode de dispersion de bistouri électrique.
    4. Comme un analgésique local, se combinent dans une seringue de 1 mL de chlorhydrate de lidocaïne 2 % et 1 mL de bupivacaïne 0,5 % HCl. diluer le virus de la concentration désirée (ici, utiliser 2 x 1011 particules virales/mL pour HDAd) à DMEM stérile et tient sur la glace (chirurgie de transfert de gène seulement).
    5. Après qu’une profondeur anesthésique adéquate est atteint, préparer le lapin pour la chirurgie.
      Remarque : Vérifier l’absence d’un réflexe de retrait pédale afin d’assurer une profondeur anesthésique adéquate. Continuer à surveiller le réflexe pédale tout au long de la chirurgie.
      1. Appliquer la pommade ophtalmique aux yeux du lapin.
      2. Pour permettre la mise en place d’une sonde de température rectale, presser avec les doigts gantés juste au-dessus du rectum et déplacer les doigts vers l’anus pour enlever stooling de rectum du lapin.
      3. Raser le lapin du cran sternal jusqu’au bord de la mandibule. Raser une oreille pour le placement de l’IV et l’oreille opposée pour l’administration de patch de fentanyl (chirurgie de survie uniquement). Rasez les orteils milieu arrière gauche pour le placement de la sonde de2 SpO.
    6. Pour la chirurgie de vecteur de perfusion, intubation le lapin. Utilisez un 4 mm O.D./3 mm I.D. ballonnet sonde endotrachéale, enfilé sur un arthroscope. Placer le lapin en décubitus sternal et hyper extension du cou. Tenez la bouche du lapin grande ouverte et l’arthroscope permet de visualiser les plis de la glotte et le larynx. Au cours de l’inspiration, insérez doucement la sonde endotrachéale dans le larynx et la trachée.
    7. Pour les chirurgies de la survie, placez et fixez un cathéter IV de 24-G dans la veine d’oreille gauche du lapin et couronner avec un orifice d’injection. Appliquer un patch de 25 µg/h fentanyl à l’oreille droite du lapin.
      Remarque : Le protocole est pour un chirurgien positionné sur le côté droit du lapin. Si le chirurgien sera sur le côté gauche du lapin, inverser les côtés dans cette étape de garder les fils et IV en face du chirurgien. Basculer les côtés dans les prochaines étapes si nécessaire.
    8. Pour les chirurgies de greffage et de récolte de veine, administrer une anesthésie générale avec une ogive ; pour la chirurgie de perfusion de vecteur, administrer une anesthésie générale par une sonde endotrachéale.
      Remarque : L’Intubation peut être utilisée pour toutes les chirurgies.  Dans notre expérience, cependant, les risques de complications de traumatisme trachéal et laryngé pendant l’intubation peuvent emporter sur les avantages de l’intubation.  La chirurgie qui comprend le transfert de gènes à un greffon (particulièrement chez les lapins nourris cholestérol) est la seule chirurgie dans lequel intubation semble apporter un bénéfice net.
    9. Porter le lapin dans l’OR. Placer le lapin dans une position couchée sur la table d’opération avec la serviette de soutien cou placée juste sous la tête du lapin. Doucement s’étendent cou du lapin jusqu'à ce qu’elle est droite et horizontale environ.
    10. Placer l’ogive au lapin (chirurgies de greffage et de récolte de veine) ou connecter la sonde endotrachéale (vecteur perfusion chirurgie) avec O2 à 1 L/min et commencer l’isoflurane. Si vous utilisez une ogive, fixez-le en encapsulant les extrémités des bandes gaze attaché autour de serviette de soutien pour le cou du lapin. Ajuster la concentration de l’isoflurane au besoin (en général 1-2 %) pour maintenir un niveau chirurgical de l’anesthésie.
    11. Centre de la plaque d’électrode de dispersion de bistouri électrique sous DOS du lapin. Introduire la sonde de température rectale et appliquez le SpO2 sonde et fils d’EKG sur le lapin.
    12. Connectez la saline intraveineuse au port cathéter dans l’oreille gauche du lapin et démarrer la pompe à perfusion à 10 mL/h/kg. Après 1 h, réduire le taux de perfusion de solution saline à 5 mL/h/kg.
    13. Attacher lâchement pattes avant du lapin à la table d’opération comme un dispositif de retenue.
      Remarque : Éventuellement, une petite table en plastique peut être placée sur le lapin pour prévenir le chirurgien en appuyant sur thorax/abdomen du lapin, et pouvant causer des aspirations et des reflux gastro-oesophagien.
    14. Injecter par voie sous-cutanée de lidocaïne/bupivacaïne (mélange 50/50, 2 mL, étape 1.2.4) (SQ) dans le cou le long de la ligne d’incision prévue, pour l’anesthésie locale.
    15. Avoir l’assistant désinfecter l’intervention chirurgicale du site avec 3 alternant scrubs de gluconate de chlorhexidine et d’isopropanol, puis vaporiser le site povidone-iode. Avoir le gommage chirurgien, blouse et des gants, suivant les principes aseptiques.
      1. Effectuer des chirurgies de survie dans des conditions aseptiques. Avoir l’assistant gérer tous les éléments non stériles et passer aseptiquement matériel stérile au chirurgien ou aseptiquement, placez-les sur la table de l’instrument drapé.
      2. Avoir les chirurgien usage stérile serviettes aseptiquement manipuler de matériel non stérile comme le microscope. Avoir le chirurgien porter 2 x loupes chirurgicales lors de l’exécution de la première moitié de la chirurgie.

2. veine greffe chirurgie (survie)

  1. Préparer les instruments et le champ stérile.
    1. Ont l’assistant ouvre sacs stériles (un drap de la table, un drap de papier et 6 serviettes) et transférer stérilement le contenu au chirurgien.
    2. Drapé de la table de l’instrument. Placez le drap de papier et serviettes stériles sur la table de l’instrument drapé. Avec 4 serviettes, drapez le lapin, laissant seulement le champ opératoire sur le cou exposé. Posez le drap de papier sur le lapin. Une serviette servira plus tard, et le dernier est une sauvegarde.
    3. Avoir l’assistant ouvrir le pack instrument stérilisé et aseptiquement passer le plateau à instruments au chirurgien. Ranger les instruments sur la table de l’instrument.
    4. Avoir l’assistant ouvrir l’équipement suivant et aseptiquement passez-le au chirurgien ou placez-la sur la table de l’instrument : une seringue de 3 mL, une seringue de 20 mL, une aiguille 21 G, suture de (PGA) l’acide polyglycolique 3-0, une seringue de 1 mL, suture PGA 5-0 , la suture en polypropylène 7-0 et un cathéter IV de 24 G.
    5. Fixer le câble de bistouri électrique à drapé couvrant le lapin, en utilisant une pince Kantrowitz 7.25". Déposer l’autre extrémité du câble sur le bord de la table d’opération pour être raccordé à l’appareil d’électrochirurgie et activée par l’assistant.
    6. Remplissez une seringue de 20 mL avec du sérum physiologique stérile d’une poche de solution saline ou flacon détenues par l’assistant. Utiliser cette solution saline au besoin pour empêcher la déshydratation des tissus exposés lors de l’opération.
    7. Préparer 5 mL de solution saline physiologique héparinée en ajoutant 0,1 mL d’héparine de 5 000 UI/mL à 5 mL de solution saline, i.e., héparine de 100 UI/mL, dans un petit bol chirurgical. Utilisez cette solution pour rincer la prothèse de l’artère et la veine carotide régulièrement au cours de la procédure de greffe.
    8. Découper un trou dans le drap de papier sur le site de la chirurgie sur le cou du lapin. Utiliser les pinces de serviette pour fixer les coins du trou en place pour les serviettes sous-jacent.
  2. Dissection vasculaire
    Remarque : Utilisez 2 loupes chirurgicales x pour faciliter cette partie de la chirurgie.
    1. Couper la peau avec le bistouri électrique le long de la ligne médiane entre l’encoche sternale et de la mandibule (environ 7-9 cm de longueur) et serrer la peau du cou du lapin pour les serviettes avec les pinces de la serviette. À l’extrémité caudale, faites une coupe latérale courte à travers le fascia avec bistouri électrique. Carrément disséquer sous le fascia le long de la ligne entière médiane à l’aide de grands ciseaux. Couper à travers la couche aponévrotique disséquée le long de la ligne médiane avec le bistouri électrique.
    2. Commencer sur le côté droit. Disséquer entre le muscle sternohyoid, recouvrant la trachée et le muscle en forme de V sternocephalic, d’exposer l’artère carotide commune.
    3. Soigneusement disséquer un segment de 4 à 5 centimètres de l’artère carotide commune et ses grosses branches (généralement 1-2 par côté) contre les tissus environnants. Étendre la dissection de la base du cou dans la partie proximale de la traversée du nerf pharyngien distalement. Utilisation les boucles de silicium chirurgicales pour aider à la rétraction de l’artère carotide au cours de la dissection. Ligaturer les grosses branches de l’artère carotide commune avec sutures soie 5-0 avant de couper chaque branche distale.
      Remarque : Veillez à ne pas déranger le nerf vague qui est parallèle à l’artère carotide commune, ou les petits nerfs qui traversent sur l’artère.
    4. Répétez la dissection du côté gauche (étape 2.2.3).
    5. Pince porte-tissu permet de fermer temporairement la couche de tissu sous-cutané. Disséquer le fascia superficiel de la peau sur le côté droit jusqu'à ce que la veine jugulaire externe est exposée. Disséquer un segment de 4 à 5 centimètres de la veine jugulaire externe et sans ses branches des tissus environnants, ligature des petites branches avec sutures soie 5-0 avant de couper la branche.
    6. Répétez la dissection du côté gauche (2.2.5 étape).
    7. Injecter de l’héparine (150 UI/kg) dans le cathéter IV et rincer avec 10 mL de sérum physiologique.
    8. Mesurer un segment de 3 cm de la veine jugulaire externe sur le côté droit et ligaturer l’extrémité caudale du segment avec suture de soie de 5-0. Laissez la veine remplir de sang, puis ligaturer l’extrémité crânienne du segment veine. Diviser l’extrémité crânienne du segment veine jugulaire externe, rincer soigneusement le bateau avec sérum physiologique hépariné (100 U/mL) à l’aide d’une seringue de 3 mL, attachée à un 24-G IV-cathéter. Diviser le segment de veine à son extrémité caudale. Placer le segment de veine dans une position standard, dans laquelle l’extrémité caudale et crâniennes est clairement identifiables.
  3. Greffage de veine
    1. Laissez l’assistant retirer la loupe chirurgicale le chirurgien et déplacez le microscope chirurgical (25 X) en position.
      Remarque : Le chirurgien doit pendre une serviette stérile au microscope. Cela permet au chirurgien de manipuler le microscope tout en conservant la stérilité.
    2. Clamper la carotide commune droite à chaque extrémité du segment isolé avec mini serre-joint, en plaçant la pince crânienne tout d’abord pour permettre l’artère de remplissage, puis placer la pince caudale.
    3. Couper un morceau de cm 1 × 2 de papier rigide (disponible chez emballages stériles pour sutures) et placez-le sous l’artère carotide commune, afin d’améliorer l’exposition.
    4. Effectuer une artériotomie juste crânienne à la pince caudale (l’artériotomie caudal). La longueur de l’artériotomie doit être égale au diamètre de l’extrémité crânienne du segment veine. Insérer la seringue avec le cathéter IV par le biais de l’artériotomie caudale et rincer la lumière de l’artère carotide avec sérum physiologique hépariné.
    5. Suture de l’extrémité crânienne de la veine à l’artériotomie caudale, à l’aide de la suture en polypropylène 7-0 avec des points simples (Figure 1).
      1. Placer le premier point pour l’extrémité caudale de l’artériotomie caudale à l’extrémité crânienne du segment veine de suture. Placer le deuxième point 180° par rapport à la première broderie, à l’extrémité crânienne de l’artériotomie caudale à l’extrémité crânienne du segment veine de suture.
      2. Place le troisième point en un point équidistant des deux premiers points, sur le côté latéral de l’anastomose. Placer le quatrième point sur le côté médial de l’anastomose, équidistant des deux premières mailles et en face de la troisième maille. Placer 4 points supplémentaires (points 5 à 8) entre chacun des points 1 à 4.
      3. Effectuer l’artériotomie crânienne du côté caudal de l’attache crânienne. La distance entre l’extrémité crânienne de l’artériotomie crânienne et l’extrémité caudale de l’artériotomie caudale devrait être identique à la longueur du segment de veine. La longueur de l’artériotomie crânienne est égale au diamètre de l’extrémité caudale du segment veine.
    6. Étendre la veine proche de l’anastomose, il pose sur le dessus de la carotide, sans introduire des rebondissements. Rincer la carotide et la veine avec sérum physiologique hépariné via l’artériotomie crânienne. La solution saline s’écoulera à travers l’artère, dans la veine par l’intermédiaire de l’anastomose caudale et sortira de l’extrémité libre et suture de la veine. Flushing la veine il empêche aussi de tourner.
    7. Suture de l’extrémité caudale de la veine à l’artériotomie crânienne (Figure 1).
      1. Placer un premier point pour l’extrémité caudale de l’artériotomie crânienne à l’extrémité caudale du segment veine de suture. Placer un deuxième point pour l’extrémité crânienne de l’artériotomie crânienne à l’extrémité caudale du segment veine de suture. Compléter l’anastomose comme indiqué au point 2.3.5.2. Juste avant le dernier nœud est lié sur l’anastomose crânienne, brièvement ouvrir la pince sur l’extrémité crânienne du segment artère carotide commune disséqués, afin de permettre le dos-un saignement qui délave les airs dans l’artère carotide et la veine greffé. Puis visser le dernier nœud.
    8. Relâcher la pince crânienne pour permettre de remplissage greffe veineuse avec sang et puis relâcher la pince caudale. Pulsations rapide doivent être considérées dans la greffe de veine. Appliquez une légère pression avec une gaze sèche d’arrêter tout saignement dans les anastomoses.
    9. Ligaturer les deux extrémités du segment de la carotide commune qui relie les anastomoses avec une suture de soie de 3-0 et diviser la carotide à mi-chemin entre les ligatures (Figure 1). Appliquer plusieurs gouttes de la papavérine (3,5 mg/mL) à l’artère carotide adjacent à chaque anastomose.
    10. Injecter l’héparine (75 UI/kg) dans le cathéter oreille IV et rincer avec 10 mL de sérum physiologique. A cette époque, injecter la buprénorphine (SQ, 0,02 mg/kg) pour fournir l’analgésie postopératoire jusqu'à ce que le patch de fentanyl a fourni analgésique concentration plasmatique de fentanyl.
      Remarque : Une injection supplémentaire de buprénorphine (SQ, 0,02 mg/kg) peut être nécessaire 6 h après la première injection à maintenir une analgésie jusqu’au fentanyl plasma atteint une concentration thérapeutique.
    11. Répétez le greffage sur le côté gauche (étapes 2.2.8, 2.3.2-2.3.9).
    12. Fermer le tissu sous-cutané avec suture de PGA de 5-0 à l’aide d’un motif continu. Fermer la peau avec suture de PGA 3-0 à l’aide d’un modèle intradermique. Enterrer les nœuds aux deux extrémités.
  4. Entretien, nettoyage et récupération post-opératoire
    Remarque : Laissez le lapin récupérer de l’anesthésie dans un environnement calme et tranquille. Surveiller le lapin en permanence pour bonne oxygénation et la température corporelle jusqu'à ce qu’elle a entièrement récupéré.
    1. Désactiver l’isoflurane et oxygène et débrancher la machine d’anesthésie du lapin. Débranchez la tubulure de liquide IV du lapin, mais laisser le port IV dans la veine de l’oreille pour accès émergente.
    2. Transporter le lapin à une cage de récupération et placez-le sur le côté. Fournir un soutien thermique avec une eau chaude couverture (ou chauffage à air pulsé). Donner O2 en ogive jusqu'à ce que le SpO2 est stable.
    3. Jusqu'à ce que le lapin peut s’asseoir et se déplacer dans sa cage, mettez le lapin à son autre côté toutes les 15 min. Puis retirer la canule IV d’oreille et revenir le lapin de sa cage. Rendre le lapin à la compagnie d’autres animaux qu’après qu’il est complètement remis de l’anesthésie.
    4. Jeter tous déchets suivant les protocoles appropriés pour biohazard et élimination des déchets tranchants.
    5. Après l’opération, vérifier la santé du lapin et la plaie opératoire chaque jour. Administrer la buprénorphine comme nécessaire pour la douleur non gérée par le patch de fentanyl. Retirer le patch de fentanyl au jour postopératoire 3.

3. transcutanée par ultrasons

  1. Afin d’évaluer la perméabilité de la greffe, effectuer échographie non anesthésiés lapin 5-7 jours après la chirurgie de greffe veineuse et chirurgie de transfert génétique.
    1. Envelopper le lapin non anesthésiés en toute sécurité dans une couverture et placer le lapin en position couchée dans un creux V vétérinaire avec son cou étendu. Raser le cou, ou le cas échéant, enlever les poils avec un produit dépilatoire. Appliquer le gel d’échographie au cou et d’effectuer une échographie.
      Remarque : Une échographie est également effectuée sur des lapins anesthésiés au moment de l’opération de transfert de gène et la chirurgie de récolte de greffon terminal pour examiner la perméabilité du greffon et mesurez le diamètre du greffon lumen. L’examen est effectué juste avant le lavage du cou et s’effectue de la même manière que pour les lapins non anesthésiés.

4. transfert de gènes chirurgie exécutée ~ 28 jours après la pose de prothèse (chirurgie de survie)

  1. Préparer les instruments et le champ stérile.
    1. Suivez les étapes 2.1.1-2.1.3. dans la chirurgie de greffe de veine.
    2. Laissez l’assistant ouvrir l’équipement suivant et soit aseptiquement passez-le au chirurgien ou placez-la sur la table de l’instrument : six seringues de 1 mL (avec aiguille), une seringue de 3 mL, une seringue de 20 mL, une aiguille 21 G, une aiguille 19 G, suture PGA 3-0 , Suture PGA 5-0, 7-0 suture en polypropylène, deux cathéters IV de 24 G et une sonde de débit sanguin stérile.
    3. Suivez les étapes 2.1.5-2.1.6. dans la chirurgie de greffe de veine.
    4. Préparer une seringue de 1 mL avec 1 mL DMEM pour laver le greffon artère et la veine et de préparer deux 1-mL-seringues-solution antivirus (~ 0,5 à 0,7 greffon de solution/veine virus mL). Laissez l’assistant décongeler le virus et le diluer dans DMEM. Préparez une seringue de 3 mL avec 0,5 mL de lidocaïne/bupivacaïne (mélange 50/50, point 1.2.4).
    5. Suivez l’étape 2.1.8 dans la chirurgie de greffe de veine.
  2. Isolement des greffes de veines et les artères carotides adjacentes
    NOTE : 2 x loupes chirurgicales devrait être utilisé pour cette partie.
    1. Couper la peau avec le bistouri électrique le long de la ligne médiane entre l’encoche sternale et de la mandibule (environ 7-9 cm de longueur) et serrer la peau ouverte avec des colliers de serviette. Appliquer 0,5 mL de lidocaïne/bupivacaïne (mélange 50/50, point 1.2.4) pour le tissu sous-cutané.
    2. À l’extrémité caudale, faites une coupe latérale courte à travers le fascia avec bistouri électrique. Carrément disséquer sous le fascia le long de la ligne médiane ensemble. Avec bistouri électrique, couper à travers le fascia disséqué le long de la ligne médiane.
    3. Commencer sur le côté droit. Disséquer entre le muscle sternohyoid qui vient se superposer la trachée et le muscle en forme de V sternocephalic, d’exposer la greffe veineuse. Soigneusement isoler la greffe veineuse et 1,5 à 2,0 cm de l’artère carotide adjacente à la greffe sur les deux faces crâniale et caudales.
    4. Répétez la dissection sur le côté gauche après étape 4.2.3.
  3. Mesurer le flux sanguin dans les veine des greffes.
    1. Remplir la cavité de la plaie opératoire sur le côté droit avec une solution saline normale pour permettre la transmission des ondes sonores. Plonger dans la solution saline dans la cavité de la plaie, d’une sonde de débit de périvasculaires de 2 mm (relié à un compteur de débit-volume) et régler le débit à zéro.
    2. Placez la sonde de flux autour de l’artère carotide caudale ou crânienne à la greffe de veine. Enregistrer des données de la sonde de débit avec un système d’acquisition de données électroniques.
    3. Répétez la mesure du débit sur le côté gauche après étape 4.3.2.
    4. Calculer la pulsatilité basée sur le débit moyen débit systolique de pointe et un débit minimum diastolique. Aussi calculer la contrainte de cisaillement laminaire, basé sur le débit et diamètre du lumen (mesurée par échographie transcutanée).
  4. Infuser le vecteur solution dans les veine des greffes
    Remarque : Un microscope chirurgical (16 X) est utilisé au besoin pour la ponction, infusion et la réparation de l’artère carotide.
    1. Avoir l’assistant supprimer loupes chirurgicales du chirurgien et déplacez-y le microscope chirurgical de position. Avoir le chirurgien pende une serviette stérile au microscope. La serviette stérile permet au chirurgien de manipuler le microscope tout en conservant la stérilité.
    2. Avoir l’assistant injecter l’héparine (150 UI/kg) dans le cathéter IV et rincer avec du sérum physiologique.
    3. Utiliser un pilote de grande aiguille pour plier l’aiguille de 21 G à environ 80°, juste au-dessus du biseau (ne pas plier le biseau ; Figure 2 a).
    4. Clamper la carotide commune à chaque extrémité de la greffe de veine avec mini serre-joint, en plaçant la pince crânienne tout d’abord pour permettre artère de remplissage, puis placer le clip caudal. Place le clip caudal caudale à l’anastomose, environ 10 mm pour laisser une certaine marge pour l’artériotomie.
    5. Mettre deux cravates en soie autour de l’artère caudale juste à la greffe et nouez un nœud unique de chacun - sans les serrer.
    6. Percez la carotide caudale à la prothèse avec l’aiguille 21 G plié juste crânienne du clip vasculaire caudal. Faire attention à ne pas percer les murs arrière ou latérales. Avancer l’aiguille dans la lumière arrière-et-vient deux fois pour que la lumière soit claire, puis soigneusement retirer l’aiguille.
      Notes : Ponction carotidienne commune peut être facilitée en saisissant l’adventice artérielle avec une pince fine et en soulevant doucement la façade tout en insérant la pointe de l’aiguille juste caudale jusqu’au point de levage (Figure 2A). Cela réduit le risque de frapper le mur du fond avec l’aiguille.
    7. Avec plusieurs tampons de gaze non plié, créer un nid pour placer la seringue utilisée pour les infusions. Placez ce nid de gaze caudal au site chirurgical.
    8. Placer un 24 G IV-cathéter sur la seringue avec DMEM-only et serrer le cathéter sur la seringue juste assez pour éviter les fuites (la seringue sera supprimée plus tard dans cette chirurgie) et plier le cathéter ~ 4 mm de l’extrémité pour que le coude est titulaire à environ 75° après qu’il est libéré.
    9. Insérer le cathéter IV dans l’artériotomie carotide commune jusqu’au point de virage et laver le lumen de greffe veine deux fois avec 0,5 mL de DMEM. Pour chaque répétition, remplir la prothèse de veine de DMEM. Supprimez le DMEM de la prothèse en appuyant légèrement avec un doigt ganté à l’extrémité crânienne du greffon. Glisser le doigt vers l’extrémité caudale de la prothèse afin d’éliminer le contenu luminal par l’intermédiaire de l’artériotomie.
    10. Retirer la seringue DMEM du cathéter, laissant le cathéter dans le vaisseau. Connecter la seringue contenant la solution de virus, en s’assurant qu’aucun air ne pénètre dans le cathéter. Déplacer que la soie souplement nouée des liens vers le bas de l’artère jusqu'à ce qu’ils sont autour de l’extrémité du cathéter, mais ne pas serrer les.
    11. Faire infuser 0,03 mL de solution antivirus pour pousser le DMEM restant sur le cathéter. Retirez tous les fluides de la lumière du greffe veine avec un doigt, en appuyant légèrement du crâne à la caudale.
    12. Serrer les deux liens autour de la pointe de l’artère et le cathéter pour sceller la lumière. Faire infuser la solution virus jusqu'à ce que la veine est distendue. Déposer délicatement la seringue sur le nid de gaze.
      Remarque : Il est vital que la greffe de veine se développe pour son calibre de transduction avant et reste gonflée pendant la perfusion de virus. Si ce n’est pas le cas, le montant du transfert de gènes est considérablement réduit.
    13. Laissez la solution contenant le virus dans le lumen de greffe veineuse pendant 20 min et puis remplacer la seringue contenant le virus attachée au cathéter avec une seringue vide. Aspirer doucement la solution contenant le virus de la prothèse jusqu'à ce que le navire s’effondre. Retirer la seringue, en laissant le cathéter en place. Couper et délier les sutures en soie et retirer le cathéter du vaisseau. Retirer le cathéter de l’artère carotide avec précaution pour éviter d’endommager l’endothélium.
    14. Avec l’aide du microscope chirurgical, fermer l’artériotomie avec suture en polypropylène 7-0 à l’aide d’un modèle X (Figure 2B).
      1. Saisir la suture avec un porte-aiguille, entrer dans le bateau en bas à droite de l’artériotomie et quitter le navire en bas à gauche. Traversez l’ouverture à l’extérieur du navire et faire la seconde passe du haut à droite en haut à gauche.
      2. Avant de serrer la suture, brièvement relâcher la pince vasculaire crânienne pour vider l’air et virus résiduel de la greffe de veine et artère. Sang s’écoule de l’artériotomie en relâchant la bride.
      3. Fermer l’artériotomie en tirant doucement sur la suture se termine et les attacher avec 2 noeuds de square.
        Remarque : En tirant la suture trop serré cause regroupement du tissu qui va perturber la circulation, augmenter le risque de thrombose et introduire potentiellement variables incontrôlées.
    15. Relâchez le clip vasculaire crânien, puis le clip caudal. Arrêter tout saignement à l’aide de gaze d’appliquer une légère pression.
    16. À cette époque, injecter la buprénorphine (SQ, 0,02 mg/kg) pour fournir l’analgésie postopératoire jusqu'à ce que le patch de fentanyl a fourni fentanyl analgésique plasmatique.
      Remarque : Une injection supplémentaire de buprénorphine (SQ, 0,02 mg/kg) peut être nécessaire 6 h après la première injection à maintenir une analgésie jusqu’au fentanyl plasma atteint une concentration thérapeutique.
    17. Répétez le protocole de perfusion de virus sur le côté gauche, suivant étapes 4.4.5-4.4.15.
  5. Fermeture de la plaie
    1. Fermer le tissu sous-cutané avec suture de PGA 5-0, à l’aide d’un motif continu. Fermer la peau avec suture de PGA 3-0 à l’aide d’un modèle intradermique. Enterrer les nœuds aux deux extrémités.
  6. Entretien, nettoyage et récupération post-opératoire
    1. Suivez l’étape 2.4.

5. récolte chirurgie (Terminal)

  1. Préparer les instruments et le champ opératoire.
    1. Suivez les étapes 2.1.1-2.1.3 dans la chirurgie de greffe de veine.
    2. Laissez l’assistant ouvrir aseptiquement Placez sur la table de l’instrument (ou passer au chirurgien) : une seringue de 20 mL, une aiguille 21G, suture de soie de 3-0 et une sonde de débit sanguin stérile.
    3. Suivez les étapes 2.1.5-2.1.6 et 2.1.8 veine chirurgie de greffe.
  2. Isolement des artères carotides communes et greffes de veine
    1. Couper la peau avec le bistouri électrique le long de la ligne médiane entre l’encoche sternale et de la mandibule (environ 7-9 cm de longueur) et serrer la peau du cou du lapin pour les serviettes avec serviette pinces.
    2. À l’extrémité caudale, faites une coupe latérale courte à travers le fascia avec bistouri électrique. Carrément disséquer sous le fascia le long de la ligne médiane ensemble. Couper à travers le fascia disséqué le long de la ligne médiane avec le bistouri électrique.
    3. Commencer sur le côté droit. Disséquer entre le muscle sternohyoid, recouvrant la trachée et les muscles en forme de V sternocephalic d’exposer le greffon carotide et la veine commun.
    4. Disséquer le greffon de la veine droite et artère carotide commune libre les tissus environnants. Utilisez des boucles chirurgicale de silicium pour la rétraction de l’artère et la veine greffe au cours de la dissection.
    5. Répétez la dissection du côté gauche suite à des mesures 5.2.3-5.2.4.
  3. Effectuer des mesures de débit suivant étapes 4.3.1-4.3.3 dans la chirurgie de transfert de gène.
  4. Récolte des greffons veine
    1. Avec suture de soie de 3-0, ligaturer l’artère carotide commune droite crânienne à la greffe. Puis ligaturer la carotide caudale à la greffe.
    2. Excise la greffe veine droite en divisant la carotide adjacente entre chacun des ligature des trompes et l’anastomose adjacent. Retirer le lapin de la greffe de veine et rincer la lumière avec une solution saline.
    3. Couper la carotide et les anastomoses des deux extrémités de la greffe de veine. Tailler loin excès de tissu adventitiels de la greffe de veine et couper le greffon en segments comme requis pour les analyses de point de terminaison différent.
    4. Récolter le greffon de la veine gauche en répétant les étapes 5.4.1-5.4.3.
  5. Injecter 1 mL de phénytoïne/pentobarbital IV à euthanasier le lapin.
  6. Jeter tous déchets suivant les protocoles appropriés pour biohazard et élimination des déchets tranchants.

Résultats

La compétence technique d’un nouvel opérateur doit être validée avant que l’opérateur peut utiliser cette méthode pour générer des données expérimentales. La première étape qui doit parvenir à un nouvel opérateur est perméabilité greffe veineuse cohérent après la chirurgie initiale de veine-greffe tant la chirurgie ultérieure de retard-transduction. Perméabilité plus de 90 % après chacun des cabinets de consultation est souhaitable et réalisable. La perméabilit...

Discussion

Des étapes cruciales dans le présent protocole comprennent la gestion de l’anesthésie, anticoagulation manipulation chirurgicale de la veine artère/greffés et mesures hémodynamiques de la veine greffée. Une bonne gestion de l’anesthésie est essentielle dans ce modèle de survie chirurgie multiple qui comprend deux opérations relativement longues (généralement de 3 à 3,5 h pour greffe veineuse bilatérale et 1,5 à 2,5 h de transduction greffe bilatérale). Nous avons administré de l’anesthésie par l?...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Disposables
3mL syringe with 24G needleBecton Dickinson3095712x for vein graft surgery; 2x for gene transfer  surgery
1 mL syringe with 27G needleBecton Dickinson3096232x for vein graft surgery, 5x for gene transfer surgery
19G needleBecton Dickinson305187Gene transfer surgery
20 mL syringe, luer lockNipro Medical CorpJD+20L
Catheters, 24Ga x 3/4”Terumo Medical ProductsSROX2419V
21G needleBecton Dickinson305165Gene transfer surgery and for 20 mL syringe of saline
Gauze 4” x 4”Dynarex3242~10-15 per surgery
3-0 silk sutureCovidien Ltd.S-244
5-0 silk sutureCovidien Ltd.S-182
7-0 polypropylene sutureCP Medical8703PVein graft surgery
7-0 polypropylene sutureCP Medical8648PGene transfer surgery
5-0 polyglycolic acid sutureCP Medical421A
3-0 polyglycolic acid sutureCP Medical398A
Alcohol swabsCovidien Ltd.6818For the placement of I.V. line
Catheter plugVetoquinol411498
Ketamine HCl, 100 mg/mLVedco Inc.5098916106
Xylazine, 100 mg/mLAkorn Inc.4821
Lidocaine, 20 mg/mLPfizer409427702
Marcaine 0.5%Pfizer409161050
Beuthanasia D-SpecialIntervet Inc.NDC 00061047305Harvest surgery only
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mLPatterson Veterinary12496075705
Saline IV bag, 0.9% sodium chlorideBaxter2B1309
Heparin  (5000 U/mL)APP PharmaceuticalsNDC 63323-047-10
Papaverine (3.5 mg/ml)American Reagent Inc.NDC 0517-4002-25Diluted from 30mg/mL stock; Use 1 mL maximum
Fentanyl patch, 25 mcg/hApotex Corp.NDC 60505-7006-2
IsofluraneMultiple vendorsCatalog number not available
 Viral vectorGene transfer surgery only
Surgical Instruments
Metzenbaum needle holder 7" straightRobozRS-7900
Operating scissors 6.5" straight blunt/bluntRobozRS-6828
Needle holder /w suture scissorsMiltex8-14-IMC
Castroviejo scissorsRobozRS-5658
Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lockRobozRS-6412
Stevens scissors 4.25" curved blunt/bluntRobozRS-5943
Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongsRobozRS-65142x
Backhaus towel clamp 3.5"Roboz4x
Micro clip setting forceps 4.75"RobozRS-6496
Micro vascular clips, 11 mmRoboz
Surg-I-LoopScanlan International1001-81M5 cm length
Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip widthRobozRS-5210
Dumont #3 forceps Inox tip size .17 × .10 mmRobozRS-5042
Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8 mm tipRobozRS-5280
Halstead mosquito forceps,  5" straight, 1.3 mm tipsRobozRS-71102x
Halstead mosquito forceps,  5" curved, 1.3mm tipsRobozRS-7111
Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tipsRobozRS-7117
Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tipsRobozRS-7305
Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip widthRobozRS-8162
Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip widthFine Science Tools11092-122x
Adson forceps, 12 cm, serrated, straightFine Science Tools11006-12
Veterinary electrosurgery handpiece and electrodeMACAN ManufacturingHPAC-1; R-F11
Surgical Suite Equipment
Circulating warm water blanket and pumpMultiple vendorsCatalog number not available
Bair hugger warming unit3MModel 505
IV infusion pumpHeskaVet IV 2.2
Isoflurane vaporizer and scavengerMultiple vendorsCatalog number not available
Veterinary multi-parameter monitorSurgivetSurgivet Advisor
Veterinary electrosurgery unitMACAN ManufacturingMV-9
Surgical microscopeD.F. VasconcellosM90025X magnification for vein graft surgery; 16X magnification for gene transfer surgery

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