Probenahmestrategien und Verarbeitung der Biobank Gewebeproben von porcinen biomedizinische Modelle

Zusammenfassung

Die praktische Anwendung und Leistung der Methoden für die Generation von repräsentativen Gewebeproben von porcinen Tiermodellen für ein breites Spektrum an nachgeschalteten Analysen in Biobank Projekte gezeigt, darunter Volumetrie, systematische Stichproben und differenzierte Aufbereitung von Gewebeproben für qualitative und quantitative morphologische und molekulare Analysen Arten.

Zusammenfassung

In der translationalen medizinischen Forschung haben Schweine Modelle stetig populärer geworden. In Anbetracht des hohen Wertes der einzelnen Tiere, besonders der gentechnisch veränderten Schwein, Modelle und oft zeitlich begrenzte Anzahl der verfügbaren Tiere dieser Modelle, Einrichtung (Biobank) Sammlungen von adäquat verarbeiteten Gewebeproben eignet sich für eine breites Spektrum an nachfolgende Analysemethoden, einschließlich nicht angegebene zum Zeitpunkt der Probenahme, Analysen stellen sinnvolle Ansätze für die translationale Wert des Modells voll nutzen. Im Hinblick auf die Besonderheiten des porcinen Anatomie wurden umfassende Richtlinien für standardisierte Generation Vertreter, qualitativ hochwertige Proben aus verschiedenen porcinen Organen und Geweben vor kurzem eingerichtet. Diese Richtlinien sind wesentliche Voraussetzungen für die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse und ihre Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Studien und Ermittler. Die Aufzeichnung der Grunddaten wie Orgel Gewichte und Volumina, die Bestimmung der Probenahme Standorte und der Anzahl der Gewebeproben erzeugt werden, sowie Ausrichtung, Größe, Verarbeitung und trimmen Richtungen sind relevante Faktoren Bestimmung der Generalizability und Nutzbarkeit der Probe zur molekularen, qualitative und quantitative morphologische Analysen. Hier ist eine anschauliche, praktische, schrittweise Demonstration der wichtigsten Techniken zur Erzeugung von Vertreter, Mehrzweck-Biobank Exemplar von porcinen Gewebe präsentiert. Die hier beschriebenen Methoden umfassen Bestimmung der Organgewebe/Volumen und Dichte, die Anwendung eines volumengewichteten systematische Stichproben für parenchymatösen Organen durch Punkt zählen, Bestimmung des Ausmaßes der Schrumpfung des Gewebes im Zusammenhang mit histologische Einbettung der Proben und Generierung von zufällig orientierte Proben für quantitative stereologischen Analysen, z. B. isotrop einheitliche zufällige (IUR) Abschnitte erzeugt durch die "Orientator" und "Isector" Methoden und vertikale uniform zufällige (VUR) Abschnitte.

Einleitung

In der translationalen Medizin, Schweine sind immer häufiger für den Einsatz als großes Tier^1,2,3,4,5, wegen mehrere vorteilhafte Ähnlichkeiten zwischen den Schweinen Modelle und menschliche Anatomie und Physiologie und die Verfügbarkeit von etablierten molekularbiologischen Methoden ermöglichen Generation zugeschnitten, gentechnisch veränderte Schweine-Modelle für ein breites Spektrum von Krankheiten Bedingungen^1,4.

Jedoch beschränkt sich im Vergleich zu Nager-Modelle, die Zahl der Tiere eines jeweiligen Schwein-Modells, das für Experimente jederzeit zur Verfügung gestellt werden können. Dies liegt an den Schweinen Generierungsintervall von ca. einem Jahr und den finanziellen und zeitintensiven Aufwand für die Erzeugung von porcinen Modelle und Tierhaltung. Daher sind einzelne Tiere von porcinen Modell sowie die Proben, die von diesen Schweinen generiert werden können sehr wertvoll, vor allem, wenn gentechnisch veränderte Schweine Modelle und/oder langfristige experimentelle Probleme (z.B., Spätfolgen der chronische Krankheiten) sind Personen im Alter von^2,6,7untersucht.

Im Rahmen einer Studie Leistung weitere Analysen, die nicht in der ersten experimentellen Design der Studie geplant hatte vielleicht später erweisen sich als relevant, z.B.Adresse, verschiedene Fragen, die bisher entdeckt, unerwartete Ergebnisse. Wenn geeignete Beispiele für solche zusätzliche Experimente nicht verfügbar sind, möglicherweise unverhältnismäßig hohe Kosten und zeitintensive Ausgaben erzeugen zusätzliche Schweine und Gewebeproben erforderlich. Um für solche Eventualitäten vorbereitet zu sein, gilt Generation der Biobank Sammlungen von konservierten Back-up Proben von verschiedenen Organen, Geweben oder Bio-Flüssigkeiten, quantitativ und qualitativ geeignet für ein breites Spektrum der nachfolgenden Analysen, eine wichtige Ansatz^2,6,7. Porcines Tiermodell optimale Vorteile ableiten, die Verfügbarkeit von angemessenen Biobank Proben auch bietet die einmalige Möglichkeit zum Ausführen eines breiten Spektrums an verschiedenen Analysemethoden für identische Probematerialien auf einer Multi-Organ-Ebene in der gleichen einzelne Tiere, z. B.durch Verteilung der Proben an Wissenschaftler der verschiedenen Arbeitsgruppen organisiert in einem Forschung Netzwerk^2,6,7. Darüber hinaus trägt die '' vorausschauende '' Probenahmestrategie in Biobanking auch zu einer Verringerung der Anzahl der Tiere in einer Studie erforderlich. Die Vorteile von porcinen Modell Biobanking wurden vor kurzem in einem Multi-Organ, Multiomics Studie, Orgel nachgewiesen Übersprechen in einem genetisch veränderten porcinen Modell des langfristigen Diabetes Mellitus, mit Proben aus München MIDY Schwein Biobank ².

Es gibt einige Anforderungen, die Biobank Proben in der Regel einhalten müssen, um die Zuverlässigkeit und die Interpretierbarkeit der Ergebnisse der anschließend durchgeführten Analysen zu etablieren. Die Proben reproduzierbar erzeugt werden müssen, und sie müssen repräsentativ, d.h.angemessen reflektiert interessierte morphologischen und molekularen Eigenschaften des Gewebes/Organs die Proben^{7 entnommen wurden}. Geeignet für eine Vielzahl von nachgelagerten Analysetypen werden muss die Proben in ausreichenden Mengen genommen und entsprechend den Anforderungen (einschließlich Zeit und Temperatur) der verschiedenen analytischen Methoden, einschließlich beschreibende verarbeitet werden histopathologische Untersuchungen, wie Cryohistology, Paraffin und Kunststoff Histologie, Immunhistochemie, in Situ Hybridisierung, Ultrastrukturforschung Elektron mikroskopische Analysen und klinische diagnostische Laboranalysen, sowie molekulare Analyse von DNA, RNA, Proteinen und Metaboliten.

Um die Bewertung einer Vielzahl deutliche quantitative morphologische Parameter wie Zahlen, Mengen, Längen oder Flächen unterschiedliche Gewebestrukturen durch quantitative stereologischen Analysen ermöglichen, randomisierte Abschnitt Flugzeuge von der histologische Proben der jeweiligen Organe/Gewebe^7,8,9,10,11vorbereitet werden müssen. In quantitativen morphologische Studien, die präzise Bestimmung des Gesamtvolumens der Gewebe, Organ oder Fach Orgel, die Proben entnommen wurden (d. h., die Referenz-Raum) ist von entscheidender Bedeutung^{7,9 , 12} die absoluten Mengen der interessierten Parameter innerhalb der jeweiligen Organ, Gewebe oder Organismus zu berechnen. Schließlich wirkt Einbettung bezogene Gewebe schrumpfen während der Vorbereitung der histologischen Abschnitte bestimmt und Konto¹³berücksichtigt werden. Daher sind quantitative stereologischen Analysen, vor allem der archivierten Proben (feste Gewebeproben, eingebettete Gewebe Blöcke, histologische Abschnitte, etc.) aus früheren Studien manchmal stark eingeschränkt oder sogar unmöglich¹², besonders wenn Volumetrie der jeweiligen Organe/Gewebe nicht durchgeführt wurde, wenn keine angemessene Stichproben Designs angewendet wurden, um repräsentative Proben zu rechtfertigen, wenn die Zahlen und Mengen zur Verfügung einzelner Samples nicht ausreichen, oder wenn die Verarbeitung der Proben ist unvereinbar mit der Schätzung des quantitativen morphologische Parameter von Interesse. Aufgrund der vielfältigen möglichen Einflussfaktoren die Eignung der Archiv-Mustermaterialien für Analysen deutliche quantitative morphologische Parameter kann nicht eindeutig beantwortet werden, aber die sorgfältige Beurteilung des Einzelfalls abhängig.

So wie die Lage, Größe, Anzahl, Verarbeitung, trimmen Richtung und Ausrichtung der Proben die Ergebnisse der nachfolgenden Analysen betreffen werden, diese Faktoren sind von großer Bedeutung und müssen in den Versuchsplan Studie betrachtet werden. Im Hinblick auf diese Aspekte und Besonderheiten der porcinen Anatomie, umfassende, detaillierte und umfangreiche Sampling-Richtlinien angepasst porcinen Tiermodelle vor kurzem eingerichtet wurden, bieten einen robuste Verweis auf standardisierte, reproduzierbare , und effiziente Erzeugung von redundanten, adäquat verarbeitet, hochwertige Proben aus mehr als 50 verschiedene porcinen Organen und Geweben^6,7.

Die methodischen Beschreibungen und das video-Tutorial gezeigt in diesem Artikel bieten detaillierte, anschauliche, verständliche, Schritt-für-Schritt-Anleitungen für praktische Leistung eine Vielzahl von Techniken für die Volumetrie, Beprobung von porcinen Gewebe und Organe und Verarbeitung von Gewebeproben nach verschiedenen nachgeschalteten Analysemethoden. Die vorgestellten Techniken gehören Methoden zur Bestimmung von Organgewebe/Volumen und Dichte basierend auf den Prinzipien von Archimedes und Cavalieri⁹, einschließlich der Bestimmung der Abmessungen der dreidimensionalen Schrumpfung des Gewebes im Zusammenhang mit der Einbettung in verschiedenen Einbetten von Medien¹⁴ während der Verarbeitung für histologische Untersuchung, Anwendung von praktikablen volumengewichteten systematische Stichproben nähert, Verarbeitung von gesampelten Gewebemustern für verschiedene spätere Analysen^7,8,9,15und Generation entsprechend orientiert und Beispiele für mögliche quantitative stereologischen Analysen^{7,8verarbeitet, 9,10,11}. Neben ihrer Anwendung in porcinen Biobank Projekte eignen sich die Methoden in der Regel für alle Studien, die quantitative Histo-morphologische Eigenschaften der Organe/Gewebe. Darüber hinaus sind systematische Stichproben Entwürfe besonders vorteilhaft für die Erzeugung von repräsentativen Proben bei Experimenten mit molekulare Analysemethoden Fülle Änderungen, z. B., RNAs, Proteine oder Metaboliten in erkennen verschiedenen Organen und Geweben.

Die nächsten Absätze geben eine kurze Einführung in diese Methoden während ihrer praktischen Leistung im Abschnitt Protokoll beschrieben wird.

Bestimmung der Organgewebe/Volumen
Bestimmung der Orgel Gewichte und Volumina ist wichtig in mehrere experimentelle Einstellungen, wie diese Faktoren könnte darauf hindeuten Änderungen, die möglicherweise im Zusammenhang mit experimentell untersucht Faktoren von Interesse. Das Gesamtvolumen der ein Organ/Gewebe ist häufig auch erforderlich, um absolute quantitative Parameter (z.B., die gesamte Zellzahl), von stereologically geschätzten numerische Volumen Dichte (d. h., die Anzahl der Zellen pro Volumeneinheit zu berechnen des Gewebes)^7,12. Neben Techniken mit komplexen technischen Ausstattung, wie die Computertomographie gibt es grundsätzlich drei praktische Methoden häufig verwendet, um das absolute Volumen eines Organs oder Gewebes bestimmen. Das Volumen eines Organs kann durch "direkte volumetrische Messung", nach dem Prinzip des Archimedes, d. h., Messung des Volumens von Wasser oder Kochsalzlösung verdrängt durch die Struktur als völlig untergetaucht ermittelt werden. Sind jedoch vergleichsweise große Schweine Organe, diese Ansätze unpraktisch und fehleranfällig Ungenauigkeit, da sie sehr große volumetrische/Messung Flaschen erfordern. Bequemer, kann die Lautstärke von einem Organ/Gewebe aus Gewicht und Dichte^7,12,16, berechnet die effizient ermittelt werden können, mit dem "eintauchen-Methode"^{7,12 ,16} (Protokoll Schritt 1.1.). Organgewebe/Mengen können auch mit Volumetrie Konzepte basieren auf dem "Prinzip von Cavalieri" (1598 – 1647) geschätzt werden. In einfachen Worten das Prinzip von Cavalieri heißt es, wenn zwei Objekte in Ebenen parallel zu einer Grundebene geschnitten sind, und die Profile der Abschnitte durch die beiden Objekte an entsprechenden geschnitten Entfernungen von der Bodenebene haben die gleichen Bereiche, die zwei Objekte haben Sie das gleiche Volumen. So kann das Volumen der beliebig geformte Objekte als das Produkt der ihre Profilbereiche der Abschnitt in parallel, gleich weit entfernt Schnittebenen und der Abstand zwischen der Schnittebenen geschätzt werden. Dies ist verständlich mit die folgende Analogie: betrachten zwei Stapel, bestehend aus der gleichen Anzahl von identischen Münzen sind nebeneinander, einen Stapel mit den Münzen ordentlich übereinander nachgeben eine zylindrische Form des Stapels Münze, und die andere Stapel von Münzen mit außermittig positioniert Münzen (Abb. 3A). Die Formen der beiden Münze-Stacks sind, zwar unterschiedlich deren Volumen sind die gleichen, da die Bereiche der Münzen auf entsprechenden Ebenen der beiden Stapel (d.h., die Bereiche von Profilen von parallelen Abschnitten durchschneiden beide Münze-Stacks in gleichen Abständen von der den Boden) sind identisch. Schätzung der Mengen an Schweinen Organen und Geweben mit Cavalieri Prinzip^7,12,15 ist in Schritt 1.2 beschrieben.

Bestimmung des Ausmaßes der Gewebe Schrumpfung im Zusammenhang mit histologische Einbettung
In den Analysen über mehrere quantitative morphologischen Parametern gemessen in histologische Gewebeschnitte wirkt Einbettung bezogene Gewebe Schrumpfung während der Verarbeitung für Histologie Gewebe ermittelt und berücksichtigt werden. Das Ausmaß der Einbettung im Zusammenhang mit Gewebe schrumpfen kann variabel sein und richtet sich sowohl auf das Gewebe, dessen Verarbeitung und Einbetten von mittleren^{8,13,17,18,19}. Im Allgemeinen auftreten Einbettung im Zusammenhang mit Änderungen des Volumens der eine Gewebeprobe (d. h.vor allem Schrumpfung) in allen drei Dimensionen von Raum und daher, wirkt sich auf alle Maßparameter durch quantitative stereologischen Analysen^{8 geschätzt} . Grundsätzlich kann das Ausmaß der Einbettung im Zusammenhang mit Gewebe schrumpfen, ausgedrückt als die lineare Gewebe Schrumpfungsfaktor (f_S), geschätzt werden, wie in Schritt 1.3 gezeigt. und für die Korrektur (Schrumpf-Sensitive) quantitative morphologische Parameter¹⁴verwendet.

Volumengewichteten systematische Stichproben der Organe/Gewebe
Für die Einrichtung einer Biobank-Sammlung von porcinen Orgel/Gewebeproben erwiesen volumengewichteten systematische Stichproben Ansätze wie in Schritt 2 beschriebenen sich praktische, zeitsparende und effiziente Techniken für Generation des Vertreters, Mehrzweck-Gewebe Proben^7,8,9,15.

Generation von isotropen einheitliche zufälligen Abschnitten und vertikale einheitliche zufällige für quantitative stereologischen Analysen
Biobank Gewebeproben müssen für eine Vielzahl von verschiedenen stereologischen quantitative Analysemethoden für die Schätzung von maximal Parameter geeignet, die nicht ohne einen entsprechend vorbereiteten Probe ermittelt werden konnte. Fast alle quantitativen stereologischen Parameter können bestimmt werden, mit "isotrop (parteilos) einheitliche zufällige (IUR) Abschnitte"^8,9. In IUR Abschnitten ist die dreidimensionale Ausrichtung der Schnittebene von der Gewebeprobe randomisiert. Kann dies durch Randomisierung der Position der Gewebeprobe relativ zur Position der Schnittebene, wie in der "Isector" Methode¹¹ (Protokoll Schritt 3.1) oder durch Randomisierung der Ausrichtung der Schnittebene bezogen auf die Gewebeprobe, wie in der "Orientator" Methode¹⁰ (Protokoll Schritt 3.2). In Gewebeproben, wie Haut oder Schleimhaut Exemplar zeigt eine natürlicherweise, oder definierte und einwandfrei identifizierbare vertikale Achse, Vorbereitung der "einheitlichen zufällige (VUR) Vertikalschnitten" (Protokoll Schritt 3.3.) streng geschnittene innerhalb der Ebene von ihren vertikale Achse ist vorteilhaft^8,20. Für eine vollständige Diskurs der die theoretischen Grundlagen der IUR/VUR Probenahme und eine umfassende Diskussion über nachgeschaltete quantitative stereologischen Potenzialanalysen wird der interessierte Leser zu den Lehrbüchern der quantitativen Stereologie im Leben bezeichnet. Wissenschaften^8,9.

Protokoll

Alle beschriebene Methoden verwenden hier Gewebeproben von toten Tieren stammen und uneingeschränkt mit den deutschen gesetzlichen Bestimmungen des Tierschutzes.

(1) Volumetrie

1. Untertauchen Technik zur Bestimmung der Dichte Gewebe/Organ (Abbildung 1 und Abbildung 2) ^{7 , 12 , 16}
   1. Bereiten Sie Materialien: Skalpell Klingen, Papierhandtücher, feine Pinzette, standard-Labor-Waagen, Glas oder Plastikbecher, 0,9 % Kochsalzlösung und selbstgebauten Probenhalter (Abbildung 2A).
   2. Schneiden Sie ein Stück des Gewebes (maximale Größe: 2 x 2 x 2 cm³) aus dem Organ/Gewebe, speziell aus dem Orgel-Fach von Interesse. Kleinen Organe, wie die Hypophyse und die Zirbeldrüse sind gemessene Versicherungsjahren.
      Achtung: Sicherstellen Sie, dass die Größe der Stichprobe vor allem kleiner ist als der Innendurchmesser des Bechers (Schritt 1.1.5 ff.) und seine Füllhöhe komplett eintauchen der Probe zu ermöglichen, ohne Kontakt mit den inneren Wänden des Bechers in Schritt 1.1.7.
   3. Wischen Sie sorgfältig die Probe mit einem Papiertuch entfernen überschüssiges Blut/Gewebeflüssigkeit.
   4. Wägen Sie die Probe auf eine Präzisionswaage und nehmen Sie das Gewicht der Probe (m_S). Bestimmen Sie das Gewicht der kleine Gewebeproben, die nächste mg (Abbildung 1A).
   5. Ein Becherglas gefüllt mit Raumtemperatur 0,9 % Kochsalzlösung auf die Waage. Nicht füllen Sie vollständig die Becher, um eine Überflutung der Gewebeprobe im anschließenden Schritt ohne überlaufen zu ermöglichen.
      Achtung: Verwenden Sie eine Becher Größe angebracht, die Größe und Gewicht der Gewebe Proben gemessen werden und der effektiven Messbereich der Skala. Für größere Probenmengen bis zu 2 x 2 x 2 cm-³, eine Becher-Größe von 50 – 100 mL eignet sich in Kombination mit einem Maßstab von etwa 100 mg messen, bis 500 g, während für kleine Proben verwenden Becher von 5 – 10 mL Volumen in Kombination mit Präzision Skalen mit Messbereiche von ca. 0,1 mg bis 20 g.
   6. Tauchen Sie die Probenhalter (d. h., eine steif genug Schleife von dünnen Draht oder etwas ähnliches, Abbildung 2A) in den Salinen zu einer markierten Stelle (Pfeile in Abb. 1 b, 2 bund Abbildung 2). Dann (Tara) die Anzeige der Waage auf Null zurückgesetzt.
   7. Befestigen Sie vorsichtig die Gewebeprobe, die Probenhalter und völlig Eintauchen der Probe in den Salinen, bis die markierte Position auf dem Probenhalter (Pfeile in Abb. 1 b, 2 bund Abbildung 2) erreicht ist.
      Achtung: Die getauchten Probe und der Probenhalter müssen Kontakt mit der inneren Wände oder den Boden des Bechers oder die Oberfläche der Salinen nicht haben.
   8. Der Probenhalter und der getauchten Probe in dieser Position halten, erfassen die Gewichtsanzeige auf der Skala (m_L), bezogen auf das Gewicht der Kochsalzlösung durch die Gewebeprobe vertrieben wurden (Abbildung 1 C, 2 b, und Abbildung 2).
   9. Berechnen Sie das Volumen der Probe (V_S) von m_Lund die Dichte der Kochsalzlösung bei Raumtemperatur (20 ° C) (ρ_saline = 1,0048 g/cm ³) als V_S m_L= / Ρ_saline [g/g/cm ³] (Abbildung 1).
   10. Berechnen Sie die Dichte der Gewebeprobe (ρ_Probe) vom Gewicht (d.h., Masse) der Probe (m_S) und seinem Volumen (V_S): ρ_Probe = m_S /V_S[g/cm ³] (Abbildung 1).
   11. Wiederholen Sie für Organe gemessen in totodie Messung dreimal und berechnen Sie die durchschnittliche Orgel Dichte aus den einzelnen Messwerten. Führen Sie für große Organe/Gewebe wiederholte Messungen mit verschiedenen Proben des gleichen Organ/Gewebe/Organ-Fachs, und berechnen Sie die durchschnittliche Dichte von Einzelmessungen, entsprechend.
   12. Berechnen Sie das Gesamtvolumen des Fachs Organ/Gewebe/Organ von seinem Gewicht und Dichte (Abbildung 1).
2. Anwendung des Cavalieri-Methode zur Bestimmung des porcinen Orgel Bände ⁷
   1. Bereiten Sie Materialien: Lineal, Bremssattel, Messer, Scheren, Pinzetten, wasserfesten Stift, Kunststoff-Folien, Scanner, Foto-Kamera und Kreuz Gitter auf Kunststoff-Folien gedruckt.
   2. Legen Sie das gesamte Organ/Gewebe auf eine glatte Oberfläche (schneiden Base) und Messen Sie die Länge (l) der Orgel entlang seiner Längsachse (Abb. 3 b, Abb. 5A).
   3. Schneiden Sie die komplette Organgewebe in äquidistanten parallele Scheiben orthogonal zur längs-Orgel Achse (Abbildung 3, Abbildung 5 b). Wählen Sie eine Distanz d zwischen zwei Abschnitten (d.h. die Stationspunkte Intervall/Schnittdicke, in der Regel ca. 1 cm) klein genug, um eine ausreichende Anzahl von Gewebe/Organ Platten zu erhalten. Nach dem Zufallsprinzip positionieren des ersten Abschnitts innerhalb einer Entfernung zwischen 0 und strukturierendes Abstand vom Rand der Orgel. Beurteilen Sie beim Schneiden visuell die Position und Ausrichtung der einzelnen Schnittebene, etwa parallel Organgewebe Platten von etwa gleichmäßiger Dicke zu erhalten.
      Hinweis: Die erforderliche Anzahl von Gewebe/Organ Platten richtet sich nach der Form und der Größe der untersuchten Organ/Gewebe. Wenn kleine Organe oder Proben in dünne Platten von ≤5 mm geschnitten werden müssen, die Proben in Agar vor dem Schneiden einbetten (siehe Punkt 1.3.3.) und ein technisches Gerät zum Schneiden der Agar eingebettete Probe verwenden. Empirisch empfehlenswert Stationspunkte Intervalle für die meisten Schweine Organe und Gewebe, sowie Beispiele für slicing-Geräte sind in das ergänzende Material der "Sampling Guides für Schweine biomedizinische Gewebemodelle"⁷angegeben.
   4. Legen Sie alle Organgewebe/Platten auf der gleichen Fläche nach unten auf die schneiden-Basis (d. h., konsequent auf entweder der rechten oder der linken Schnittebene von jeder Orgel Platte, Abbildung 3D, Abbildung 5) und zählen Sie die Platten (n).
   5. Erhalten Sie Schnittprofile der Gewebe-Platten, indem eine der folgenden Vorgehensweisen:
      1. Legen Sie vorsichtig die Gewebe-Platten auf entsprechend gekennzeichneten Kunststoff-Folien, unter Beibehaltung der Ausrichtung ihrer oberen und unteren Abschnitt Oberflächen. Zeichnen Sie die Umrisse der Gewebe-Platten auf den Kunststoff Folien mit einem wasserfesten Stift (Abbildung 3E1-2).
      2. Nehmen Sie fotografische Bilder von Gewebe-Platten, halten Sie die Kamera senkrecht über den Abschnitt Oberflächen (Abbildung 3F). Legen Sie für die Kalibrierung eine Größe Lineal neben den Gewebe-Platten.
      3. Scannen Sie die Gewebe-Platten auf einen Flachbett-Scanner, unter Beibehaltung der Ausrichtung ihrer oberen und unteren Abschnitt Oberflächen (Abbildung 3). Legen Sie für die Kalibrierung eine Größe Lineal neben den Gewebe-Platten.
   6. Messen Sie die Bereiche der Profile (vektorisierte, fotografierte oder gescannten) Abschnitt alle Gewebe-Platten durch eine der folgenden Vorgehensweisen:
      1. Überlagern Sie oder überlagern Sie die vektorisierte Orgel Platte Profile mit einem entsprechend dimensionierte, kalibrierten Raster gleichmäßig verteilte Kreuze auf einen Kunststoff Transparenz und zählen alle Kreuze schlagen den Profilbereich (Abbildung 3E3-4; im Vergleich zu gedruckt Abbildung 5). Berechnen Sie die Abschnitt Profil Fläche von jeder Orgel-Platte durch Multiplikation der Anzahl der Kreuze schlagen den Profilbereich durch die Fläche, die ein Kreuz entspricht.
         Hinweis: Schätzungen um präzise genug Volumen zu erhalten, wählen Sie ein Kreuzraster mit einer ausreichend geringen Abstand zwischen angrenzenden Kreuze, damit ein Durchschnitt von mindestens 100 kreuzt trifft die Abschnitt Oberflächen der Platten ein Organ in jedem untersuchten Fall der Studie . Empirisch empfehlenswert Kreuzraster Größen für die meisten Schweine Organe und Gewebe sind in das ergänzende Material der "Sampling Guides für Schweine biomedizinische Gewebemodelle"⁷angegeben.
      2. Messen Sie die Bereiche der Gewebe-Platten in den digitalen Bildern der Fotos/Scans mit geeigneten handelsüblichen oder Freeware Morphometrie Soft- und Hardware-Applikationen (Abbildung 3 H), z. B. eine kommerzielle Bild Analyse System²¹, oder ImageJ²².
         Achtung: Beachten Sie, dass man Gewebe Platte (entweder der erste oder der letzte) befindet sich auf dem Scanner bzw. auf seine natürliche Oberfläche, ruht, steht vor der Kamera mit seiner natürlichen Oberfläche. Daher das gescannte Bild, das Foto von dieser Platte, wird eine Abschnitt Oberfläche nicht angezeigt. Daher ist kein Abschnitt Bereich Profil im gescannten Bild/Foto Bild von diesem Gewebe-Platte (Abbildung 3I) gemessen. Auch Anmerkung über Projektion präsentieren in gescannte Bilder und Fotos von Organgewebe/Platten, d. h., messen nur die Bereiche der tatsächlichen Abschnitt Profile, aber nicht des Gewebes im Bild liegende Abschnitt Plattenoberfläche (Abbildung 12 G-H).
   7. Berechnen Sie das Volumen der geschätzten Orgel als Produkt aus der Summe aller entsprechenden Abschnitt Profil Flächen alle Gewebe-Platten pro Fall (d.h., konsequent von rechts oder links, bzw. die oberen oder unteren Abschnitt Oberfläche von jedem Organ Platte und die durchschnittliche Dicke der Platten (d.h. der Quotient aus der gemessenen Länge der vertikalen Orgel-Achse (l) und die Anzahl der Platten)¹⁵.
3. Bestimmung über das Ausmaß der dreidimensionalen Einbettung bezogene Gewebe schrumpfen während der Verarbeitung von Gewebeproben für Histologie
   1. Materialien vorbereiten: Mikrotom Blades, Pinzetten, Agar, metallischen Gussformen, digitale Scanner und Größe Herrscher (z.B. Millimeterpapier).
   2. Schneiden Sie eine frische, Abschnitt Fläche aus einem festen Gewebeprobe.
      Hinweis: Wenn Proben von leicht mit verformbaren (weich) Gewebe (Fettgewebe, gallertartigen Gewebe), Einbetten der festen Gewebeprobe in Agar vor Stationspunkte (Abb. 4A).
   3. Probe in Agar einbetten:
      1. Standard-Agar Pulver für Mikrobiologie Kulturmedium mit einem entsprechenden Volumen des Wassers verwendet (etwa 0,5 – 1 g Agar/10 mL Wasser) in ein Becherglas. Rühren Sie die Mischung und erhitzen in der Mikrowelle bei 700 W bis das Kochen für 3 – 5 s. umrühren und zum Kochen wieder für 3 – 5 s bringen.
      2. Optional, um den Kontrast des Nährbodens um die Gewebeprobe zu erhöhen, färben die flüssigen Agar, z.B.mit schwarzer Tinte (1 mL Tinte zu 10 mL heißen flüssigen Agar hinzufügen und kräftig rühren).
      3. Gießen Sie das heißen Agar in eine Gussform (z.B. eine Metallform verwendet für Paraffin einbetten, Abb. 10A-D) und Tauchen Sie die festen Gewebeprobe im warmen Agar. Lassen Sie das Agar bis zum Erstarren abkühlen, entfernen Sie den Schimmel und schneiden Sie den Agar-Block mit dem eingebetteten Gewebe mit einem Mikrotom oder Rasierklinge.
         Achtung: Beim Umgang mit heißen flüssigen Agar, tragen Sie Schutzbrille und Handschuhe. Gewebeproben der Prozess behoben in Formaldehyd-Lösung unter dem Auspuff Haube und Schutzbrille und Labor Handschuhe tragen.
   4. Legen Sie die Probe mit seiner Sektion Oberfläche nach unten auf einen Flachbett-Scanner zusammen mit einem Lineal Größe und Scannen Sie die Abschnitt-Oberfläche (Abb. 4AB).
   5. Ermitteln Sie Bereich der Oberfläche des festen Gewebeprobe (_f) in der digitalen Scan, unter Verwendung eines in Schritt 1.2.6 (Abbildung 4 b) beschriebenen Techniken Abschnitt.
   6. Einbetten der Probenmaterials in Kunststoff einbetten Mittel, wie Epoxy (z.B.Verfahrensweisen) oder Glycolmethacrylate/Methylmethacrylate (GMA/MMA)²³,^24,25 () folgende Standardprotokolle^23, Abbildung 4). Sicherstellen Sie, dass die Abschnitt Oberfläche der festen Probe gescannt im vorherigen Schritt (1.3.4) in Kunststoff eingebettet Probe erhalten bleibt.
      Hinweis: Um die Ausrichtung der Abschnitt Oberfläche der Probe während der Verarbeitung der Probe zu erhalten, konsequent legen Sie die Probe mit der vorgesehenen Abschnitt Oberfläche nach unten in die einbettende Kassette oder die Gussform, oder markieren Sie den gewünschten Abschnitt Oberfläche (oder der gegenüberliegenden Seite der Probe) mit Tinte.
   7. Schneiden einen histologischen Abschnitt aus dem Kunststoff Block entspricht der Originaloberfläche Abschnitt der festen Gewebeprobe (Schritt 1.3.2) mit ein Mikrotom (Abbildung 4), Abschnitt auf einen Glasobjektträger (Abb. 4) montieren und färben es routinemäßig) z.B., Hämatoxylin und Eosin färben, H & E)^24,25.
      Achtung: Um eine histologische Abschnitt ungefähr in der gleichen Ebene wie die Originaloberfläche Abschnitt der festen Gewebeprobe zu erhalten, sorgfältig ausrichten der Kunststoffblock in die Halterung des Mikrotom vor dem Schneiden.
   8. Legen Sie die Folie mit dem verschmutzten Bereich nach unten auf einen Flachbett-Scanner zusammen mit einem Lineal Größe und Scannen Sie den Abschnitt (Abb. 4E).
   9. Ermitteln Sie die Fläche des Abschnitts Kunststoff eingebettet Gewebeprobe (A-_e) in der digitalen Scan, unter Verwendung eines in Schritt 1.2.6 (Abb. 4F) beschriebenen Techniken.
   10. Berechnen Sie die durchschnittliche Einbettung bezogene Gewebe Schrumpfung (für die jeweiligen Gewebe und Einbetten von Medium) aus den gemessenen Bereichen entsprechende Schnittprofile von Gewebeproben vor und nach dem Einbetten in Kunststoff einbetten Medium. Die lineare Schrumpfung Faktor f_s wird berechnet als die Quadratwurzel aus dem Quotienten aus den Bereichen der Abschnitt Profile von n Gewebeproben nach dem Einbetten in Kunststoff einbetten Medium (A-_e) und den Bereichen der entsprechenden Abschnitt Profile von der gleichen Gewebeproben vor dem Einbetten in Kunststoff einbetten Medium (_f) (Abbildung 4)¹⁴.

(2) volumengewichteten systematische Stichproben durch Punkt zählen und Verarbeitung von Gewebe Teilproben für verschiedene nachgelagerte Analyse⁷

1. Bereiten Sie Materialien: Lineal, Bremssattel, Messer, Scheren, Pinzetten, wasserfesten Stift Punkt/Kreuz Gitter auf Kunststoff-Folien und zufällige Anzahl Tabellen gedruckt.
   Hinweis: Kopiervorlagen für grenzüberschreitende Netze (5 – 60 mm) werden in das ergänzende Material der "Sampling Guides für Schweine biomedizinische Gewebemodelle"⁷bereitgestellt.
2. Das Organ/Gewebe auf eine glatte Oberfläche (schneiden Base) und Messen Sie die Länge (l) der Orgel entlang seiner Längsachse (Abbildung 5A, Abbildung 6A).
3. Schneiden Sie die komplette Organgewebe in äquidistanten parallele Scheiben orthogonal zu seiner Längsachse (Abb. 5 b). Wählen Sie eine Distanz d zwischen zwei Abschnitten (d. h., die Stationspunkte Intervall/Schnittdicke, in der Regel ca. 1 cm) klein genug, um eine ausreichende Anzahl von Gewebe/Organ Scheiben zu erhalten. Nach dem Zufallsprinzip positionieren des ersten Abschnitts innerhalb einer Entfernung zwischen 0 und strukturierendes Abstand vom Rand der Orgel. Beurteilen Sie beim Schneiden visuell die Position und Ausrichtung der einzelnen Schnittebene, annähernd parallel Organgewebe Platten von etwa gleichmäßiger Dicke zu erhalten.
   Hinweis: Die erforderliche Anzahl von Gewebe/Organ Platten richtet sich nach der Größe der untersuchten Organ/Gewebe und die Zahl der aufgenommenen Gewebe Standorte. Wenn kleine Organe oder Proben in dünne Platten von ≤5 mm geschnitten werden müssen, die Proben in Agar vor dem Schneiden einbetten (siehe Punkt 1.3.3.) und technische Geräte zum Schneiden der Agar eingebettete Probe verwenden. Empirisch empfehlenswert Stationspunkte Intervalle für die meisten Schweine Organe und Gewebe, sowie Beispiele für das Schneiden von Geräten sind in das ergänzende Material der "Sampling Guides für Schweine biomedizinische Gewebemodelle"⁷angegeben.
4. Legen Sie alle Organgewebe/Platten auf der gleichen Fläche nach unten auf die schneiden-Basis (Abb. 6 b).
5. Überlagerung die Gewebe-Platten mit einer entsprechend großen Kreuzraster auf ein Kunststoff transparent gedruckt, indem man die Regionen in äußerster links über einen beliebigen Punkt aus dem Gewebe (Abbildung 5-D, Abbildung 6 b) oberen Kreuz des Rasters.
   Hinweis: Wählen Sie ein Kreuzraster mit einer ausreichend geringen Abstand zwischen angrenzenden Kreuze, so dass jeweils untersuchten der Studie mindestens doppelt so viele Kreuze Abschnitt Fläche(n) Gewebe Fach schlagen zu untersuchenden, als die Anzahl der Samples, die zu Dieses Fach Gewebe entnommen Sie werden. Empirisch empfehlenswert Kreuzraster Größen für die meisten Schweine Organe und Gewebe sind in das ergänzende Material der "Sampling Guides für Schweine biomedizinische Gewebemodelle"⁷angegeben.
6. Markieren Sie und zählen Sie alle Kreuze schlagen das Gewebe (bzw. das Gewebe Sub Fach zu untersuchenden). Wenden Sie einen einheitlichen Modus des Zählens und Nummerierung der Kreuze schlagen das Gewebe Fach zu untersuchenden in alle Gewebe-Platten, z. B.durch fortlaufende Nummerierung der jeweiligen Kreuze in jeder Zeile für Zeile von links nach rechts und von konsequent an von oben nach unten, oder, z. B.durch eine Nummerierung der Kreuze in einem Gewebe Platte nacheinander im Uhrzeigersinn, beginnend mit dem Kreuz am nächsten an die 12:00 Position, wie in Abbildung 5Eexemplarisch dargestellt.
7. Teilen Sie die Anzahl der Kreuze schlagen das Gewebe/Gewebe Fach zu Stichprobe (n) durch die Anzahl der Samples generiert werden, um das systematische Abtastintervall (i) zu erhalten.
8. Bestimmen Sie die erste Probenahme-Position durch eine zufällige Zahl X im Intervall zwischen 1 und ichdie Wahl. Hierzu verwenden Sie eine Zufallszahl Tabelle. Markieren Sie die erste Probenahme-Position (X) und jeden nächsten X + i, X + 2ich, X + 3i, etc., Kreuz schlagen das Gewebe/Gewebe-Fach auf die Kunststoff Transparenz abgetastet werden verwenden einen wasserfesten Stift (Abb. 5F).
   Hinweis: Zufällige Anzahl Tabellen können bequem und schnell generiert werden mit Hilfe eines Online-Zufallszahlen-Generators.
9. Markieren Sie das Gewebe entsprechend den markierten Standorten durch leicht anheben der Kunststoff Transparenz und platzieren ein kleines Stück Papier sauber, leere Konfetti auf der Oberfläche der Gewebe-Platte mit der Pinzette (Abbildung 5, Abbildung 6E Kreuze ).
10. Verbrauchsteuern Sie Probe des Gewebes der beprobten Standorte (Abbildung 5 H, Abb. 6F, Abb. 7A) und weiter unterteilen sie für verschiedene Arten von nachfolgenden Analysen (Abbildung 6, Abbildung 7A-B), wie in angegeben Tabelle 1.
11. Nach der Probenahme, die Kunststoff Folien mit warmem Wasser und Seife, trocknen, reinigen und wiederverwenden.

3. Generation der isotropen einheitliche zufällige (IUR) Abschnitten und vertikale einheitliche zufällige (VUR) für Quantitative stereologischen Analysen

1. "Isector" Technik
   1. Materialien vorbereiten: Razor oder Mikrotom klingen, Agar, sphärische Gussformen (z.B.casting Formen für Pralinen, die von Konditor Zulieferanten bezogen werden können), Foldback Klammern und Zange.
   2. Legen Sie einen ausreichend großen Stück (1 x 1 x 1 cm³) feste, systematisch nach dem Zufallsprinzip beprobt Gewebe in einer kugelförmigen Gussform, halten Sie zusammen mit Foldback-Klammern, und füllen Sie den Schimmel mit warmen flüssigen Agar (Abb. 8A-E).
   3. Entfernen Sie nach Erstarrung des Agar Agar-Kugel (Abb. 8F) aus der Gussform.
   4. Die Agar-Kugel Rollen mit der eingebetteten Gewebeprobe über den Tisch zu stoppen, und an eine zufällige Position Abschnitt.
      Hinweis: Die resultierende Schnittebene ist ein IUR Abschnitt (Abbildung 8F-G).
   5. Fahren Sie mit der Gewebeprobe einbetten in Kunstharz wie GMA/MMA, Aufrechterhaltung der Ausrichtung des Abschnitts IUR Flugzeug (siehe 1.3.5).
2. "Orientator" Technik
   1. Bereiten Sie die Materialien: Razor oder Mikrotom klingen, Agar, Pinzetten, zufällige Zahl Tabelle(n) Drucke gleichwinklig und Kosinus gewichtet Kreise.
      Hinweis: In früheren Publikationen^8,26angeboten Kopiervorlagen der Kreise.
   2. Legen Sie die Probe fixierte Gewebe (oder Agar eingebettet fixierte Gewebe) auf einen Druck von einem gleichwinklig Kreis mit einer Kante parallel zur 0-180 ° Richtung (Abbildung 9A, Abb. 10E).
   3. Bestimmen Sie einen zufälligen Winkel mithilfe der zufällige Zahl Tabelle. Finden Sie die entsprechenden Markierungen auf der Skala des gleichwinklig Kreises, die die Probe auf ruht. Mit diesen Markierungen Schnittfläche ein durch die Probe (oder rund um die eingebetteten Gewebeprobe Agar), mit der Schnittebene ausgerichtet parallel zur Richtung des zufälligen Winkels an der Skala der gleichwinklig Kreis und senkrecht zur der Oberfläche der Probe (Abbildung 9 b-C, Abbildung 10F) ruhen.
   4. Platzieren Sie den Gewebe-Block mit der Sektion Oberfläche erzeugt im vorherigen Schritt vor Nachteil auf einem Kreis Kosinus gewichtet mit der Kante der ruhenden Oberfläche platziert parallel zur Richtung 1: 1 (Abbildung 9, Abbildung 10 H).
   5. Wiederholen Sie Schritt 3.2.3 und schneiden Sie einen neuen Abschnitt durch die Probe in einem zufälligen Winkel über die zufällige Zahl Tabelle (Abbildung 9E-F, Abbildung 10I-J) ermittelt.
      Hinweis: Die resultierende Schnittebene ist ein IUR-Abschnitt.
   6. Gegebenenfalls ermitteln Sie die Fläche des Profils IUR Abschnitt der festen Gewebeprobe zur Bestimmung der Einbettung im Zusammenhang mit Gewebe Schrumpfung (Abbildung 9-J) zu, wie unter Punkt 1.3 beschrieben und fahren Sie mit der Gewebeprobe aus Kunststoff einbetten Harz wie GMA/MMA.
3. Generation von vertikalen einheitliche zufällige (VUR) Abschnitte
   1. Materialien vorbereiten: Razor oder Mikrotom klingen, Agar, Zange, zufällige Zahl Tabelle(n) und Drucke von gleichwinklig Kreisen.
      Hinweis: In früheren Publikationen^8,26angeboten Kopiervorlagen der Kreise.
   2. Definieren Sie eine vertikale Achse innerhalb der festen Gewebeprobe, die immer während der nachfolgenden Schritte im Abschnitt Beispiel erkennbar ist.
      Hinweis: In der Regel wird die Achse senkrecht auf die natürliche Oberfläche der Gewebeprobe der vertikalen Achse gewählt.
   3. Gegebenenfalls Betten Sie die Probe in Agar (Abbildung 11 b ein).
      Hinweis: Agar-Einbettung vor VUR - oder IUR-Schneiden der festen Probe ist im allgemeinen empfehlenswert für kleine, dünne, zerbrechliche oder weichen Proben. Auch Agar-Einbetten der Proben erleichtern die Positionierung der VUR geschnittenen Probe während der nachfolgenden Einbettung der Probe in Kunstharz Medium.
   4. Legen Sie die Probe auf einen Druck von einem gleichwinklig Kreis mit der vertikalen Achse, die orthogonal zur Ebene der Tabelle/Papier-Tabelle (Abbildung 11) ausgerichtet.
   5. Schneiden Sie die Probe in einem zufälligen Winkel (bestimmt mit einer zufälligen Nummer Tabelle) mit die Schnittebene orthogonalen an den Tisch und parallel zur vertikalen Achse eine VUR Schnittebene (Abbildung 11) erhalten.
   6. Ggf. bestimmen Sie den Bereich des Profils IUR Abschnitt der festen Gewebeprobe zur Bestimmung der Einbettung im Zusammenhang mit Gewebe Schrumpfung wie in Schritt 1.3 (vgl. Abbildung 9-J) beschrieben und fahren Sie mit der Gewebeprobe in einbetten Kunststoff-Harz wie GMA/MMA.

Ergebnisse

Eintauchen-Technik zur Bestimmung der Dichte Gewebe/organ

Abbildung 12A -B zeigt die repräsentative Bestimmung der Dichte und Volumen einer porcinen Niere mit der Überflutung Technik im Schritt 1.1 (Abbildung 1, Abbildung 2) beschrieben. Repräsentative Ergebnisse der Dichtemessungen zusätzliche porcinen Organe und Gewebe s...

Diskussion

Generation der Biobank Musterkollektionen von porcinen Tiermodellen erfordert robuste Techniken und Protokolle zur Bestimmung von Organgewebe/Volumen, die reproduzierbare Generation des Vertreters, redundante Gewebeproben geeignet für ein breites Spektrum von verschiedenen Analysemethoden und Randomisierung der Ausrichtung der Probe Abschnitte für quantitative stereologischen Analysen. In diesem Artikel beschriebenen Methoden sind die Größen von porcinen Organen und Geweben angepasst und wurden entwickelt, um effekti...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Carl Roth GmbH, Germany	Agar (powder), Cat.: 5210.3	Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.
Caliper	Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany	Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902	Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.
Casting molds (metal)	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	Einbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b	Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.
Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm)	n.a.	n.a.	Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles	n.a.	n.a.	Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux´s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm)	Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China	Y10006 and Y10005	Any other type of standard office foldback clamps will do as well.
Forceps (anatomical)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811	Any type of anatomical forceps will do.
Formaldehyde-solution 4%	SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany	Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005	Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.
Graph paper (for calibration)	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514	Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.
Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036	Any kind of glass- or plastic beakers of 5 – 100 ml volume will do.
Laboratory scale(s)	Mettler Toledo GmbH, Gießen, Germany	PM6000	Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do
	Sartorius AG, Göttingen, Germany	BP61S
Microtome blades	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700	Any kind of single-use microtome blades will do.
Morphometry/planimetry software/system	National Institute of Health (NIH)	ImageJ	Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
Zeiss-Kontron, Eching, Germany	VideoplanTM image analysis system	Out of stock
Photo camera	Nikon	D40	Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod  will do.
Plastic transparencies	Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany	Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562	Any (laser)-printable plastic transparency will do.
Random number tables	n.a.	n.a.	Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/
Razor blades	Plano GmbH, Wetzlar, Germany	T5016	Any kind of razor blades will do.
Ruler	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30	Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.
Saline (0.9%)	Carl Roth GmbH, Germany	Natriumchlorid, >99% Cat.: 0601.1	To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20°C.
Scalpel blades	Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germany	BRAUN Surgical blades N°22	Any kind of scalpel blades will do.
Scanner	Hewlett-Packard	hp scanjet 7400c	Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.
Slicing devices	n.a.	n.a.	Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).
Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter)	Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany	Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm	Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)
Thin wire	Basteln & Hobby Schobes, Straßfurth, Germany. www,bastel-welt.de	Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742	Any other kind of thin wire will also do.
Tissue paper	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305	Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.
Waterproof pen	Staedler Mars GmbH & Co KG, Nürnberg, Grmany	Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2	Any other kind of waterproof pen will do as well.