Stratégies d’échantillonnage et traitement des échantillons de tissu de la biobanque de modèles biomédicaux porcins

Résumé

L’application pratique et les performances des méthodes pour la génération d’échantillons de tissus représentant des modèles animaux porcins pour un large éventail d’analyses en aval dans les projets de la biobanque sont démontrées, y compris la volumétrie, l’échantillonnage aléatoire systématique, et le traitement différencié des échantillons de tissus pour les types d’analyses qualitatives et quantitatives, morphologiques et moléculaires.

Résumé

Pour la recherche translationnelle, modèles porcines sont progressivement devenus plus populaires. Étant donné la valeur élevée de chaque animal, en particulier des porcs génétiquement modifiés, modèles et le nombre souvent limité d’animaux disponibles de ces modèles, création de collections (biobanque) des échantillons de tissu suffisamment transformés adapté pour un large spectre des méthodes d’analyses subséquentes, y compris les analyses non précisés à l’instant d’échantillonnage, représentent des approches utiles pour profiter pleinement de la valeur translationnelle du modèle. En ce qui concerne les particularités de l’espèce porcine anatomie, des lignes directrices exhaustives ont récemment été établies pour génération normalisée de représentant, échantillons de haute qualité provenant de différents organes porcins et tissus. Ces lignes directrices sont des conditions essentielles pour la reproductibilité des résultats et la comparaison entre différentes études et les enquêteurs. L’enregistrement des données de base, tels que le poids des organes et volumes, la détermination des sites d’échantillonnage et du nombre d’échantillons de tissus à générer, ainsi que leur orientation, taille, traitement et directions de coupe, est des facteurs pertinents détermination de la généralisation et la convivialité de l’échantillon pour des analyses morphologiques moléculaires, qualitatives et quantitatives. Ici, une démonstration illustrative, pratique, étape par étape des techniques plus importantes pour la production de représentant, biobanque multi-usages spécimen provenant de tissus porcins est présenté. Les méthodes décrites ici incluent la détermination de volumes d’organes et de tissus et de la densité, l’application d’une procédure d’échantillonnage aléatoire systématique pondérée en fonction du volume pour les organes parenchymateux par comptage point, détermination de l’étendue du retrait de tissu associés à enrobage histologique des échantillons et génération d’échantillons orientés au hasard pour des analyses quantitatives stéréologiques, comme isotrope uniforme aléatoire (IUR) sections générées par les méthodes « Orientation » et « Isector » et vertical uniforme sections (RVU) aléatoires.

Introduction

Dans la médecine translationnelle, les porcs sont plus en plus courants pour une utilisation comme modèles de grand animaux^1,2,3,4,5, en raison de nombreuses similitudes avantageux entre le porc et anatomie et physiologie et la disponibilité de méthodes biologiques moléculaires établies permettant la génération d’adapté, modifié génétiquement des modèles de porc pour un large éventail de maladies conditions^1,4.

Toutefois, par rapport aux modèles de rongeurs, le nombre d’animaux d’un modèle de cochon respectifs qui peuvent être fournis pour expériences en tout temps est limité. Cela est dû à l’intervalle de génération porcin d’environ un an et les efforts financiers et beaucoup de temps requis pour la génération de modèles de porcins et de l’élevage. Par conséquent, les animaux individuels d’un modèle porcin, ainsi que les échantillons qui peuvent être générés de ces porcs, sont très précieux, en particulier si génétiquement modifiée modèles porcines et/ou des problèmes expérimentaux à long terme (p. ex., complications tardives de maladies chroniques) sont examinées dans les individus âgés de^6,2,7.

Dans le cadre de toute étude, exécution d’analyses supplémentaires, qui ne était pas prévue dans le protocole expérimental de l’étude initial pourrait plus tard se pour révéler pertinentes, par exemple, à l’adresse des questions distinctes découlant précédemment découvert résultats inattendus. Si les échantillons appropriés pour de telles expériences supplémentaires ne sont pas disponibles, coût disproportionnellement plus élevé et les dépenses de beaucoup de temps peuvent être nécessaires de produire des porcs supplémentaires et des échantillons de tissus. Pour être préparé à ces éventualités, génération de biobanque collections d’échantillons de sauvegarde conservées des différents organes, de tissus ou liquides bio, quantitativement et qualitativement adaptées pour un large éventail d’analyses ultérieures, est considéré comme un important approche^2,6,7. Découlant des prestations optimales un modèle animal porcin, la disponibilité des échantillons adéquats biobanque offre également la possibilité unique pour effectuer un large éventail de méthodes d’analyse différentes sur les matériaux des échantillons identiques sur un niveau de plusieurs organes dans la même chaque animal, par exemple, par la distribution d’échantillons à des scientifiques de différents groupes de travail organisés en un réseau de recherche sur^2,6,7. En outre, la stratégie d’échantillonnage '' tourné vers l’avenir '' dans les biobanques contribue également à une réduction du nombre d’animaux nécessaires dans une étude. Les avantages du modèle porcin biobanques ont récemment été démontrés dans un multi-organes, étude multiomics, orgue la diaphonie dans un modèle porcin génétiquement modifié du diabète à long terme, sur des échantillons de la biobanque de porc Munich MIDY ².

Il y a certaines exigences obligatoires biobanque échantillons doivent généralement respecter pour établir la fiabilité et la facilité d’interprétation des résultats des analyses effectuées par la suite. Les échantillons doivent être générés de façon reproductible, et ils doivent être représentatifs, c'est-à-diresuffisamment reflétant les caractéristiques morphologiques et moléculaires intéressées des tissus ou d’organes les échantillons ont été prélevés à⁷. Pour convenir à un large éventail de types d’analyses en aval, les échantillons doivent être pris en quantité suffisante et traitées selon les demandes (y compris les conditions de temps et température) différentes méthodes d’analyse, y compris les descriptifs analyses histopathologiques, tels que cryohistology, paraffine et plastique histologie, immunohistochimie, hybridation in situ , analyses microscopiques électron ultrastructurales et bilans diagnostiques de laboratoire clinique, aussi bien que moléculaires analyses d’ADN, d’ARN, de protéines et de métabolites.

Pour permettre l’évaluation d’un large éventail de distinctes paramètres morphologiques quantitatifs tels que des nombres, des volumes, longueurs ou des surfaces de structures tissulaires distinctes par des analyses quantitatives stéréologiques, section randomisée des avions de la des échantillons histologiques des tissus/organes respectifs doivent être préparés à^7,8,9,10,11. Dans des études morphologiques quantitatifs, la détermination précise du volume total des tissus, organes ou compartiment de l’orgue, les échantillons ont été prélevés de (c.-à-d., l’espace de référence) est d’une importance cruciale^{7,9 , 12} pour calculer les quantités absolues des paramètres au sein de l’organe respectif, des tissus ou organisme intéressés. Finalement, l’effet du retrait de tissu incorporation liées au cours de la préparation des coupes histologiques doit être déterminé et pris en compte¹³. Par conséquent, des analyses quantitatives stéréologiques, notamment des échantillons archivés (corrigé d’échantillons de tissus, tissus incorporé blocs, coupes histologiques, etc.) dans les études précédentes sont parfois¹²sévèrement limité, voire même impossible, surtout si la volumétrie des tissus/organes respectifs ne faisait pas, si aucun de ses designs d’échantillonnage adéquates ont été appliqués pour justifier des échantillons représentatifs, si les nombres et les quantités d’échantillons individuels disponibles ne suffisent pas, ou si le traitement de la échantillons est incompatible avec l’estimation du ou les paramètres morphologique quantitatif d’intérêt. En raison des multiples facteurs d’influence possibles, l’aptitude des matériaux archive-échantillon pour des analyses des paramètres morphologiques quantitatifs distincts impossible de répondre sans équivoque, mais dépend de l’évaluation minutieuse de chaque cas individuel.

Ainsi, comme l’emplacement, taille, nombre, traitement, direction de coupe et l’orientation des échantillons potentiellement affecte les résultats des analyses ultérieures, ces facteurs sont d’une grande importance et doivent être envisagées dans le protocole expérimental d’aucune étude. En ce qui concerne ces aspects et les particularités de l’anatomie porcin, directives d’échantillonnage complet, détaillé et à grande échelle des modèles animaux adaptés aux porcins ont récemment été créées, offrant une solide référence à standardisées et reproductibles et la production efficace de redondants, suffisamment transformés, qualité des échantillons de plus de 50 différents porcine organes et tissus^6,7.

Les descriptions méthodologiques et le didacticiel vidéo montré dans le présent article prévoient détaillées, exemples, compréhensible, instructions étape par étape pour une performance pratique d’une variété de techniques de volumétrie, prélèvement d’échantillons de tissus porcins et organes et traitement des échantillons de tissus pour analyse en aval différentes méthodes. Les techniques recommandés incluent des méthodes pour la détermination des volumes d’organes et de tissus et de densités fondées sur les principes d’Archimède et Cavalieri⁹, y compris la détermination des dimensions de rétrécissement en trois dimensions des tissus associés à la intégration dans différents encastrement médias¹⁴ pendant le traitement pour examen histologique, application d’échantillonnage aléatoire systématique possible pondérée en fonction du volume s’approche, traitement des échantillons de tissus prélevés pour différents ultérieures analyses^7,8,9,15et génération de convenablement orienté et traitement échantillons pour potentiel des analyses quantitatives stéréologique^{7,8, 9,10,11}. À côté de leur application dans des projets porcins biobanque, les méthodes démontrées sont généralement appropriées pour toutes les études examinant les propriétés histo-morphologiques quantitatifs des organes/tissus. En outre, conceptions de l’échantillonnage aléatoire systématique sont particulièrement bénéfiques pour la génération d’échantillons représentatifs dans les expériences à l’aide de méthodes d’analyse moléculaire pour détecter les altérations de l’abondance de, par exemple, ARN, protéines ou métabolites dans différents organes et tissus.

Les sections suivantes fournissent une brève introduction à ces méthodes, tandis que leur performance pratique est décrite dans la section protocole.

Détermination des volumes d’organes et de tissus
Détermination du poids des organes et des volumes est importante dans plusieurs paramètres expérimentaux, que ces facteurs pourraient indiquer des changements, potentiellement liées à expérimentalement examiné les facteurs d’intérêt. Le volume total d’un organe ou le tissu est aussi communément requis pour calculer les paramètres quantitatifs absolues, (par exemple, le nombre total de cellules), des densités de volume numérique stereologically estimé (c.-à-d., le nombre de cellules par unité de volume du tissu)^7,12. En dehors des techniques utilisant des équipements techniques complexes, comme la tomographie par ordinateur, il existe essentiellement trois méthodes pratiques habituellement utilisées pour déterminer le volume absolu d’un organe ou tissu. Le volume d’un organe peut être déterminé par « mesure volumétrique directe » selon le principe d’Archimède, c'est-à-dire, en mesurant le volume d’eau ou une solution saline déplacés par la structure lorsqu’il est complètement submergé. Toutefois, pour relativement grandes orgues porcins, ces approches sont impraticable et enclin à l’imprécision, car ils nécessitent des flacons volumétrique/de mesure très large. Plus commodément, le volume d’un organe/tissu peut être calculé à partir de son poids et la densité^7,12,16, qui peut efficacement être déterminé à l’aide de la « méthode de submersion »^{7,12 ,16} (étape de protocole 1.1.). Volumes d’organes et de tissus peuvent également être estimés à l’aide de la volumétrie des approches basées sur le « principe de Cavalieri » (1598-1647). En termes simples, le principe de Cavalieri stipule, que si deux objets sont sectionnées dans des plans parallèles à un plan de masse, et les profils des sections coupent par le biais de deux objets au correspondant distance depuis le plan de masse ont les mêmes zones, les deux objets ont le même volume. Ainsi, on peut estimer le volume d’objets façonnés arbitrairement comme le produit de leurs zones de profil de section dans les plans de coupe parallèle, tout aussi lointain et la distance entre les plans de coupe. C’est compréhensible avec l’analogie suivante : considérons deux cheminées comprenant le même nombre de pièces identiques sont placées côte à côte, une pile avec la pièces de monnaie ordonnée empilée les uns sur les autres ce qui donne une forme cylindrique de la pile de la pièce et l’autre empilement de pièces de monnaie avec décentré placé pièces (Figure 3 a). Bien que les formes des deux cheminées de la pièce sont différents, leurs volumes sont identiques, depuis les zones des pièces à des niveaux correspondants de deux piles (c'est-à-direles zones des profils de sections parallèles coupent par les deux cheminées de la pièce à égale distance de la au sol) sont identiques. Estimation des volumes d’organes porcins et de tissus en utilisant le principe de Cavalieri^7,12,15 est décrit à l’étape 1.2.

Détermination de l’étendue du retrait des tissus associé à enrobage histologique
Dans les analyses de plusieurs paramètres morphologiques quantitatifs mesurés dans des coupes de tissus histologiques, l’effet de rétraction tissulaire liées à enrobage survenant pendant le traitement pour l’histologie des tissus doit être déterminé et pris en compte. L’ampleur du retrait de tissu liées à enrobage peut être variable et dépend à la fois sur le tissu, son traitement et l’incorporation moyenne^{8,13,17,18,19}. Généralement, les changements liés à enrobage du volume d’un échantillon de tissu (c'est-à-dire, pour la plupart de rétrécissement) se produisent dans les trois dimensions de l’espace et, par conséquent, affecte tous les paramètres dimensionnels estimées par des analyses quantitatives stéréologiques⁸ . Fondamentalement, l’ampleur du retrait de tissu incorporation liées, exprimé comme le facteur de rétrécissement des tissus linéairef_S, peut être estimée comme indiqué dans l’étape 1.3. et utilisés pour la correction des paramètres morphologiques quantitatifs (rétrécissement sensible)¹⁴.

Échantillonnage aléatoire systématique pondérée en fonction du volume des organes/tissus
Création d’une biobanque de collection des échantillons d’organes et de tissus porcins, approches d’échantillonnage aléatoire systématique pondérée en fonction du volume tel que décrits à l’étape 2 se sont avérés pour être pratiques, rapide et efficaces des techniques de génération de représentant, tissu multi-usage échantillons^7,8,9,15.

Génération d’isotrope uniforme aléatoire et des sections verticales uniforme aléatoire pour les analyses quantitatives stéréologiques
Biobank échantillons de tissus doivent être adapté pour un large éventail de méthodes différentes analyse stéréologique quantitative pour l’estimation d’un maximum de paramètres qui ne peut être déterminée sans un spécimen bien préparé. Presque tous les paramètres stéréologiques quantitatives peuvent être déterminés, en utilisant « isotrope (indépendant) uniforme aléatoire (IUR) sections »^8,9. Dans les sections IUR, l’orientation tridimensionnelle du plan de la section de l’échantillon de tissu est aléatoire. Ceci peut être réalisé par randomisation de la position de l’échantillon de tissu par rapport à la position de l’avion de la section, tel qu’appliqué dans le « Isector » méthode¹¹ (étape 3.1 du protocole), ou par randomisation de l’orientation du plan de la section relative à la échantillon de tissu, comme dans la méthode « Orienteur »¹⁰ (étape 3.2 du protocole). Dans les échantillons de tissus, comme la peau ou la muqueuse spécimen affichant un axe vertical naturellement présent, ou défini et correctement identifiable, préparation des « vertical uniforme aléatoire (RVU) sections » (pas de protocole 3.3.) sectionné strictement dans le plan de leur axe vertical est avantageuse^8,20. Pour un discours complet des fondements théoriques de l’échantillonnage IUR/VUR et un examen approfondi des potentiels en aval analyses stéréologiques quantitatives, le lecteur intéressé est dénommé les manuels de stéréologie quantitative dans la vie Sciences^8,9.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici utilisent des échantillons de tissus provenant d’animaux morts et respectez les réglementations allemandes du bien-être animal.

1. volumétrie

1. Technique d’immersion pour la détermination de la densité de tissu ou d’organe (Figure 1 et Figure 2) ^{7 , 12 , 16}
   1. Préparer du matériel : Scalpel lames, serviettes en papier, pinces fines, balances de laboratoire standard, verre ou gobelets en plastique, solution saline à 0,9 % et porte-spécimens se construit (Figure 2 a).
   2. Un morceau de tissu de l’accise (taille maximale : 2 x 2 x 2 cm³) de l’organe/tissu, spécifiquement dans le compartiment de l’organe d’intérêt. Petits organes, tels que l’hypophyse et la glande pinéale, sont mesurées dans sa totalité.
      ATTENTION : Veiller à ce que la taille de l’échantillon est notamment plus petite que le diamètre intérieur du bécher (étape 1.1.5 et suiv.) et son niveau de remplissage pour permettre une immersion complète de l’échantillon sans contact avec les parois du bécher dans étape 1.1.7.
   3. Avec soin de prélever l’échantillon avec un essuie-tout pour enlever l’excès de sang/tissu liquide.
   4. Peser l’échantillon sur une échelle de précision et d’enregistrer le poids de l’échantillon (m_S). Déterminer le poids des échantillons de tissus petit à mg près (Figure 1 a).
   5. Placer un bécher rempli de salin de 0,9 % à température ambiante sur la balance. Ne pas remplir complètement le bécher, pour permettre une immersion de l’échantillon de tissu dans l’étape ultérieure sans débordement.
      ATTENTION : Utilisez une taille de bécher appropriée à la taille et poids des échantillons de tissus doivent être mesurés et la plage de mesure efficace de l’échelle. Pour plus grands échantillons jusqu'à 2 x 2 x 2 cm³, une taille de bécher de 50 – 100 mL est indiquée en association avec une échelle mesurant environ 100 mg à 500 g, alors que pour les petits échantillons, utilisez béchers de volume 5 – 10 mL en combinaison avec les balances de précision avec gammes de mesure entre environ 0,1 mg et 20 g.
   6. Plonger le porte-échantillon dans la solution saline (c.-à-d.une boucle suffisamment rigide de fil de fer mince ou quelque chose de similaire, Figure 2 a) à un emplacement marqué (flèches dans la Figure 1 b, 2 b Figureet Figure 2). Réinitialisez ensuite, (tare) l’affichage de la balance à zéro.
   7. Fixez soigneusement l’échantillon de tissu pour le porte-échantillon et submerger complètement l’échantillon dans la solution saline jusqu'à ce que la position marquée sur le porte-échantillon est atteinte (flèches dans la Figure 1 b, 2 b Figureet Figure 2).
      ATTENTION : L’échantillon submergé et le porte-échantillon, ne doivent pas avoir le contact avec les parois ou le fond du bécher ou la surface de la solution saline.
   8. Tout en maintenant le porte-échantillon et l’échantillon immergé dans cette position, enregistrer le poids affiché sur la balance (m_L), se référant au poids d’une solution saline déplacé par l’échantillon de tissu (Figure 1 C, la Figure 2 b, et La figure 2).
   9. Calculer le volume de l’échantillon (V-_S) de m_Let la densité d’une solution saline à température ambiante (20 ° C) (ρ_saline = 1,0048 g/cm³) comme V_S = m_L/ Ρ_saline [g/g/cm³] (Figure 1).
   10. Calculer la masse volumique de l’échantillon de tissu (ρ_échantillon) du poids (c.-à-d., masse) de l’échantillon (m_S) et son volume (V_S) : ρ_échantillon = m_S /V_S[g/cm³] (Figure 1).
   11. Pour dans sa totalitéorganes mesurés, recommencez la mesure trois fois et calculer la densité d’orgue moyen des valeurs de mesure unique. Pour les grands organes/tissus, effectuer des mesures répétées avec différents échantillons du même compartiment organes/tissus/organes et calculer la densité moyenne des mesures simples, en conséquence.
   12. Calcule le volume total du compartiment organes/tissus/organes de son poids et la densité (Figure 1).
2. Application de la méthode pour la détermination des Volumes d’organes porcins Cavalieri ⁷
   1. Préparer du matériel : règle, étrier, couteau, ciseaux, pinces, stylo imperméable à l’eau, en plastique transparents, scanner, photo caméra et grilles de croix imprimés sur des transparents en plastique.
   2. Placer l’ensemble organe/tissu sur une surface plate (base de coupe) et mesurer la longueur (l) de l’organe selon son axe longitudinal (Figure 3 b, Figure 5 a).
   3. Couper l’organe/tissu complet en tranches parallèles équidistantes orthogonal à l’axe longitudinal d’orgue (Figure 3, Figure 5 b). Choisissez une distance d entre deux sections (c.-à-d., l’épaisseur d’intervalle/section sectionnement, habituellement environ 1 cm) suffisamment petites pour recevoir un nombre suffisant de dalles de tissus ou d’organes. Au hasard de positionner la première section à une distance comprise entre 0 et l’intervalle de sectionnement de la marge de l’orgue. Tout en découpage, visuellement juge la position et l’orientation de chaque plan de coupe, pour obtenir approximativement parallèle organe/tissu dalles d’épaisseur à peu près uniforme.
      Remarque : Le nombre de dalles de tissus ou d’organes nécessaires dépend de la forme et la taille de l’organe ou le tissu examiné. Si petits organes ou échantillons doivent être sectionnées en dalles minces de plus de 5 mm, incorporez les échantillons dans la gélose avant incision (Voir l’étape 1.3.3) et utiliser un dispositif technique pour trancher de l’échantillon de gélose incorporé. Des intervalles de sectionnement empiriquement recommandables pour plus porcines organes et tissus, ainsi que des exemples de dispositifs de tranchage, sont indiqués dans les documents supplémentaires de « Tissu d’échantillonnage Guides pour porcin biomédicale modèles »⁷.
   4. Placez toutes les dalles d’organes et de tissus sur la même surface vers le bas sur la base du découpage (c'est-à-dire, toujours sur la droite ou le plan de la section gauche de chaque dalle orgue, Figure 3D, Figure 5) et compter les dalles (n).
   5. Obtenir des profils de section des dalles tissulaire par l’une des approches suivantes :
      1. Placer soigneusement les dalles de tissus sur des transparents en plastique correctement identifiés, tout en maintenant l’orientation de leurs surfaces de section supérieure et inférieure. Tracez les contours de la dalle de tissus sur les plastiques transparents à l’aide d’un stylo imperméable à l’eau (3E de la Figure1-2).
      2. Prenez des images photographiques des dalles tissu, tenant l’appareil verticalement au-dessus des surfaces de section (Figure 3F). Pour l’étalonnage, placez une règle de taille à côté des plaques de tissu.
      3. Scan les dalles de tissu sur un scanner à plat tout en maintenant l’orientation de leurs surfaces de section supérieure et inférieure (Figure 3). Pour l’étalonnage, placez une règle de taille à côté des plaques de tissu.
   6. Mesurer les surfaces des profils section (tracés, photographiée ou scannée) de toutes les dalles de tissu par l’une des approches suivantes :
      1. Superposition ou superposer les profils tracés orgue de dalle avec une taille appropriée, une grille calibrée de croisements équidistants imprimé sur une transparence en plastique et le comte tous les croisements frapper la zone de profil (3E de la Figure3-4; comparez à Figure 5). Calculer l’aire de profil section de chaque dalle orgue en multipliant le nombre de croisements frapper la zone profil de la zone correspondant à une croix.
         Remarque : Pour recevoir le volume suffisamment précis estime, choisissez une grille croisée avec une distance suffisamment fines entre Croix adjacentes, afin qu’une moyenne d’au moins 100 traverse frappera les surfaces de section des dalles d’un orgue dans chacun des cas examinés de l’étude . Tailles de grille Croix empiriquement recommandable pour des organes et des tissus plus porcine sont indiqués dans les documents supplémentaires de « Tissu d’échantillonnage Guides pour porcin biomédicale modèles »⁷.
      2. Mesurer les surfaces des dalles tissulaire dans les images numériques des scans/photos à l’aide disponible dans le commerce ou freeware morphométrie soft - et appropriés applications matérielles (Figure 3 H), comme une image commerciale analyse système²¹, ou ImageJ²².
         ATTENTION : Dalle de tissu remarque que l’un (le premier ou le dernier) est placé sur le scanner reposant sur sa surface naturelle, respectivement, fait face à la caméra avec sa surface naturelle. Donc le numérisée d’image, l’image de cette dalle, ne s’affichent pas une surface de section. Par conséquent, aucun profil de zone de section n’est mesurée à l’image de l’image/photo scannée de cette dalle de tissus (Figure 3I). Remarque aussi de projection trop présents dans les images numérisées et des photographies des dalles d’organes et de tissus, c'est-à-dire, seulement mesurer les surfaces des profils section réelle, mais pas du tissu de l’image se trouvant derrière la surface de section de dalle (Figure 12 G-H).
   7. Calculer le volume de l’orgue estimé comme le produit de la somme de toutes les zones de profil section correspondantes de tous les blocs de tissu par cas (c'est-à-dire, toujours de la droite ou la gauche, respectivement, la surface de section supérieure ou inférieure de chaque organe de dalle et l’épaisseur moyenne des dalles (c.-à-d., le quotient de la longueur mesurée de l’axe vertical orgue (l) et le nombre de dalles)¹⁵.
3. Détermination de l’étendue du retrait des dimensions liées à l’incorporation des tissus lors du traitement des échantillons de tissus pour histologie
   1. Préparer du matériel : Microtome lames, pinces, agar, moules de coulée de métal, scanner numérique et règle de taille (par exemple, papier millimétré).
   2. Couper une surface de section plane frais, auprès d’un échantillon de tissu fixe.
      Remarque : Si à l’aide d’échantillons de facilement déformables () tissus (tissu adipeux, tissus gélatineux), incorporez l’échantillon de tissu fixe dans la gélose avant découpe (Figure 4 a).
   3. Pour incorporer des exemples dans la gélose :
      1. Mélanger la poudre d’agar standard utilisé pour le milieu de culture de microbiologie avec un volume approprié d’eau (environ 0,5 à 1 g agar/10 mL d’eau) dans un bécher en verre. Agiter le mélange et chauffer dans un four à micro-ondes à 700 W jusqu'à ébullition pendant 3 à 5 s. agiter le mélange et faire bouillir à nouveau pour 3 à 5 s.
      2. Éventuellement, pour augmenter le contraste de la gélose à l’échantillon de tissu, teindre la gélose liquide, par exemple, à l’encre noire (Ajouter encre 1 mL à 10 mL d’agar liquide chaud et remuez vigoureusement).
      3. Verser l’agar chaud dans un moule de coulée (p. ex., un moule métallique utilisé pour paraffine déguisant, Figure 10 a-D) et submerger l’échantillon de tissu fixe dans l’agar chaud. Laissez l’agar refroidir jusqu'à solidification, enlever le moule et couper le bloc de gélose avec le tissu incorporé à l’aide d’un microtome ou une lame de rasoir.
         ATTENTION : Lors de la manipulation agar liquide chaud, porter des gants et des lunettes de protection. Des échantillons de tissus de processus fixés en solution de formaldéhyde dans un pot d’échappement hotte et portent des lunettes de protection et des gants de laboratoire.
   4. Placer l’échantillon avec sa surface de section vers le bas sur un scanner à plat, avec une règle de taille et de balayer la surface de la section (Figure 4 aB).
   5. Déterminer l’aire de la surface de la section de l’échantillon de tissu fixe (_f) lors de l’analyse numérique, en utilisant une des techniques décrites dans l’étape 1.2.6 (Figure 4 b).
   6. Incorporer l’échantillon dans le milieu d’inclusion plastique, tels que l’époxy (p. ex., Epon) ou glycolmethacrylate/méthacrylate de méthyle (MMA/GMA)²³, suivant des protocoles standard^23,24,()²⁵ La figure 4). S’assurer que la surface de la section de l’échantillon fixe scanné à l’étape précédente (1.3.4) est maintenue dans l’échantillon de plastique incorporé.
      NOTE : Pour maintenir l’orientation de la surface de la section de l’échantillon au cours du traitement de l’échantillon, toujours placer l’échantillon avec sa surface de section prévue vers le bas dans la cassette d’encastrement ou sur le moule de coulée ou de marquer la section prévue surface (ou l’autre côté de l’échantillon) avec de l’encre.
   7. Couper une coupe histologique du bloc plastique correspondant à la surface de section initiale de l’échantillon de tissu fixe (étape 1.3.2) en utilisant un microtome (Figure 4), monter la section sur une lame de verre (Figure 4) et souiller régulièrement) par exemple, l’hématoxyline et éosine tacher, H & E)^24,25.
      ATTENTION : Pour recevoir une coupe histologique approximativement dans le même plan que la surface de section initiale de l’échantillon de tissu fixe, ajuster soigneusement la position du bloc en plastique dans le bâti du microtome avant découpe.
   8. Placez le chariot avec la section tachée vers le bas sur un scanner à plat avec un dirigeant de la taille et la section (Figure 4E) analyse.
   9. Déterminer l’aire de la section de l’échantillon de tissu plastique-encastré (A_e) lors de l’analyse numérique, en utilisant une des techniques décrites dans l’étape 1.2.6 (Figure 4F).
   10. Calculer le retrait moyen tissulaire liées à enrobage (pour les tissus respectifs et le milieu d’inclusion) des zones mesurées des profils de section correspondante d’échantillons de tissus avant et après incorporation en plastique enrobage moyen. Le facteur de retrait linéaire f_s est calculé comme la racine carrée du quotient des domaines des profils section des échantillons de tissus n après incorporation en plastique enrobage moyen (A,_e) et les domaines de la des profils de section correspondants des mêmes échantillons tissulaires avant l’intégration en plastique enrobage moyen (un_f) (Figure 4)¹⁴.

2. pondéré en volume un échantillonnage aléatoire systématique par Point de comptage et le traitement des tissus sous-échantillons pour différents types d’analyses en aval⁷

1. Préparer du matériel : règle, pied à coulisse, couteau, ciseaux, pinces, stylo imperméable à l’eau, point/Croix grilles imprimés sur des transparents en plastique et les tables de nombre aléatoires.
   NOTE : Modèles de copie pour traverser les grilles (5-60 mm) sont fournis dans les documents supplémentaires de « Tissu d’échantillonnage Guides pour porcin biomédicale modèles »⁷.
2. Placez l’organe/tissu sur une surface plate (base de coupe) et mesurer la longueur (l) de l’organe selon son axe longitudinal (Figure 5, Figure 6 a).
3. Couper l’organe/tissu complet en tranches parallèles équidistantes orthogonal à l’axe longitudinal (Figure 5 b). Choisissez une distance d entre deux sections (c.-à-d., le sectionnement intervalle/section thickness, habituellement environ 1 cm) assez petites pour obtenir un nombre suffisant de tranches de tissus ou d’organes. Au hasard de positionner la première section à une distance comprise entre 0 et l’intervalle de sectionnement de la marge de l’orgue. Tout en découpage, visuellement juge la position et l’orientation de chaque plan de section pour obtenir des dalles d’organe/tissu approximativement parallèles d’épaisseur à peu près uniforme.
   Remarque : Le nombre de dalles de tissus ou d’organes nécessaires dépend de la taille de l’organe/tissu examiné et le nombre d’emplacements de l’échantillon de tissu. Si petits organes ou échantillons doivent être sectionnées en dalles minces de plus de 5 mm, incorporez les échantillons dans la gélose avant incision (Voir l’étape 1.3.3) et utiliser les dispositifs techniques pour trancher de l’échantillon de gélose incorporé. Des intervalles de sectionnement empiriquement recommandables pour les tissus et organes porcins plus, ainsi que des exemples pour le tranchage des dispositifs sont indiqués dans les documents supplémentaires de « Tissu d’échantillonnage Guides pour porcin biomédicale modèles »⁷.
4. Placez toutes les dalles d’organes et de tissus sur la même surface vers le bas sur la base de la coupe (Figure 6 b).
5. Superposition les dalles de tissus avec une grille croisée Fluxsol imprimés sur un plastique transparent en plaçant le plus externe gauche supérieure de croix de la grille au-dessus d’un point au hasard sur le tissu (Figure 5-D, Figure 6 b).
   Remarque : Choisissez une grille croisée avec une distance suffisamment fines entre les croisements adjacentes, ainsi que dans tous les cas examinés de l’étude, au moins deux fois autant de croix va frapper la surface de la section du compartiment du tissu à prélever, comme le nombre d’échantillons qui doivent être tirées de ce compartiment tissulaire. Tailles de grille Croix empiriquement recommandable pour des organes et des tissus plus porcine sont indiqués dans les documents supplémentaires de « Tissu d’échantillonnage Guides pour porcin biomédicale modèles »⁷.
6. Marquer et compter tous les croisements frapper le tissu (respectivement, le tissu secondaire compartiment à échantillonner). Toujours appliquer un mode uniform de comptage et de numérotation des croisements frapper le compartiment tissulaire à échantillonner dans toutes les dalles de tissus, par exemple, par une numérotation consécutive des croix respectives dans chaque ligne par ligne, à partir de la gauche vers la droite et de haut en bas, ou, par exemple, en numérotant les croix dans une dalle de tissu après l’autre dans le sens horaire, à partir de la Croix le plus proche de la position de 12:00, exemplairement démontrée dans Figure 5E.
7. Divisez le nombre de croisements frapper le compartiment/tissu pour être échantillonnée (n) par le nombre d’échantillons doit être généré pour obtenir l’intervalle d’échantillonnage systématique (i).
8. Déterminer la première position d’échantillonnage en choisissant un nombre aléatoire de x dans l’intervalle entre 1 et i. Pour ce faire, utilisez une table de nombres aléatoires. Marquer la première position d’échantillonnage (x) et chaque prochaine x + i, x + 2j’ai, x + 3i, etc., cross frapper le compartiment/tissu à prélever sur la transparence en plastique à l’aide d’un stylo imperméable à l’eau (Figure 5F).
   NOTE : Tables de numéro aléatoires peuvent être facilement et rapidement générés à l’aide d’un générateur de nombres aléatoires en ligne.
9. Marquer le tissu emplacements correspondant à la marque traverse en soulevant légèrement la transparence en plastique et en plaçant un petit morceau de papier propre et vide de confettis sur la surface de la dalle du tissu à l’aide d’une paire de pinces (Figure 5, Figure 6E ).
10. D’accise spécimen de tissu aux endroits échantillonnés (Figure 5 H, 6F Figure, Figure 7 a) et subdiviser davantage pour différents types d’analyses subséquentes (Figure 6, Figure 7 a-B), conformément à la Le tableau 1.
11. Après le prélèvement, nettoyer les transparents en plastique avec l’eau tiède et au savon, sèche et les réutiliser.

3. génération d’uniforme aléatoire isotrope (IUR) Sections et les Sections verticales aléatoire uniforme (RVU) pour des Analyses quantitatives stéréologiques

1. Technique de « Isector »
   1. Préparer du matériel : lames de rasoir ou microtome, agar, moules de coulée sphérique (p. ex., casting de moules pour pralines, qui peuvent être obtenus auprès de fournisseurs de confiseur), foldback pinces et pinces.
   2. Placez un tissu suffisamment taille pièce (1 x 1 x 1 cm³) de fixe, choisi systématiquement au hasard dans un moule de coulée sphériques, tenir ensemble par des colliers foldback et remplissez le moule avec agar liquide chaud (Figure 8 a-E).
   3. Retirez la sphère de la gélose (Figure 8F) le moulage moule après solidification de l’agar.
   4. Rouler la sphère agar avec l’échantillon de tissu incorporé dans l’ensemble de la table, arrêter et il la section à une position aléatoire.
      Remarque : Le plan de section qui en résulte est une section IUR (Figure 8F-G).
   5. Aller de l’avant pour incorporer l’échantillon de tissu dans une résine plastique telles que GMA/MMA, maintenir l’orientation de la section IUR d’avion (voir 1.3.5).
2. Technique de le « Orientation »
   1. Préparer le matériel : lames de rasoir ou microtome, agar, forceps, une ou plusieurs tables nombre aléatoire, impressions de cercles de géométrie et pondérée en fonction du cosinus.
      NOTE : Modèles de copie des cercles sont fournis dans les précédentes publications^8,26.
   2. Placer l’échantillon de tissu fixe (ou de tissu fixe agar-encastré) sur une impression d’un cercle de géométrie avec un bord parallèle au 0-180 ° direction (Figure 9 a, Figure 10F).
   3. Déterminer un angle aléatoire en utilisant la table numéro aléatoire. Trouver les marques correspondantes à l’échelle du cercle géométrie, qui dépend de l’échantillon. L’utilisation de ces marques, couper une section à travers l’échantillon (ou par l’intermédiaire de la gélose entourant l’échantillon de tissu embarqué), avec le plan de section étant orienté parallèles à la direction de l’angle aléatoire indiquée sur l’échelle de la géométrie cercle et vertical à la surface de l’échantillon (Figure 9 b-C, Figure 10F) de repos.
   4. Placer le bloc de tissu avec la surface de section générée à l’étape précédente face à la baisse sur un cercle pondérée en fonction du cosinus avec le bord de la surface de repos placé parallèlement à la direction de 1-1 (Figure 9, Figure 10 H).
   5. Répétez l’étape 3.2.3 et couper une nouvelle section à travers l’échantillon à un angle aléatoire déterminé à l’aide de la table numéro aléatoire (Figure 9 e-F, Figure 10I-J).
      Remarque : Le plan de section qui en résulte est une section IUR.
   6. Le cas échéant, déterminer la surface du profil de l’échantillon de tissu fixe pour la détermination du retrait tissulaire liées à enrobage (Figure 9-J) section IUR tel que décrit à l’étape 1.3 et aller de l’avant pour incorporer l’échantillon de tissu en plastique la résine comme GMA/MMA.
3. Génération des Sections verticales aléatoire uniforme (RVU)
   1. Préparer du matériel : lames de rasoir ou microtome, agar, forceps, une ou plusieurs tables nombre aléatoire et impressions de géométrie cercles.
      NOTE : Modèles de copie des cercles sont fournis dans les précédentes publications^8,26.
   2. Définir un axe vertical au sein de l’échantillon de tissu fixe qui est toujours reconnaissable dans l’échantillon/sections au cours des étapes ultérieures.
      Remarque : En général, l’axe vertical de la surface naturelle de l’échantillon de tissu est choisi comme l’axe vertical.
   3. Le cas échéant, intégrer l’échantillon dans la gélose (Figure 11 b).
      Remarque : L’incorporation de l’Agar avant VUR ou IUR-coupes de l’échantillon fixe est généralement recommandé pour les échantillons de petites, minces, fragiles ou douces. Également utiliser agar-incorporation des échantillons pour faciliter le positionnement de l’échantillon VUR sectionné au cours de l’incorporation subséquente de l’échantillon dans un milieu en résine plastique.
   4. Placez l’échantillon sur une impression d’un cercle en géométrie, l’axe vertical étant orientée perpendiculairement au plan de la table de la table/papier (Figure 11).
   5. Couper l’échantillon à un angle aléatoire (déterminé à l’aide d’un tableau de nombre aléatoire) avec le plan de section orthogonale à la table et parallèle à l’axe vertical pour recevoir un plan de section VUR (Figure 11).
   6. Le cas échéant, déterminer la surface du profil de l’échantillon de tissu fixe pour la détermination du retrait liées à enrobage tissu tel que décrit à l’étape 1.3 (à comparer à la Figure 9-J) section IUR et aller de l’avant pour incorporer l’échantillon de tissu dans résines plastiques tels que GMA/MMA.

Résultats

Technique d’immersion pour détermination de la masse de tissus ou d’organes

Figure 12 a -B montre la détermination représentative de la densité et le volume d’un rein de porc en utilisant la technique d’immersion décrite à l’étape 1.1 (Figure 1, Figure 2). Des résultats plus représentatifs des mesures de la ...

Discussion

Génération des collections échantillon biobanque de modèles animaux porcins nécessite des techniques robustes et protocoles pour la détermination des volumes d’organes et de tissus, la génération reproductible de représentant, des échantillons de tissu redondant convenant à un large éventail de Méthodes d’analyse différentes et pour la randomisation de l’orientation des sections d’échantillon pour des analyses quantitatives stéréologiques. Les méthodes décrites dans le présent article sont ada...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Carl Roth GmbH, Germany	Agar (powder), Cat.: 5210.3	Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.
Caliper	Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany	Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902	Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.
Casting molds (metal)	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	Einbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b	Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.
Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm)	n.a.	n.a.	Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles	n.a.	n.a.	Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux´s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm)	Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China	Y10006 and Y10005	Any other type of standard office foldback clamps will do as well.
Forceps (anatomical)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811	Any type of anatomical forceps will do.
Formaldehyde-solution 4%	SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany	Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005	Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.
Graph paper (for calibration)	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514	Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.
Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036	Any kind of glass- or plastic beakers of 5 – 100 ml volume will do.
Laboratory scale(s)	Mettler Toledo GmbH, Gießen, Germany	PM6000	Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do
	Sartorius AG, Göttingen, Germany	BP61S
Microtome blades	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700	Any kind of single-use microtome blades will do.
Morphometry/planimetry software/system	National Institute of Health (NIH)	ImageJ	Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
Zeiss-Kontron, Eching, Germany	VideoplanTM image analysis system	Out of stock
Photo camera	Nikon	D40	Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod  will do.
Plastic transparencies	Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany	Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562	Any (laser)-printable plastic transparency will do.
Random number tables	n.a.	n.a.	Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/
Razor blades	Plano GmbH, Wetzlar, Germany	T5016	Any kind of razor blades will do.
Ruler	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30	Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.
Saline (0.9%)	Carl Roth GmbH, Germany	Natriumchlorid, >99% Cat.: 0601.1	To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20°C.
Scalpel blades	Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germany	BRAUN Surgical blades N°22	Any kind of scalpel blades will do.
Scanner	Hewlett-Packard	hp scanjet 7400c	Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.
Slicing devices	n.a.	n.a.	Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).
Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter)	Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany	Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm	Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)
Thin wire	Basteln & Hobby Schobes, Straßfurth, Germany. www,bastel-welt.de	Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742	Any other kind of thin wire will also do.
Tissue paper	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305	Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.
Waterproof pen	Staedler Mars GmbH & Co KG, Nürnberg, Grmany	Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2	Any other kind of waterproof pen will do as well.