Estratégias de amostragem e processamento de amostras de tecido do Biobanco de suínos modelos biomédicos

Resumo

A aplicação prática e o desempenho dos métodos para geração de amostras representativas de modelos animais suínos para um amplo espectro de análises a jusante em biobanco projetos são demonstradas, incluindo volumetria, amostragem aleatória sistemática, diferencial e processamento de amostras de tecidos para tipos de análises qualitativas e quantitativas de morfológico e molecular.

Resumo

Na pesquisa médica translacional, porcinos modelos constantemente tornaram-se mais populares. Atendendo ao elevado valor de animais individuais, particularmente de porcos geneticamente modificados, modelos e muitas vezes limitado número de animais disponíveis desses modelos, criação de coleções (biobanco) de amostras de tecido adequadamente processados adequado para uma amplo espectro de métodos de análises subsequentes, incluindo análises não especificadas no ponto de tempo de amostragem, representam abordagens significativas para aproveitar ao máximo do valor do modelo de translação. Sobre as especificidades da anatomia porcina, orientações abrangentes recentemente foram estabelecidas para geração padronizada de representante, amostras de alta qualidade de tecidos e órgãos diferentes de suínos. Essas diretrizes são pré-requisitos essenciais para a reprodutibilidade dos resultados e a sua comparabilidade entre diferentes estudos e investigadores. A gravação de dados básicos, como pesos de órgão e volumes, a determinação dos locais de amostragem e do número de amostras de tecido para ser gerado, bem como sua orientação, tamanho, processamento e direções de aparamento, é fatores relevantes determinação da generalização e da usabilidade da amostra para análise morfológica molecular, qualitativa e quantitativa. Aqui, uma demonstração ilustrativa, prática, passo a passo das técnicas mais importantes para a geração de representante, espécime biobanco de múltiplos propósitos de tecidos dos suínos é apresentado. Os métodos descritos aqui incluem a determinação de volumes de órgão/tecido e densidades, a aplicação de um procedimento de amostragem aleatória sistemática volume ponderado para órgãos parenquimatosos por contagem de ponto, determinação do grau de encolhimento de tecido relacionados à incorporação histológica de amostras e geração de amostras aleatoriamente orientadas para análises stereological quantitativas, tais como seções (IUR) isotrópicas uniformes aleatórias geradas pelos métodos "Orientadores" e "Isector" e uniforme vertical seções de (RVU) aleatórias.

Introdução

Em medicina translacional, os porcos são cada vez mais comuns para o uso como animal grande modelos^1,2,3,4,5, devido a várias semelhanças vantajosas entre o suíno e anatomia humana e fisiologia e a disponibilidade de métodos biológicos moleculares estabelecidos, permitindo a geração de adaptados, geneticamente modificado modelos de porco para uma ampla gama de condições de doença^1,4.

No entanto, em comparação com modelos de roedores, o número de animais de um modelo de porco respectivos que podem ser fornecidos para experiências em qualquer momento é limitado. Isto é devido o intervalo de geração de suíno de cerca de um ano e os esforços financeiros e demorada necessários para a geração de modelos de suínos e criação de animais. Portanto, animais individuais de um modelo de suínos, bem como os exemplos que podem ser gerados a partir destes porcos, são muito valiosos, particularmente se geneticamente modificado modelos suínos e/ou a longo prazo problemas experimentais (por exemplo, complicações tardias de doenças crônicas) são examinadas em indivíduos envelhecidos^2,6,7.

No decurso de qualquer estudo, desempenho de análises adicionais, que não tinha sido prevista no projeto inicial do estudo experimental pode mais tarde tornar-se relevante, por exemplo, para endereço distintas questões decorrentes anteriormente descobertos resultados inesperados. Se amostras adequadas para tais experimentos adicionais não estão disponíveis, desproporcionalmente alto custo e demorada despesas talvez seja necessárias gerar porcos adicionais e amostras de tecido. Para estar preparado para tais eventualidades, geração de biobanco coleções de conservadas amostras de backup de diferentes órgãos, tecidos ou bio-líquidos, quantitativamente e qualitativamente adequados para uma ampla gama de análises posteriores, é considerada uma importante abordagem^2,6,7. Óptimos benefícios derivar um modelo animal de suínos, a disponibilidade de amostras adequadas biobanco também oferece a possibilidade única de realizar um amplo espectro de métodos de análise de diferentes materiais de amostra idêntico ao órgão multi nível na mesma determinados animais, por exemplo, pela distribuição de amostras aos cientistas de diferentes grupos de trabalho organizados em uma rede de pesquisa^2,6,7. Além disso, a estratégia de amostragem ' progressista ' em biobanking também contribui para a redução do número de animais necessários para um estudo. As vantagens do modelo porcina biobanking recentemente foram demonstradas em um órgão multi, multiomics estudo, examinando o órgão conversas cruzadas em um modelo de suínos geneticamente modificado de longo prazo de diabetes mellitus, usando amostras a partir de Munique MIDY porco biobanco ².

Existem alguns requisitos obrigatórios biobanco amostras geralmente devem cumprir para estabelecer a confiabilidade e interpretabilidade dos resultados das análises realizadas posteriormente. As amostras devem ser geradas reproducibly, e devem ser adequadamente representante, isto é, refletindo as características morfológicas e moleculares interessadas do órgão/tecido as amostras foram colhidas de⁷. Para ser apropriado para uma ampla gama de tipos de análise a jusante, as amostras devem ser tomadas em quantidades suficientes e processadas de acordo com as exigências (incluindo condições de tempo e temperatura) dos diferentes métodos analíticos, incluindo descritivo análises histopatológicas, tais como cryohistology, parafina e histologia plástica, imuno-histoquímica, hibridação in situ , análises microscópicas de elétron ultraestrutural e análises de diagnóstico de laboratório clínico, bem como moleculares análises de DNA, RNA, proteínas e metabólitos.

Para permitir a avaliação de uma vasta gama de distintos parâmetros morfológicos quantitativos como números, volumes, comprimentos ou áreas de superfície de estruturas distintas de tecido por análises quantitativas de stereological, randomizada seção aviões do amostras histológicas dos respectivos órgãos/tecidos precisam estar preparados^7,8,9,10,11. Em estudos quantitativos morfológicos, a determinação precisa do volume total do tecido, órgão ou compartimento do órgão, as amostras foram retiradas (ou seja, o espaço de referência) é de importância crucial^{7,9 , 12} para calcular as quantidades absolutas dos parâmetros dentro do respectivo órgão, tecido ou organismo interessados. Eventualmente, o efeito de encolhimento de tecidos relacionados com incorporação durante a preparação de cortes histológicos tem de ser determinado e tidos em conta¹³. Portanto, análises stereological quantitativas, especialmente das amostras arquivadas (fixada amostras de tecido, tecido incorporado blocos, cortes histológicos, etc.) dos estudos anteriores são, por vezes, severamente limitada ou mesmo impossível¹², particularmente se a volumetria dos respectivos órgãos/tecidos não foi realizada, se não há projetos de amostragem adequado foram aplicados para mandado de amostras representativas, se os números e quantidades de amostras individuais disponíveis são insuficientes, ou se o tratamento da amostras é incompatível com a estimativa do quantitativo de parâmetros morfológico de interesse. Devido aos múltiplos fatores influenciam possíveis, a adequação dos materiais de arquivo-amostra para análises de parâmetros morfológicos quantitativos distintos inequivocamente não pode ser respondida, mas depende da avaliação criteriosa de cada caso.

Assim, como a localização, tamanho, número, processamento, direção de aparar e orientação de amostras potencialmente irão afectar os resultados das análises subsequentes, esses fatores são de grande importância e devem ser considerados no projeto experimental de qualquer estudo. No que se refere estes aspectos e as particularidades da anatomia porcina, orientações de amostragem abrangente, detalhado e em grande escala recentemente foram estabelecidos modelos animais adaptados para suínos, fornecendo uma referência robusta para padronizado, reprodutível e eficiente geração de amostras redundantes, adequadamente processadas, alta qualidade de mais de 50 diferentes porcina órgãos e tecidos^6,7.

As descrições metodológicas e o tutorial em vídeo mostrado no presente artigo fornecem detalhadas, ilustrativos, compreensível, passo-a-passo as instruções para desempenho prático de uma variedade de técnicas de volumetria, colheita de amostras de tecidos de suínos e órgãos e processamento de amostras de tecido para métodos diferentes de análise a jusante. As técnicas de destaque incluem métodos para determinação de volumes de órgão/tecido e densidades, baseadas nos princípios de Arquimedes e Cavalieri⁹, incluindo a determinação das dimensões do encolhimento tridimensional de tecido relacionadas com o incorporação em diferentes encastre mídia¹⁴ durante o processamento para exame histológico, aplicação do praticável volume ponderado sistemática amostragem aleatória se aproxima, processamento de amostras de amostra para diferentes subsequentes análises^7,8,9,15e geração de devidamente orientado e processadas amostras para análises quantitativas de stereological potenciais^{7,8, 9,10,11}. Ao lado de sua aplicação em projetos de suínos biobanco, os métodos comprovados são geralmente apropriados para todos os estudos examinando Propriedades quantitativas de histo-morfológica de órgãos/tecidos. Além disso, projetos de amostragem aleatória sistemática são particularmente benéficos para geração de amostras representativas em experimentos utilizando métodos de análise molecular para detectar alterações de abundância de, por exemplo, RNAs, proteínas ou metabólitos em vários órgãos e tecidos.

Os próximos parágrafos fornecem uma breve introdução a estes métodos, enquanto seu desempenho prático é descrito na seção de protocolo.

Determinação de volumes de órgão/tecido
Determinação de volumes e pesos de órgãos é importante em várias configurações de experimentais, como esses fatores podem indicar alterações, potencialmente relacionadas com experimentalmente examinaram fatores de interesse. O volume total de um órgão/tecido também comumente é necessária para calcular parâmetros quantitativos absolutos, (por exemplo, o número total de células), de densidades de volume numérico stereologically estimado (ou seja, o número de células por unidade de volume de tecido)^7,12. Além de técnicas usando equipamentos técnicos complexos, tais como tomografias computadorizadas, existem basicamente três métodos práticos comumente usados para determinar o volume absoluto de um órgão ou tecido. O volume de um órgão pode ser determinado por "medição volumétrica direta" de acordo com o princípio de Arquimedes, ou seja, a medição do volume de água ou solução salina deslocadas pela estrutura quando completamente submersa. Entretanto, para comparativamente grandes órgãos de suínos, essas abordagens são impraticáveis e propenso a imprecisão, já que exigem grande volumétrico/medição de balões. Mais convenientemente, o volume de um órgão/tecido pode ser calculado a partir de seu peso e densidade^7,12,16, que eficientemente pode ser determinado usando o "método de submersão"^{7,12 ,16} (etapa de protocolo 1.1.). Volumes de órgão/tecido também podem ser estimados utilizando abordagens volumetria baseadas no "princípio de Cavalieri" (1598-1647). Em termos simples, o princípio de Cavalieri afirma, que, se dois objetos são seccionados em planos paralelos a um plano de terra, e os perfis das seções cortam-se os dois objetos no correspondente distâncias desde o plano de chão tem as mesmas áreas, os dois objetos tem o mesmo volume. Assim, o volume de objetos arbitrariamente em forma pode ser calculado como o produto de suas áreas de perfil seção em planos de corte paralelos, igualmente distante e a distância entre os planos de secção. Isto é compreensível, com a seguinte analogia: considere duas pilhas consiste o mesmo número de moedas idênticas são colocadas lado a lado, uma pilha com o enfermeiro de moedas empilhado um sobre o outro, produzindo uma forma cilíndrica de pilha de moedas e o outro pilha de moedas com descentralizado posicionado moedas (Figura 3A). Embora as formas de ambas as pilhas de moedas são diferentes, seus volumes são iguais, desde as áreas das moedas em níveis correspondentes de ambas as pilhas (ou seja, as áreas de perfis de secções paralelas de cortar através de duas pilhas de moedas em distâncias iguais da à terra) são idênticos. Estimativa dos volumes de suínos órgãos e tecidos, usando o Cavalieri princípio^7,12,15 é descrita na etapa 1.2.

Determinação do grau de encolhimento de tecidos relacionado à incorporação histológica
Nas análises de vários parâmetros morfológicos quantitativos medidos em secções histológicas do tecido, o efeito de retração de tecido incorporação relacionados ocorrem durante o processamento para a histologia de tecido deve ser determinada e tidos em conta. O grau de encolhimento relacionados com incorporação de tecido pode ser variável e depende tanto sobre o tecido, seu processamento e a incorporação média^{8,13,17,18,19}. Geralmente, alterações relacionadas com a incorporação do volume de uma amostra de tecido (ou seja, principalmente de encolhimento) ocorrem em todas as três dimensões do espaço e, portanto, afeta todos os parâmetros dimensionais estimados por análises quantitativas de stereological⁸ . Basicamente, o grau de encolhimento de tecidos relacionados com incorporação, expressado como o fator de encolhimento de tecido linear (f_S), pode ser estimado como mostrado na etapa 1.3. e usado para a correção dos parâmetros morfológicos quantitativos (encolhimento-sensível)¹⁴.

Volume ponderado amostragem aleatória sistemática dos órgãos/tecidos
Criação de uma coleção de biobanco de amostras de suínos órgão/tecido, abordagens de amostragem aleatória sistemática volume ponderada como descritas na etapa 2 provaram para ser práticas, economia de tempo e eficientes técnicas para geração de representante, ^7,8,9,15de amostras de tecido de múltiplos propósito.

Geração de seções isotrópico uniforme aleatório e seções verticais uniforme aleatório para análises quantitativas de stereological
Amostras de tecido do Biobanco precisam ser apropriado para uma ampla gama de métodos de análise stereological quantitativos diferentes para estimativa de um máximo de parâmetros que não pôde ser determinado sem um espécime adequadamente preparado. Quase todos os parâmetros quantitativos de stereological podem ser determinados, usando "isotrópica (independente) uniforme aleatório (IUR) seções"^8,9. Nas seções IUR, a orientação tridimensional do plano de corte da amostra de tecido é aleatório. Isto pode ser conseguido por randomização da posição da amostra de tecido em relação à posição do avião seção, como aplicado na "Isector" método¹¹ (passo 3.1 do protocolo), ou por randomização da orientação do plano relativo a secção a amostra de tecido, como o método de "Orientadores"¹⁰ (passo 3.2 do protocolo). Em amostras de tecidos, tais como pele ou mucosa espécime exibindo um eixo vertical naturalmente presente, ou definido e devidamente identificável, preparação de "vertical uniforme aleatório (RVU) seções" (etapa de protocolo 3.3.) estritamente seccionado dentro do plano de sua eixo vertical é vantajoso^8,20. Para um discurso completo dos fundamentos teóricos da amostragem de IUR/RVU e uma discussão abrangente de potenciais a jusante análises quantitativas de stereological, o leitor interessado é referido nos livros de stereology quantitativa na vida Ciências^8,9.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui usam amostras de tecido derivadas de animais mortos e em total conformidade com os regulamentos legais alemãs do bem-estar animal.

1. a volumetria

1. Técnica de submersão para a determinação das densidades de tecido/órgão (Figura 1 e Figura 2) ^{7 , 12 , 16}
   1. Preparar materiais: bisturi lâminas, toalhas de papel, pinça fina, balanças de laboratório padrão, vidro ou copos de plástico, soro fisiológico a 0,9% e suportes de construção própria amostra (Figura 2A).
   2. Impostos especiais de consumo um pedaço de tecido (tamanho máximo: 2 x 2 x 2 cm³) do órgão/tecido, especificamente do compartimento do órgão de interesse. Pequenos órgãos, como a hipófise, ou glândula pineal, são medidos em toto.
      Cuidado: Certifique-se que o tamanho da amostra é notavelmente menor do que o diâmetro interno do copo (passo 1.1.5 e segs.) e seu nível de enchimento, para permitir a completa imersão da amostra sem contato com as paredes internas do copo na etapa 1.1.7.
   3. Limpe cuidadosamente a amostra com uma toalha de papel para remover o excesso de sangue/tecido fluido.
   4. Pesar a amostra em uma escala de precisão e registar o peso da amostra (m_S). Determine o peso das amostras pequenas a mg (figura 1A).
   5. Coloca um copo cheio com soro fisiológico a 0,9% temperatura na escala. Não encha completamente o copo, para permitir uma submersão da amostra de tecido na etapa subsequente sem transbordar.
      Atenção: Utilize um tamanho de copo apropriado para o tamanho e peso da amostra de tecido a ser medido e a faixa de medição eficaz da escala. Para amostras maiores até 2 x 2 x 2 cm³, um tamanho do copo de 50 – 100 mL é adequado em combinação com uma escala de medição de aproximadamente 100 mg de 500g, enquanto para pequenas amostras, usar copos de vidro de 5 a 10 mL em combinação com balanças de precisão com de medição varia entre cerca de 0,1 mg e 20 g.
   6. Submergi o porta-amostras (ou seja, um loop suficientemente rígido de arame fino ou algo semelhante, Figura 2A) em solução salina para uma posição marcada (setas na figura 1B, Figura 2Be Figura 2). Em seguida, redefina (Tara) a exibição da escala a zero.
   7. Cuidadosamente, anexar a amostra de tecido para porta-amostras e mergulhe completamente a amostra em solução salina até atingir a posição marcada no porta-amostra (setas na figura 1B, Figura 2Be Figura 2).
      Atenção: A amostra submersa e o titular da amostra não devem ter contato com as paredes internas ou o fundo do copo ou da superfície da solução salina.
   8. Mantendo o porta-amostras e a amostra submersa nessa posição, gravar o peso exibido na escala (m_L), referindo-se ao peso de soro deslocado pela amostra de tecido (Figura 1 C, Figura 2B, e A Figura 2).
   9. Calcular o volume da amostra (V_S) de m_Le a densidade do soro fisiológico em temperatura ambiente (20 ° C) (_{solução salina} ρ = 1,0048 g/cm ³) como V_S = m_L/ Ρ_salina [g/g/cm ³] (Figura 1).
   10. Calcular a densidade da amostra de tecido (ρ_amostra) do peso da amostra (m_S) e seu volume (V_S) (ou seja, em massa): ρ_amostra = m _S /V_S[g/cm ³] (Figura 1).
   11. Para órgãos medidos em toto, repita a medição três vezes e calcular a densidade do órgão média de valores de medição. Para grandes órgãos/tecidos, realizar medições repetidas com diferentes amostras do mesmo órgão/tecido/órgão compartimento e calcular a densidade média de medições simples, em conformidade.
   12. Calcule o volume total do compartimento de órgão/tecido/órgão de seu peso e densidade (Figura 1).
2. Aplicação do Cavalieri-método para determinação de Volumes de órgãos suínos ⁷
   1. Preparar materiais: régua, paquímetro, faca, tesoura, pinça, caneta impermeável, transparências de plástico, scanner, foto câmera e grades cruzadas impressos em transparências de plástico.
   2. Colocar o órgão/tecido inteiro sobre uma superfície lisa (base de corte) e medir o comprimento (l) do órgão ao longo do eixo longitudinal (Figura 3B, Figura 5A).
   3. Corte o órgão/tecido completo em fatias paralelas equidistantes ortogonais ao eixo longitudinal do órgão (Figura 3, Figura 5B). Escolha uma distância d entre duas seções (ou seja, a espessura de corte intervalo/seção, geralmente aproximadamente 1 cm) suficientemente pequenas para receber um número suficiente de tecido/órgão lajes. Aleatoriamente, posicione a primeira seção dentro de uma distância entre 0 e o intervalo de corte da margem do órgão. Ao corte, juiz visualmente a posição e orientação de cada plano de corte, para obter aproximadamente paralelo órgão/tecido lajes de espessura mais ou menos uniforme.
      Nota: O número necessário de placas de tecido/órgão varia de acordo com a forma e o tamanho do órgão/tecido examinado. Se pequenos órgãos ou amostras precisam ser seccionado em placas finas de ≤ 5 mm, incorporar as amostras em ágar antes da corte (consulte a etapa 1.3.3.) e usar um dispositivo técnico para corte da amostra incorporado no ágar. Empiricamente recomendáveis intervalos de corte para tecidos e órgãos mais suínos, bem como exemplos de dispositivos de corte, são indicados no Material complementar de ""tecido amostragem guias para suínos biomédica modelos⁷.
   4. Coloque todas as lajes de órgão/tecido na mesma superfície voltada para baixo sobre a base de corte (ou seja, consistentemente sobre o direito ou o plano de corte à esquerda de cada laje do órgão, a Figura 3D, Figura 5) e contar as lajes (n).
   5. Obter perfis de seção das placas de tecido por uma das seguintes abordagens:
      1. Coloque cuidadosamente as lajes de tecido em transparências de plástico devidamente rotuladas, mantendo a orientação de suas superfícies superior e inferior da seção. Traçar os contornos das placas tecido sobre as transparências de plástico usando uma caneta à prova d'água (Figura 3E1-2).
      2. Com imagens fotográficas de lajes o tecido, segurando a câmera na vertical acima as superfícies de seção (Figura 3F). Para a calibração, coloque uma régua de tamanho próximo as lajes de tecido.
      3. Digitalize as lajes de tecido em um scanner de mesa, mantendo a orientação de suas superfícies superior e inferior da seção (Figura 3). Para a calibração, coloque uma régua de tamanho próximo as lajes de tecido.
   6. Medir as áreas dos perfis de seção (rastreados, fotografados ou digitalizadas) de todas as lajes de tecido por uma das seguintes abordagens:
      1. Sobreposição ou sobrepor os perfis de laje de órgão rastreados com uma grade de tamanho adequado, calibrado de cruzes igualmente espaçados, imprimido em uma transparência do plástica e contar tudo atravessa atingindo área de perfil (Figura 3E3-4; comparar com Figura 5). Calcule a área de seção de perfil de cada laje órgão multiplicando o número de cruzes, atingindo a área de perfil pela área correspondente a uma cruz.
         Nota: Para receber volume suficientemente precisa estima, escolher uma grade cruzada com uma distância suficientemente pequena entre cruzes adjacentes, para que uma média de pelo menos 100 cruza baterá as superfícies de seção das placas de um órgão em cada caso examinado do estudo . Tamanhos de grade Cruz empiricamente recomendável para tecidos e órgãos mais suínos são indicados no Material complementar de ""tecido amostragem guias para suínos biomédica modelos⁷.
      2. Medir as áreas das placas tecido nas imagens digitais das varreduras/fotos usando apropriado disponível comercialmente ou freeware morfometria macio - e aplicações de hardware (Figura 3 H), como uma imagem comercial análise sistema²¹, ou ImageJ²².
         Cuidado: A laje de tecido nota que um (o primeiro ou o último) é colocado no scanner descansando em sua superfície natural, respectivamente, enfrenta a câmara com sua superfície natural. Portanto, o digitalizada da imagem, a imagem da foto desta laje, não mostrará uma superfície de seção. Portanto, nenhum perfil de área de secção é medido na imagem digitalizada da imagem/foto desta laje de tecido (Figura 3I). Também nota projeção excessiva presentes em imagens digitalizadas e fotografias de lajes de órgão/tecido, ou seja, somente medir as áreas dos perfis de seção real, mas não do tecido na imagem do outro lado da superfície de seção de laje (Figura 12 G-H).
   7. Calcular o volume estimado de órgãos como o produto da soma de todas as áreas de perfil seção correspondente de todas as lajes de tecido por caso (isto é, consistentemente à direita ou à esquerda, respectivamente, a superfície da seção superior ou inferior de cada órgão da laje e a espessura média das lajes (ou seja, o quociente do comprimento medido do eixo vertical do órgão (l) e o número de lajes)¹⁵.
3. Determinação do grau de encolhimento de tecido tridimensional relacionados com incorporação durante o processamento de amostras de tecidos para a histologia
   1. Preparar materiais: lâminas micrótomo, fórceps, ágar, moldes de fundição de metais, scanner digital e régua de tamanho (por exemplo, papel milimetrado).
   2. Corte uma fresco, superfície de seção de avião de uma amostra de tecido fixo.
      Nota: Se usando amostras de facilmente deformáveis () moles (tecido adiposo, tecidos gelatinosos), incorporar a amostra de tecido fixo em agar antes da corte (Figura 4A).
   3. Para incorporar a amostra em ágar:
      1. Misture pó de ágar padrão usado para a Microbiologia de meio de cultura com um volume adequado de água (aproximadamente 0,5-1 g ágar/10 mL de água) num copo de vidro. Agitar a mistura e aquecê-lo em um forno de microondas em 700 W até ferver por 3-5 s. agitar a mistura e leve para ferver novamente por 3 – 5 s.
      2. Opcionalmente, para aumentar o contraste do ágar para a amostra de tecido, tingir o ágar líquido, por exemplo, com tinta preta (Adicionar tinta 1 mL a 10 mL de ágar líquido quente e agite vigorosamente).
      3. Despeje o ágar quente em um molde de fundição (por exemplo, um molde de metal usado para parafina de incorporação, Figura 10A-D) e a amostra de tecido fixo em ágar quente, mergulhe. Deixe o ágar esfriar até solidificação, remover o molde e corte o bloco de ágar com o tecido incorporado usando um micrótomo ou lâmina de barbear.
         Atenção: Durante a manipulação de ágar líquido quente, use luvas e óculos de proteção. Amostras de tecido do processo fixadas em solução de formaldeído sob uma exaustão coifa e usam óculos de proteção e luvas de laboratório.
   4. Colocar a amostra com sua superfície de seção voltada para baixo em um scanner de mesa, juntamente com uma régua de tamanho e escanear a superfície de seção (Figura 4AB).
   5. Determine a área da superfície de seção da amostra de tecido fixo (_f) na varredura digital, usando uma das técnicas descritas no passo 1.2.6 (Figura 4B).
   6. Incorporar a amostra em meio de encastre plástico, tais como epóxi (por exemplo, Epon) ou glycolmethacrylate/metilmetacrilato (GMA/MMA)²³, seguir protocolos padrão^23,24,25 ( A Figura 4). Certifique-se de que a superfície da seção da amostra fixa verificada na etapa anterior (1.3.4) é mantida na amostra de plástico-embutido.
      Nota: Para manter a orientação da superfície de seção da amostra durante o processamento da amostra, consistentemente colocar a amostra com sua superfície de seção pretendido virado para baixo, para a incorporação da fita ou do molde de fundição, ou marcar a seção pretendida superfície (ou do lado oposto da amostra) com tinta.
   7. Cortar uma seção histológica do bloco plástico correspondente à superfície da seção original da amostra de tecido fixo (etapa 1.3.2) usando um micrótomo (Figura 4), montar a seção sobre uma lâmina de vidro (Figura 4) e manchá-la rotineiramente ( por exemplo, hematoxilina e eosina mancham, H & E)^24,25.
      Atenção: Para receber uma seção histológica aproximadamente no mesmo plano que a superfície original da seção da amostra de tecido fixo, ajuste cuidadosamente a posição do bloco de plástico no monte do micrótomo antes de seccionamento.
   8. Coloque o slide com a seção manchada virado para baixo em um scanner de mesa, juntamente com uma régua de tamanho e digitalizar a seção (Figura 4E).
   9. Determine a área da seção da amostra de tecido de plástico-embutido (A_e) na varredura digital, usando uma das técnicas descritas na etapa 1.2.6 (Figura 4F).
   10. Calcule o encolhimento médio relacionados com incorporação de tecido (para o respectivo tecido e incorporação médio) das áreas medidas de perfis de seção correspondente de amostras de tecido antes e após a incorporação em plástico médio de incorporação. O fator de encolhimento linear f_s é calculado como a raiz quadrada do quociente das áreas de perfis de seção de n amostras de tecido após a incorporação em plástico incorporação médio (A_e) e as áreas do perfis de seção correspondente das amostras de tecido mesmo antes da incorporação em plástico incorporação médio (_f) (Figura 4)¹⁴.

2. volume ponderado amostragem aleatória sistemática por ponto contando e processamento de tecido subamostras para diferentes tipos de análise a jusante⁷

1. Preparar materiais: régua, paquímetro, faca, tesoura, pinça, caneta impermeável, ponto/cruz grades impressas em transparências de plástico e tabelas de números aleatórias.
   Nota: Copiar modelos para atravessar grades (5 a 60 mm) são fornecidos no Material complementar de ""tecido amostragem guias para suínos biomédica modelos⁷.
2. Colocar o órgão/tecido sobre uma superfície lisa (base de corte) e medir o comprimento (l) do órgão ao longo do eixo longitudinal (Figura 5A, figura 6A).
3. Corte o órgão/tecido completo em fatias paralelas equidistantes ortogonal ao seu eixo longitudinal (Figura 5B). Escolha uma distância d entre duas seções(ou seja, o intervalo corte/espessura, geralmente aproximadamente 1 cm) pequenas o suficiente para obter um número suficiente de fatias de tecido/órgão. Aleatoriamente, posicione a primeira seção dentro de uma distância entre 0 e o intervalo de corte da margem do órgão. Ao corte, juiz visualmente a posição e orientação de cada plano de corte para obter placas de órgão/tecido aproximadamente paralelo de espessura mais ou menos uniforme.
   Nota: O número necessário de placas de tecido/órgão depende do tamanho do órgão/tecido examinado e o número de locais de amostra de tecido. Se pequenos órgãos ou amostras precisam ser seccionado em placas finas de ≤ 5 mm, incorporar as amostras em ágar antes da corte (consulte a etapa 1.3.3.) e usar dispositivos técnicos para corte da amostra incorporado no ágar. Empiricamente recomendáveis intervalos de corte para tecidos e órgãos mais suínos, bem como exemplos de dispositivos de corte são indicados no Material complementar de ""tecido amostragem guias para suínos biomédica modelos⁷.
4. Coloque todas as lajes de órgão/tecido na mesma superfície voltada para baixo sobre a base de corte (Figura 6B).
5. As lajes de tecido com uma grade de tamanho apropriado Cruz impresso em uma transparência de plástico, colocando-a mais externa de sobreposição que sobraram superior transversal da grade um ponto aleatório fora o tecido (Figura 5-D, Figura 6B).
   Nota: Escolher uma grade cruzada com uma distância suficientemente pequena entre cruzes adjacentes, para que em cada caso examinado do estudo, pelo menos duas vezes tantas cruzes vão bater no que respeita a seção do compartimento de tecido a amostra, como o número de amostras que devem ser retirado naquele compartimento de tecido. Tamanhos de grade Cruz empiricamente recomendável para tecidos e órgãos mais suínos são indicados no Material complementar de ""tecido amostragem guias para suínos biomédica modelos⁷.
6. Marcar e contar todas as cruzes batendo o tecido (respectivamente, o tecido sub compartimento a amostra). Aplicar consistentemente um modo uniforme de contagem e numeração das cruzes atingindo o compartimento de tecido para ser amostrados em todas as lajes do tecido, por exemplo, por numeração consecutiva das respectivas cruzes em cada linha por linha, da esquerda para a direita e de cima para baixo, ou, por exemplo, numerando as cruzes em uma laje de tecido após o outro no sentido horário, começando com a Cruz mais próxima para a posição 12:00, como exemplarily demonstrado na Figura 5E.
7. Divida o número de cruzes, atingindo o compartimento de tecido/tecido para ser incluídos na amostra (n) pelo número de amostras a serem gerados para obter o intervalo de amostragem sistemática (i).
8. Determine a posição de amostragem primeira, escolhendo um número aleatório x no intervalo entre 1 e eu. Para isso, use uma tabela de números aleatórios. Marcar a primeira posição de amostragem (x) e cada próximo x + i, x + 2eu, x + 3i, etc., Cruz atingindo o compartimento de tecido/tecido a amostra sobre a transparência do plástica usando uma caneta à prova d'água (Figura 5F).
   Nota: Tabelas de números aleatórias podem ser convenientemente e rapidamente geradas usando um gerador de números aleatórios on-line.
9. Marca o tecido locais correspondente para o marcado cruza levantando ligeiramente a transparência do plástica e colocar um pequeno pedaço de papel de confete limpo, em branco sobre a superfície da laje tecido usando um par de pinças (Figura 5, Figura 6E ).
10. Amostra de tecido nos locais amostrados (Figura 5 H, Figura 6F, Figura 7A) impostos especiais de consumo e subdividir mais-los para diferentes tipos de análises subsequentes (Figura 6, Figura 7A-B), conforme especificado no Tabela 1.
11. Após a amostragem, limpe as transparências de plástico com água morna e sabão, secar e reutilizá-los.

3. geração de seções isotrópico uniforme aleatório (IUR) e Vertical uniforme aleatório (RVU) seções para análises quantitativas de Stereological

1. Técnica de "Isector"
   1. Preparar materiais: lâminas de barbear ou micrótomo, ágar, moldes de fundição esférico (por exemplo, fundição moldes para bombons, que podem ser obtidos a partir de fornecedores de confeiteiro), foldback grampos e pinças.
   2. Coloque um tecido de tamanho adequado parte (1 x 1 x 1 cm³) fixo, sistematicamente aleatoriamente amostrada em um molde de fundição esférico, segure juntos pela foldback braçadeiras e encher o molde com ágar líquido morno (Figura 8A-E).
   3. Retire a esfera de ágar (Figura 8F) do molde de fundição após a solidificação do ágar.
   4. Rolar a esfera de ágar com a amostra de tecido incorporado através da mesa, parar e seção-lo em uma posição aleatória.
      Nota: O plano de corte resultante é uma seção IUR (Figura 8F-G).
   5. Proceder para incorporar a amostra de tecido em resina plástica como GMA/MMA, mantendo a orientação da seção de IUR de avião (ver 1.3.5).
2. Técnica de "Orientadores"
   1. Preparar os materiais: lâminas de barbear ou micrótomo, ágar, fórceps, (s) de número aleatório, impressões de círculos equiangular e cosseno ponderado.
      Nota: Copiar modelos de círculos são fornecidos em anteriores Publicações^8,26.
   2. Colocar a amostra de tecido fixo (ou de tecido fixo incorporado no ágar) em uma impressão de um círculo equiangular com uma aresta paralela para o 0-180 direção ° (Figura 9A, Figura 10E).
   3. Determine um ângulo aleatório usando a tabela de números aleatória. Encontre as marcas correspondentes à escala do círculo equiangular, que baseia-se a amostra. Usando estas marcas, cortar uma parte através da amostra (ou por meio de agar em torno da amostra de tecido incorporado), com o plano de corte sendo orientado paralela à direção do ângulo aleatório indicada na escala do círculo equiangular e vertical para a superfície da amostra (Figura 9B-C, Figura 10F) a descansar.
   4. Coloque o bloco de tecido com a superfície de seção gerada na etapa anterior, enfrentando a desvantagem em um círculo de cosseno ponderada com a aresta da superfície de descanso colocada paralela à direção de 1-1 (Figura 9, Figura 10 H).
   5. Repita a etapa 3.2.3 e cortar uma nova secção através da amostra em um ângulo aleatório determinado usando a tabela de números aleatória (Figura 9E-F, Figura 10I-J).
      Nota: O plano de corte resultante é uma seção IUR.
   6. Se for o caso, determinar a área do perfil seção IUR da amostra de tecido fixo para determinação do encolhimento a incorporação relacionados ao tecido (Figura 9-J), conforme descrito na etapa 1.3 e prossiga para incorporar a amostra de tecido em plástico resina como GMA/MMA.
3. Geração de seções verticais uniforme aleatório (RVU)
   1. Preparar materiais: lâminas de barbear ou micrótomo, ágar, fórceps, (s) de número aleatório e impressões de círculos equiangular.
      Nota: Copiar modelos de círculos são fornecidos em anteriores Publicações^8,26.
   2. Defina um eixo vertical dentro a amostra de tecido fixo que é sempre reconhecível nas seções a amostra durante as etapas subsequentes.
      Nota: Normalmente, o eixo vertical à superfície natural da amostra de tecido é escolhido como o eixo vertical.
   3. Se for caso disso, incorpore a amostra em ágar (Figura 11B).
      Nota: Ágar-incorporação antes VUR - ou IUR-seccionamento da amostra fixa é geralmente recomendado para amostras pequenas, finas, frágeis ou macias. Também use o ágar-incorporação de amostras para facilitar o posicionamento da amostra VUR seccionada durante a subsequente incorporação da amostra em meio de resina plástica.
   4. Coloca a amostra em uma impressão de um círculo equiangular, com eixo vertical, sendo orientado ortogonalmente ao plano da tabela tabela/papel (Figura 11).
   5. Cortar a amostra em um ângulo aleatório (determinado usando uma tabela de números aleatória) com o plano de corte ortogonal à tabela e paralelo ao eixo vertical para receber um plano de corte de RVU (Figura 11).
   6. Se for o caso, determinar a área do perfil da amostra de tecido fixo para determinação do encolhimento de tecido incorporação-relacionados, conforme descrito na etapa 1.3 (compare a Figura 9-J) seção IUR e proceder para incorporar a amostra de tecido em resina plástica como GMA/MMA.

Resultados

Técnica de submersão para determinação da densidade do tecido/órgão

Figura 12A -B mostra a determinação representativa da densidade e do volume de um rim suíno utilizando a técnica de submersão descrita no passo 1.1 (Figura 1, Figura 2). Resultados mais representativos das medições de densidade de tecidos e órgã...

Discussão

Geração de coleções de amostra biobanco de modelos animais suínos requer técnicas robustas e protocolos para a determinação dos volumes de órgão/tecido, a geração pode ser reproduzida de representante, amostras de tecido redundante apropriadas para uma ampla gama de métodos de análise diferentes e para randomização da orientação das seções de amostra para análises quantitativas de stereological. Os métodos descritos no presente artigo são adaptados para os tamanhos de suínos órgãos e tecidos e f...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Carl Roth GmbH, Germany	Agar (powder), Cat.: 5210.3	Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.
Caliper	Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany	Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902	Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.
Casting molds (metal)	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	Einbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b	Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.
Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm)	n.a.	n.a.	Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles	n.a.	n.a.	Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux´s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm)	Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China	Y10006 and Y10005	Any other type of standard office foldback clamps will do as well.
Forceps (anatomical)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811	Any type of anatomical forceps will do.
Formaldehyde-solution 4%	SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany	Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005	Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.
Graph paper (for calibration)	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514	Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.
Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036	Any kind of glass- or plastic beakers of 5 – 100 ml volume will do.
Laboratory scale(s)	Mettler Toledo GmbH, Gießen, Germany	PM6000	Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do
	Sartorius AG, Göttingen, Germany	BP61S
Microtome blades	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700	Any kind of single-use microtome blades will do.
Morphometry/planimetry software/system	National Institute of Health (NIH)	ImageJ	Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
Zeiss-Kontron, Eching, Germany	VideoplanTM image analysis system	Out of stock
Photo camera	Nikon	D40	Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod  will do.
Plastic transparencies	Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany	Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562	Any (laser)-printable plastic transparency will do.
Random number tables	n.a.	n.a.	Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/
Razor blades	Plano GmbH, Wetzlar, Germany	T5016	Any kind of razor blades will do.
Ruler	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30	Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.
Saline (0.9%)	Carl Roth GmbH, Germany	Natriumchlorid, >99% Cat.: 0601.1	To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20°C.
Scalpel blades	Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germany	BRAUN Surgical blades N°22	Any kind of scalpel blades will do.
Scanner	Hewlett-Packard	hp scanjet 7400c	Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.
Slicing devices	n.a.	n.a.	Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).
Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter)	Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany	Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm	Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)
Thin wire	Basteln & Hobby Schobes, Straßfurth, Germany. www,bastel-welt.de	Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742	Any other kind of thin wire will also do.
Tissue paper	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305	Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.
Waterproof pen	Staedler Mars GmbH & Co KG, Nürnberg, Grmany	Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2	Any other kind of waterproof pen will do as well.