FM-Farbstoff Radfahren an der Synapse: Vergleich hohen Kalium Depolarisation, elektrische und Channelrhodopsin Stimulation

Zusammenfassung

Synaptischen Vesikel (SV) Radfahren ist der Kern-Mechanismus der interzellulären Kommunikation bei neuronalen Synapsen. FM-Farbstoff-Aufnahme und Veröffentlichung sind die Primärmittel des quantitativ prüfen SV Endo- und Exozytose. Hier vergleichen wir alle stimulationsmethoden FM1-43 Radfahren an der Drosophila neuromuskulären (NMJ) Modell Synapse zu fahren.

Zusammenfassung

FM-Farbstoffe werden verwendet, um die synaptischen Vesikel (SV)-Zyklus zu studieren. Diese amphipathische Sonden haben einen hydrophilen Kopf und hydrophoben Schweif, so dass sie mit der Fähigkeit, reversibel betreten und verlassen der Membran Lipid Bilayer wasserlöslich. Diese Styryl-Farbstoffe sind relativ nicht fluoreszierenden in wässrigen Medium, aber Einfügung in die äußeren Broschüre der Plasmamembran verursacht einen > 40 X Anstieg der Fluoreszenz. In neuronalen Synapsen sind FM Farbstoffe beim SV Endozytose, verschleppte sowohl innerhalb als auch zwischen SV Pools, und veröffentlichte mit SV Exozytose, bietet ein leistungsstarkes Tool zur Visualisierung der präsynaptischen Stadien der Neurotransmission verinnerlicht. Einen primären genetischen Modell von glutamatergen Synapsen Entwicklung und Funktion ist der Drosophila neuromuskulären Synapse (NMJ), wo FM färben Bildgebung weitgehend verwendet worden ist, SV Dynamik in einer Vielzahl von mutierten Bedingungen zu quantifizieren. NMJ synaptischen Terminals ist leicht zugänglich, mit einer schönen Auswahl an großen synaptischen Boutons ideal für imaging-Anwendungen. Hier, wir vergleichen und kontrastieren die drei Möglichkeiten zur Förderung der Drosophila NMJ aktivitätsabhängige FM1-43 Farbstoff Aufnahme/Entlassung zu fahren: (1) Bad Anwendung hoher [K⁺] zu depolarisieren neuromuskuläre Gewebe, 2) Saug-Elektrode motorischen Nerven Anregung zu depolarisieren den präsynaptischen Nerv Klemme, und 3) gezielte transgene Ausdruck Channelrhodopsin Varianten für Licht angeregt, räumliche Kontrolle der Depolarisation. Jede dieser Methoden hat vor- und Nachteile für die Untersuchung der genetischen Mutation Auswirkungen auf die SV-Zyklus bei Drosophila NMJ. Wir besprechen diese vor- und Nachteile, die Auswahl der Stimulation Ansatz, zusammen mit den Methoden, die spezifisch für jede Strategie zu unterstützen. Neben fluoreszierende Bildgebung können FM Farbstoffe Photoconverted Elektron-Dichte Signale mit Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM), um SV Zyklus Mechanismen Ultrastrukturforschung Ebene zu studieren visualisiert werden. Wir bieten die Vergleiche der konfokalen und Elektronenmikroskopie imaging aus den verschiedenen Methoden der Drosophila NMJ Stimulation zu helfen die Auswahl der zukünftigen experimentelle Paradigmen.

Einleitung

Die wunderschön gekennzeichnet Drosophila larvalen neuromuskulären (NMJ) glutamatergen Synapse Modell hat Untersuchung Synapse Bildung und Funktion mit einem weiten Spektrum von genetische Störungen¹verwendet. Das Motoneuron-Terminal besteht aus mehreren Axon Verzweigungen, jeweils mit vielen erweiterten synaptischen Boutons. Diese geräumigen Krampfadern (bis zu 5 µm im Durchmesser) enthalten alle die Neurotransmission Maschinen, einschließlich einheitliche glutamatergen synaptischen Vesikel (SVs; ~ 40 nm im Durchmesser) in cytosolischen Reserve und leicht lösbaren Becken². Diese Bläschen dock an der präsynaptischen Membran Fusion Website aktive Zonen (AZs), wo Exozytose die Glutamat-Neurotransmitter-Freigabe für Trans vermittelt-synaptische Kommunikation. Anschließend werden die SVs für wiederholte Exo/Endozytose Zyklen aus der Plasmamembran über recycling-Kiss-and-Run oder Clathrin-vermittelte Endozytose (CME) abgerufen. Die Drosophila NMJ ist leicht zugänglich und gut geeignet für Isolierung und Charakterisierung von SV Zyklus Mutanten. Mit vorwärts genetischer Bildschirme, führten neue Mutationen zur Identifizierung neuer Gene entscheidend für die SV-Zyklus³. Darüber hinaus haben reverse gentechnische Ansätze beginnend mit bereits bekannten Genen, die Aufklärung des neuen SV-Zyklus-Mechanismen durch die sorgfältige Beschreibung der Mutant Radfahren Phänotypen⁴geführt. Die Drosophila NMJ ist nahezu ideal als experimentelle synaptischen Vorbereitung für SV Endozytose und Exozytose Mechanismen über Methoden, um optisch Track Vesikel Radfahren während Neurotransmission sezieren.

Eine Reihe von fluoreszierenden Marker ermöglichen visuelle Verfolgung von Vesikeln während des Radfahrens Dynamik, aber das vielseitigste sind FM-Farbstoff-Analoga, die zuerst von Mao, F., Et al.synthetisiert wird. ⁵. strukturell FM Farbstoffe enthalten einen hydrophilen Kopf und einen lipophilen Schweif, verbunden durch einen aromatischen Ring mit einem Mittelbereich spektrale Eigenschaften verleihen. Diese Styryl Farbstoffe in Membranen reversibel zu partitionieren, nicht "flip-flop" zwischen Membran Flugblätter und so sind nie frei in das Zytosol, und sind weit mehr fluoreszierend in Membranen als Wasser⁵. Reversible Einfügung in ein Lipid Bilayer bewirkt eine 40-fold Fluoreszenz-⁶. Bei neuronalen Synapsen bestehen classic FM Farbstoff Kennzeichnung Experimente aus Baden die synaptische Vorbereitung mit dem Farbstoff während depolarisierende Stimulation Farbstoff über SV Endozytose geladen. Externen Farbstoff ist dann weggespült und der SV-Zyklus ist ein Kalzium-freien Ringer-Lösung geladen Synapsen⁷Image verhaftet. Eine zweite Runde der Stimulation in einem Farbstoff-frei Bad löst FM durch Exozytose, ein Prozess, der verfolgt werden kann, durch die Messung der Fluoreszenz Intensität verringern. SV-Populationen aus einem einzigen vesikels zu Pools mit Hunderten von Vesikeln können quantitativ überwachten^6,7sein. FM-Farbstoffe wurden aktivitätsabhängige Mobilisierung von funktionell unterschiedliche SV-Pools zu sezieren, und Kiss-and-Run vs. Radfahren^8,9CME vergleichen verwendet. Die Methode wurde geändert, um separat Assay hervorgerufen, spontane und Miniatur synaptischen Zyklus Aktivitäten (mit hochsensiblen Geräten sehr kleine Fluoreszenz Veränderungen erkennen und reduzieren Immunofluoreszenz)¹⁰. Assays der Ultrastrukturforschung Ebene durch Photoconverting das Fluoreszenzsignal FM in ein Elektron-Dichte Label für Transmission Electron Microscopy^{11,12,13,14 erweiterbar auf} .

Historisch, Baden synaptischen Vorbereitungen in einer hohen Konzentration von Kalium (nachstehend als "hoch [K⁺]" genannt) wurde die Methode der Wahl für depolarisierende Stimulation um SV Radfahren induzieren; von der Frosch cholinerge NMJ-⁵, bis hin zu kultiviert Nagetier Gehirn hippocampal Neuronen¹⁵, bis die Drosophila glutamatergen NMJ Modell^16,17. Dieser hohe [K⁺] Ansatz ist einfach, erfordert keine spezielle Ausrüstung und ist daher für die meisten Labors zugänglich, aber hat Einschränkungen für die Anwendung und Interpretation der Daten. Eine viel mehr physiologisch angemessene Methode ist mit Saug-Elektrode elektrische Stimulation des Nervs^4,5,12. Dieser Ansatz treibt Aktionspotential Vermehrung zur direkten Stimulation des Nervus präsynaptischen terminal und Ergebnisse können direkt gegenüber elektrophysiologische Tests der Neurotransmission Funktion^{13,14, 15}, sondern erfordert spezialisierte Ausrüstung und ist technisch wesentlich schwieriger. Mit dem Aufkommen der optogenetik hat die Verwendung von Channelrhodopsin neuronale Stimulation zusätzliche Vorteile, einschließlich enge räumlich-zeitliche Begrenzung der Kanal-Ausdruck mit Hilfe der binären Gal4/UAS-System²⁰. Dieser Ansatz ist technisch einfacher als Saug-Elektrode Stimulation und erfordert nichts weiter als eine sehr billige LED-Lichtquelle. Hier beschäftigen wir Bildgebung FM1 / 43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) pyridiniumdichromat Dibromide) zu sowohl vergleichen und diese drei verschiedenen stimulationsmethoden bei Drosophila NMJ: einfach hoch [K⁺ ], anspruchsvolle Elektro- und neue Channelrhodopsin Ansätze.

Protokoll

1. Larvenstadium Kleber Dissektion

1. Mischen Sie 10 Teile des Silikon-Elastomer-Basis mit 1 Teil des Silikon-Elastomer Härtemittel aus Elastomer-Kit (Table of Materials).
2. 22 x 22 mm Glasdeckgläser mit Elastomer und Heilung auf einer heißen Platte bei 75 ° c für mehrere Stunden (bis nicht mehr klebrig anfühlen) zu beschichten.
3. Legen Sie ein einziges Elastomer-beschichtete Glas-Deckglas in maßgeschneiderte Plexi Glas Dissektion Kammer (Abbildung 1, unten), in Vorbereitung auf die Larven Dissektion.
4. Bereiten Sie die Kleber-Pipetten aus Borosilikatglas Kapillare mit einem standard Mikroelektrode Abzieher zu erhalten die gewünschte Verjüngung und Düsengröße.
5. Sanft brechen Sie die Mikropipette Spitze und am anderen Ende, fügen Sie 2 ft von flexiblen Kunststoffschlauch (1/32" Innendurchmesser, ID 3/32" Außendurchmesser OD; 1/32" Wand; Tabelle der Materialien) mit Mund passend (P2-PIPETTENSPITZE).
6. Füllen Sie einen kleinen Behälter (0,6 mL Eppendorf Tube GAP) mit einem kleinen Volumen (~ 20 µL) des Klebers (Table of Materials) in Vorbereitung auf die Larven Dissektion.
7. Füllen Sie die Kammer mit Kochsalzlösung (in mM): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl₂1 CaCl₂, 70 Saccharose und 5 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic Säure (HEPES) pH 7,2.
8. Fügen Sie Anti-Meerrettich Peroxidase (HRP) Antikörper konjugiert, Alexa Fluor 647 (Anti-HRP:647; verdünnter 01:10 aus einem Bestand von 1 mg/mL) für die Kennzeichnung der NMJ präsynaptischen Terminal während Dissektion^21,22.
9. Mit einem feinen Pinsel (Größe 2), entfernen Sie eine wandernde dritte Instar aus der Lebensmittel Durchstechflasche und setzen auf das Deckglas Elastomer beschichtet.
10. Füllen Sie den Glas Mikropipette Tipp mit einem kleinen Volumen des Leims mit Unterdruck erzeugt, durch den Mund mit Anhang (Schritt 1.5).
11. Stellung Larve dorsalen Seite nach oben mit Zange und Leim, den Kopf auf die Elastomer-Beschichtung Deckglas mit einem kleinen Tropfen Kleber mit positiver Luftdruck durch den Mund.
12. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem hinteren Ende des die Larve, die dafür sorgen, dass das Tier gestreckt wird straff zwischen die zwei Kleber-Anlagen.
13. Mit einer Schere (Messer 3 mm; Tabelle der Materialien), machen Sie einen horizontalen Schnitt (~ 1 mm) am Hinterteil und einem vertikalen Schnitt entlang der dorsalen Mittellinie.
14. Mit feinen Pinzette (#5, Tabelle der Materialien), sanft entfernen dorsalen Luftröhre, Darm, dicken Körper und andere innere Organe für die Muskulatur.
15. Wiederholen Sie für die vier Körperwand Klappen, und achten Sie auf sanft die Körperwand sowohl horizontal als auch vertikal dehnen kleben.
16. Heben Sie den ventralen Nervenstrang (VNC) mit Pinzette, schneiden Sie die motorischen Nerven vorsichtig mit der Schere aus und dann entfernen Sie vollständig zu die VNC.
17. Ersetzen Sie die Dissektion Kochsalzlösung mit Ca^{2 +}-freie Kochsalzlösung (identisch mit der oben genannten Dissektion Kochsalzlösung ohne CaCl₂), SV stoppen Radfahren.

2. Option 1: High [K⁺] FM Farbstoff be-

1. Fügen Sie aus einem FM1-43-Stammlösung (4 mM) 1 µL bis 1 mL 90 mm KCl-Lösung (hoch [K⁺] in Dissektion Kochsalzlösung) für eine Endkonzentration von 4 µM hinzu.
2. Mit einer Pipette ersetzen die Ca^{2 +}-kostenlose Kochsalzlösung in der bildgebenden Kammer mit der hohen [K⁺] FM Farbstofflösung, SV Endozytose Farbstoff Aufnahme zu stimulieren.
3. Starten Sie sofort eine digitale Zeitschaltuhr für die vorher festgelegten Dauer des hohen [K⁺] depolarisierende stimulationsdauer (zB., 5 min; ( Abbildung 2).
4. Um eine gesunde Larven Vorbereitung bestätigen, beachten Sie die starke Kontraktionen der Muskulatur für die Dauer des hohen [K⁺] Depolarisation.
5. Nach Ablauf die Timer-Zeit schnell die hohe [K⁺] FM Farbstofflösung entfernen und ersetzen Sie mit Ca^{2 +}-kostenlose Kochsalzlösung, SV stoppen Radfahren.
6. Waschen in rascher Folge mit dem Ca^{2 +}-frei Kochsalzlösung (5 X 1 min.), gewährleisten die hohe [K⁺] FM Farbstofflösung wird vollständig entfernt.
7. Halten Sie die Larven Vorbereitung in frisch Ca^{2 +}-kostenlose Kochsalzlösung für die unmittelbare Bildgebung mit der konfokalen Mikroskop.

(3) Imaging: Konfokale Mikroskopie

1. Verwenden Sie eine aufrechte confocal Mikroskop mit einem 40 X Wasser eintauchen soll Bild NMJ Farbstoff Fluoreszenz (andere Mikroskope können verwendet werden).
2. Bild Muskel 4 NMJ Abdominalsegmente 2-4 (andere NMJs können abgebildet werden) und sammeln Bilder mittels geeigneter Software (Table of Materials).
3. Benutzen Sie einen HeNe 633 nm Laser HRP:647 (mit lang-Pass-Filter > 635 nm) sowie ein Argon 488 nm Laser FM1-43 (mit Bandpass Filter 530-600 nm) begeistern zu begeistern.
4. Operativ bestimmen Sie optimale Gain und Offset für beide Kanäle.
   Hinweis: Diese Einstellungen bleibt konstant, während der Rest des Experiments.
5. Nehmen Sie einen konfokalen Z-Stapel durch die gesamte ausgewählte NMJ von HRP markiert oben nach unten des synaptischen Terminals.
6. Beachten Sie vorsichtig den NMJ abgebildet (Segment, Seite und Muskeln) um überschüssige, die exakt gleichen NMJ sicherzustellen, nachdem FM färben entladen.

4. High [K⁺] Stimulation: FM Farbstoff entladen

1. Ersetzen Sie Ca^{2 +}-kostenlose Kochsalzlösung mit hohen [K⁺] Kochsalzlösung (ohne FM1-43 Farbstoff), Laufwerk Depolarisation, SV Exozytose und Dye-Release.
2. Sofort eine digitale Zeitschaltuhr für den vorab festgelegten Dauer der hohen [K⁺] Stimulation (zB., 2 min; ( Abbildung 2).
3. Nach Ablauf die Timer-Zeit sofort die hohe [K⁺] Kochsalzlösung zu entfernen und ersetzen Sie durch Ca^{2 +}-kostenlose Kochsalzlösung, SV stoppen Radfahren.
4. Waschen in rascher Folge mit Ca^{2 +}-frei Kochsalzlösung (5 X 1 min.), gewährleisten die hohe [K⁺] Kochsalzlösung wird vollständig entfernt.
5. Halten Sie die Larven Vorbereitung in frisch Ca^{2 +}-kostenlose Kochsalzlösung für die unmittelbare Bildgebung mit der konfokalen Mikroskop.
6. Seien Sie sicher, die FM1-43 Farbstoff Fluoreszenz bei der gleichen NMJ erwähnt mit den gleichen Einstellungen konfokalen Bild.

5. Option 2: Elektrische Stimulation FM Farbstoff be-

1. Vorbereiten einer saugen Pipette mit der Mikroelektrode Abzieher (Table of Materials) erhalten die gewünschte Verjüngung und Düsengröße.
2. Feuer-polnische Mikroelektrode Tipp mit einer Mikro-Schmiede bis ein einzelner motorischer Nerv mit einem festen Sitz abgesaugt werden kann.
3. Eine defekte Saug Pipette auf den Elektrodenhalter aufschieben und legen auf den langen, flexiblen Kunststoffschlauch und eine Spritze.
4. Stimulator Parameter einstellen (zB., 15 V, 20 Hz-Frequenz, 20 ms Dauer und Zeit von 5 min (Abbildung 2) oder 1 min (Abbildung 3)).
5. Ersetzen Sie die Ca^{2 +}-kostenlose Kochsalzlösung auf die Larven Vorbereitung mit oben FM1-43 Kochsalzlösung (1 mM CaCl₂; 4 µM) auf dem Prüfstand der Elektrophysiologie.
6. Setzen Sie die Vorbereitung auf den Mikroskoptisch und erhöhen Sie die Stufe zu, bis die Larve und Saug Pipette im Fokus (Eintauchen in Wasser Objektiv 40 X) sind.
7. Saugen Sie auf einer Schleife der Schnitt motorischen Nerven innervieren die ausgewählten Hemisegment mit Unterdruck durch die Spritze in die Absaugung Elektrode erzeugt.
8. Testen Sie die Saug-Elektroden-Funktion mit einem kurzen Stoß der Stimulation während der visuell Überwachung für die Kontraktion der Muskeln in den ausgewählten Hemisegment.
9. Fördern Sie die motorische Nerven mit ausgewählten Parametern (Schritt 5.4), SV Endozytose fahren und FM1-43 Farbstoff Aufnahme (Abbildung 2).
10. Waschen in rascher Folge mit Ca^{2 +}-frei Kochsalzlösung (5 X 1 min.), gewährleisten die FM1-43 Farbstofflösung wird vollständig entfernt.
11. Halten Sie die Larven Vorbereitung in frisch Ca^{2 +}-kostenlose Kochsalzlösung für die unmittelbare Bildgebung mit der konfokalen bildgebenden Protokoll von oben.
12. Nehmen Sie zur Kenntnis der NMJ abgebildet (Segment, Seite und Muskel), um Zugang zu den exakt gleichen NMJ nach FM Farbstoff entladen.

6. elektrische Stimulation: FM Farbstoff entladen

1. Ersetzen Sie die Ca^{2 +}-frei Kochsalzlösung mit regelmäßigen Kochsalzlösung (ohne FM1-43 Farbstoff) und setzen Sie die Vorbereitung wieder auf die Elektrophysiologie-Rig-Bühne.
2. Legen Sie die Parameter der Stimulator für die Entladung (z. B.15 V, 20 Hz Frequenz, 20 ms Dauer und Zeit von 2 min (Abbildung 2) bzw. 20 s (Abbildung 3)).
3. Saugen Sie die gleichen motorische Nerven in die gleichen Elektrode wie oben beschrieben, und dann zu stimulieren Sie, um SV Exozytose und FM1-43 Farbstoff Freigabe zu aktivieren.
4. Waschen in rascher Folge mit Ca^{2 +}-freie Kochsalzlösung (5 X 1 min.) Sicherstellung der externen Farbstoff wird vollständig entfernt.
5. Halten Sie die Larven Vorbereitung in frisch Ca^{2 +}-kostenlose Kochsalzlösung für die unmittelbare Bildgebung mit der konfokalen Mikroskop.
6. Sicherstellen Sie, dass die FM1-43 Farbstoff Fluoreszenz bei der gleichen NMJ erwähnt mit den gleichen Einstellungen konfokalen Bild.

7. Option 3: Channelrhodopsin Stimulation FM Farbstoff be-

1. ChR2 exprimierenden Larven auf Lebensmittel, die die ChR2 Co-Faktor All-Trans Retinal (gelöst in Ethanol; 100 µM Endkonzentration) zu erhöhen.
2. Legen Sie die Larven Vorbereitung in der Plexiglas-Kammer auf eine Dissektion Mikroskoptisch mit einem Kamera-Anschluss ausgestattet.
3. Befestigen Sie eine blaue LED (470 nm; Tabelle der Materialien) ein programmierbarer Stimulator mit einem Koaxialkabel und die LED in den Kamera-Anschluss.
4. Fokus der blaue LED Lichtstrahl auf die seziert Larven-Funktion mit der Mikroskop-Zoom-Funktion.
5. Ersetzen Sie die Ca^{2 +}-kostenlose Kochsalzlösung auf die Larven Vorbereitung mit oben FM1-43 Kochsalzlösung (1 mM CaCl₂; 4 µM) auf der optogenetische Bühne.
6. Legen Sie die LED-Parameter mit dem Stimulator (z. B.15 V, 20 Hz Frequenz, 20 ms Dauer und Zeit von 5 Minuten (Abbildung 2)).
7. Starten Sie die Lichtstimulation und verfolgen mit einem Timer für den vorab festgelegten Dauer der optogenetische Stimulation (z.B., 5 min; ( Abbildung 2).
8. Wenn der Timer stoppt, schnell die FM Farbstofflösung entfernen und ersetzen mit Ca^{2 +}-kostenlose Kochsalzlösung, SV stoppen Radfahren.
9. Waschen in rascher Folge mit dem Ca^{2 +}-freie Kochsalzlösung (5 X 1 min.) um sicherzustellen, das FM Farbstofflösung wird vollständig entfernt.
10. Halten Sie die Larven Vorbereitung in frisch Ca^{2 +}-kostenlose Kochsalzlösung für die unmittelbare Bildgebung mit der konfokalen Mikroskop mit imaging-Protokoll von oben.
11. Nehmen Sie zur Kenntnis der NMJ abgebildet (Segment, Seite und Muskel), um Zugang zu den exakt gleichen NMJ nach FM Farbstoff entladen.

8. Channelrhodopsin Stimulation: FM Farbstoff entladen

1. Ersetzen Sie Ca^{2 +}-kostenlose Kochsalzlösung mit regelmäßigen Kochsalzlösung (ohne Farbstoff FM1-43) auf die Dissektion Mikroskoptisch mit Kamera-Anschluss LED konzentrierte sich auf die Larve.
2. Legen Sie den Stimulator Parameter für entladen (z. B. 15 V, 20 Hz Frequenz, 20 ms Dauer und Zeit von 2 min (Abbildung 2)).
3. Starten Sie die Lichtstimulation und verfolgen mit einem Timer für den vorab festgelegten Dauer der optogenetische Stimulation (z. B. 2 min; ( Abbildung 2).
4. Nach Ablauf die Timer-Zeit schnell die FM Farbstofflösung entfernen und ersetzen Sie mit Ca^{2 +}-kostenlose Kochsalzlösung, SV stoppen Radfahren.
5. Waschen in rascher Folge mit Ca^{2 +}-freie Kochsalzlösung (5 X 1 min.) Sicherstellung der externen Farbstoff wird vollständig entfernt.
6. Halten Sie die Larven Vorbereitung in frisch Ca^{2 +}-kostenlose Kochsalzlösung für die unmittelbare Bildgebung mit der konfokalen Mikroskop.
7. Sicherstellen Sie, dass die FM1-43 Farbstoff Fluoreszenz bei der gleichen NMJ erwähnt mit den gleichen Einstellungen konfokalen Bild.

9. Fluoreszenz Quantifizierung

1. Laden Sie das Bild in Bild J (NIH-open-Source) und erstellen Sie eine maximale Intensität Projektion durch Klick auf Bild | Stapel | Z-Projekt.
2. Mit der Anti-HRP:647-Kanal, gehe zu Bild | Anpassen | Schwelle und schieben Sie den oberen Symbolleiste bis nur der NMJ markiert ist.
3. Klicken Sie mit dem Zauberstab-Werkzeug auf den NMJ. Wenn die NMJ diskontinuierlich ist, halten Sie die Shift-Taste und wählen Sie alle Teile.
4. Die FM1-43-Farbstoff-Kanal als Hintergrundbild und gehen Sie zu analysieren | Messung die Fluoreszenzmessung zu erhalten.
5. Wiederholen Sie die Schritte 9.1-9.4 für das "entladen" Bild aus der gleichen NMJ (identifizierten Segment, Seite und Muskeln).
6. Den Anteil des Farbstoffes zu erhalten, die entladen wurde, nehmen Sie das Verhältnis der Intensitäten/aufgeladen Fluoreszenz.
   Hinweis: Dieses Verfahren kann geändert werden, um Fluoreszenz auf Bouton-pro-Bouton Basis mit der "Oval" oder "Freihand" Auswahlwerkzeuge zu analysieren. Hintergrundfluoreszenz kann durch Abtasten der Muskel Fluoreszenz subtrahiert werden. Agenten können auch hinzugefügt werden, um diesen Hintergrund zu reduzieren.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt den Arbeitsablauf für die aktivitätsabhängige FM Farbstoff imaging-Protokoll. Das Experiment beginnt immer mit der gleichen Larven Kleber Dissektion, unabhängig von der Stimulation Methode anschließend verwendet. Abbildung 1a zeigt eine schematische Darstellung des sezierten Larve, die ventrale Nerv Schnur (VNC), ausstrahlenden Nerven und wiederholte Hemisegmental Muskel Muster. Das VNC wird entfernt und di...

Diskussion

Hoch [K⁺] saline depolarisierende Stimulation ist bei weitem die einfachste der drei Optionen für aktivitätsabhängige FM Farbstoff Radfahren, aber wahrscheinlich die wenigsten physiologischen²⁹. Diese einfache Methode erschüttert jeden zugänglich Zelle in das gesamte Tier und so erlaubt keine gezielte Studien. Es kann möglich sein, lokal hohe [K⁺] Kochsalzlösung mit einer Mikropipette gelten, aber dies wird noch depolarisieren Pre/postsynaptischen Zellen und wahrschein...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
SylGard 184 Silicone Elastomer Kit	Fisher Scientific	NC9644388	To put on cover glass for dissections
Microscope Cover Glass 22x22-1	Fisherbrand	12-542-B	To put SylGard on for dissections
Aluminum Top Hot Plate Type 2200	Thermolyne	HPA2235M	To cure the SylGard
Plexi glass dissection chamber	N/A	N/A	Handmade
Borosilicate Glass Capillaries	WPI	1B100F-4	To make suction and glue micropipettes
Laser-Based Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-2000	To make suction and glue micropipettes
Tygon E-3603 Laboratory Tubing	Component Supply Co.	TET-031A	For mouth and suction pipette
P2 pipette tip	USA Scientific	1111-3700	For mouth pipette
0.6-mL Eppendorf tube cap	Fisher Scientific	05-408-120	Used to put glue in for dissection
Vetbond 3M	WPI	vetbond	Glue used for dissections
Potassium Chloride	Fisher Scientific	P-217	Forsaline
Sodium Chloride	Millipore Sigma	S5886	For saline
Magnesium Chloride	Fisher Scientific	M35-500	For saline
Calcium Chloride Dihydrate	Millipore Sigma	C7902	For saline
Sucrose	Fisher Scientific	S5-3	For saline
HEPES	Millipore Sigma	H3375	For saline
HRP:Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	123-605-021	To label neuronal membranes
Paintbrush	Winsor & Newton	94376864793	To manipulate the larvae
Dumont Dumostar Tweezers #5	WPI	500233	Used during dissection
7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm)	WPI	14177	Used during dissection
FM1-43	Fisher Scientific	T35356	Fluorescent styryl dye
Digital Timer	VWR	62344-641	For timing FM dye load/unload
LSM 510 META laser-scanning confocal microscope	Zeiss		For imaging the fluorescent markers
Zen 2009 SP2 version 6.0	Zeiss		Software for imaging on confocal
HeNe 633nm laser	Lasos		To excite HRP:647 during imaging
Argon 488nm laser	Lasos		To excite the FM dye during imaging
Micro-Forge	WPI	MF200	To fire polish glass micropipettes
20mL Syringe Slip Tip	BD	301625	To suck up the axon for electrical stimulation.
Micro Manipulator (magnetic base)	Narishige	MMN-9	To control the suction electrode for electrical stimulation
Stimulator	Grass	S48	To control the LED and electrical stimulation
Zeiss Axioskop Microscope	Zeiss		Used during electrical stimulation.
40X Achroplan Water Immersion Objective	Zeiss		Used during electrical stimulation and confocal imaging
All-trans Retinal	Millipore Sigma	R2500	Essential co-factor for ChR2
Zeiss Stemi Microscope with camera port	Zeiss	2000-C	Used during channelrhodopsin stimulation
LED 470nm	ThorLabs	M470L2	Used for ChR activation
T-Cube LED Driver	ThorLabs	LEDD1B	To control the LED
LED Power Supply	Cincon Electronics Co.	TR15RA150	To power the LED
Optical Power and Energy Meter	ThorLabs	PM100D	To measure LED intensity