FM colorant cyclisme au niveau de la Synapse : en comparant la dépolarisation élevés de Potassium, électrique et Stimulation de la Channelrhodopsin

Résumé

Les vésicules synaptiques (SV) le vélo est le mécanisme central de la communication intercellulaire au niveau des synapses neuronales. Libération et l’absorption de teinture de FM sont les principaux moyens de dosage quantitatif SV endo - et l’exocytose. Nous comparons ici, toutes les méthodes de stimulation pour conduire FM1-43 cyclisme synaptique jonction neuromusculaire (NMJ) modèle drosophile .

Résumé

FM colorants sont utilisés pour étudier le cycle de la vésicule synaptique (SV). Ces sondes amphipathic ont une tête hydrophile et une queue hydrophobe, ce qui les rend solubles dans l’eau avec la capacité de façon réversible, entrer et sortir des bicouches lipidiques membranaires. Ces colorants styryl sont relativement non fluorescent en milieu aqueux, mais l’insertion dans le feuillet externe de la membrane plasmique provoque un > 40 X augmentation de fluorescence. Dans les synapses neuronales, FM colorants sont intériorisées au cours de l’endocytose SV, victimes de la traite au sein et entre les bassins de la SV et libérée par exocytose SV, fournissant un outil puissant pour visualiser les étapes présynaptiques de la neurotransmission. Un modèle génétique primaire de développement synapse glutamatergique et la fonction est la drosophile jonction neuromusculaire (NMJ), où FM teindre imagerie a été largement utilisée pour quantifier la dynamique de la SV dans un large éventail de conditions mutants. Le terminal synaptique NMJ est facilement accessible, avec une belle palette de grands boutons synaptiques idéales pour les applications d’imagerie. Ici, nous comparer et contraster les trois façons de stimuler la drosophile NMJ pour piloter l’activité dépendante FM1-43 colorant capture/release : demande 1) bain de haut [K⁺] à dépolariser tissus neuromusculaires, 2) aspiration des nerfs moteurs électrode stimulation à dépolariser le nerveuses présynaptiques terminal et 3) cible expression transgénique des variantes de channelrhodopsin pour le contrôle spatial, stimulée par la lumière de la dépolarisation. Chacune de ces méthodes a des avantages et des inconvénients pour l’étude des effets de la mutation génétique sur le cycle de la SV à la drosophile NMJ. Nous allons discuter de ces avantages et les inconvénients pour aider la sélection de l’approche de la stimulation, ainsi que les méthodologies spécifiques à chacune de ces stratégies. En plus de l’imagerie de fluorescence, FM colorants peuvent être photoconverted aux signaux dense aux électrons visualisés à l’aide de microscopie électronique à transmission (TEM) pour étudier les mécanismes cycle SV au niveau ultrastructural. Nous fournissons les comparaisons de confocale et microscopie imagerie de différentes méthodes de stimulation NMJ Drosophila , pour aider à guider la sélection des futurs paradigmes expérimentaux.

Introduction

Le modèle de synapse et de glutamatergique caractérise magnifiquement Drosophila larvaire de la jonction neuromusculaire (NMJ) a été utilisé pour étudier la formation des synapses et la fonction avec un vaste éventail de perturbations génétiques¹. Le terminal de neurones moteurs se compose de plusieurs branches axon, chacun avec plusieurs boutons synaptiques élargies. Ces varicosités de grande capacitées (jusqu'à 5 µm de diamètre) contiennent toute la machinerie de la neurotransmission, y compris les vésicules synaptiques glutamatergique uniforme (SVs ; ~ 40 nm de diamètre) dans la réserve cytosolique et piscines facilement libérable par². Ces vésicules ancrer aux membrane présynaptique de plasma fusion site zones actives (AZs), où l’exocytose intervient dans la libération de neurotransmetteur glutamate pour trans-communication synaptique. Par la suite, le SVs sont extraites de la membrane plasmique par kiss-and-run de recyclage ou d’endocytose clathrine (CME) pour les cycles répétés d’exo/endocytose. La drosophile NMJ est facilement accessible et bien adapté pour les isoler et caractériser des mutants de cycle SV. À l’aide d’écrans génétiques avant, nouvelles mutations ont conduit à l’identification de nouveaux gènes critiques pour le SV cycle³. En outre, les approches génétiques inverses à partir de gènes déjà connus ont conduit à l’élucidation des mécanismes de cycle SV nouvelles par le biais de la description minutieuse du mutant cyclisme phénotypes⁴. La drosophile NMJ est presque idéales comme préparation pour disséquer les mécanismes de l’endocytose et l’exocytose SV grâce à des méthodes à optiquement piste vésicule cyclisme au cours de la neurotransmission synaptique expérimentale.

Une gamme de marqueurs fluorescents permettent suivi visuel des vésicules au cours de cyclisme dynamique, mais les plus polyvalents sont des analogues de colorant de FM qui est synthétisé pour la première fois par Mao, F., et al. ⁵. structurellement, FM colorants contiennent une tête hydrophile et une queue lipophile connectés grâce à un cycle aromatique, avec une région centrale conférant des propriétés spectrales. Ces styryl colorants partitionner de manière réversible dans les membranes, ne pas « bascule » entre les feuillets de la membrane et ne sont donc jamais libre dans le cytosol et sont beaucoup plus fluorescentes dans les membranes à l’eau⁵. Réversible insertion dans une bicouche lipidique provoque une augmentation de 40 fois en fluorescence⁶. Au niveau des synapses neuronales, classic FM colorant étiquetage des expériences consistent en la préparation synaptique avec le colorant au cours de la stimulation de dépolarisation pour charger le colorant par endocytose SV de baignade. Teinture extérieure est alors emporté et le cycle de la SV est arrêté dans une solution de ringer sans calcium afin d’imager les synapses chargé⁷. Une deuxième série de stimulation dans un bain sans colorant déclenche FM libération par exocytose, un processus qui peut être suivi en mesurant la diminution d’intensité de fluorescence. Les populations de SV d’une vésicule simple aux piscines contenant des centaines de vésicules peuvent être quantitativement surveillé^6,7. Colorants de FM ont été utilisés pour disséquer la mobilisation activité dépendante des pools SV fonctionnellement distincts et de comparer les kiss-and-run vs CME cyclisme^8,9. La méthode a été modifiée pour dosage séparément évoquée, spontanée et miniature cycle synaptique activités (avec équipement très sensible pour détecter des changements très faible fluorescence et réduire photobleaching)¹⁰. Dosages peuvent être étendues au niveau ultrastructural de photoconverting le signal FM fluorescent à une étiquette opaques pour transmission electron microscopy^11,12,13,14 .

Historiquement, les préparations synaptique se baigner dans une forte concentration de potassium (ci-après dénommé « high [K⁺] ») est la méthode de choix pour dépolariser la stimulation pour provoquer le SV cyclisme ; allant de la grenouille cholinergique NMJ⁵, à cultivé des neurones de l’hippocampe cerveau rongeurs¹⁵, à la drosophile glutamatergique NMJ modèle^16,17. Cette approche [K⁺] élevée est simple, ne besoin d’aucun équipement spécialisé et est donc accessible à la plupart des laboratoires, mais a des limites pour les application et interprétation des données. Une méthode beaucoup plus physiologiquement appropriée consiste à utiliser l’électrode d’aspiration la stimulation électrique du nerf^4,5,12. Cette approche conduit la propagation du potentiel d’action pour la stimulation directe du nerf présynaptique terminal, et les résultats peuvent être comparés directement à des tests électrophysiologiques de neurotransmission fonction^{13,14, 15}, mais besoin d’équipement spécialisé et est techniquement beaucoup plus difficile. Avec l’avènement d’optogenetics, l’utilisation de la stimulation neuronale channelrhodopsin a des avantages supplémentaires, y compris un contrôle strict spatio-temporelle de l’expression des canaux en utilisant le binaire de système de Gal4/UAS²⁰. Cette approche est techniquement beaucoup plus facile que la stimulation de l’électrode d’aspiration et n’exige rien de plus qu’une source de lumière LED très bon marchée. Ici, nous utilisons l’imagerie de FM1-43 (dibromure de pyridiniumN-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl)) pour les comparer et contraster ces trois méthodes différentes de stimulation à la drosophile NMJ : haute simple [K⁺ ], contestant les channelrhodopsin électriques et nouvelles approches.

Protocole

1. larves colle Dissection

1. Bien mélanger 10 parties en élastomère de silicone base avec 1 partie en élastomère de silicone polymérisation agent du kit élastomère (Table des matières).
2. Enrober les lamelles de verre de 22 x 22 mm avec l’élastomère et le remède sur une plaque chauffante à 75 ° c pendant plusieurs heures (jusqu'à ce que n’est plus collant au toucher).
3. Placez une lamelle de verre élastomère unique dans la chambre de dissection de verre plexi sur mesure (Figure 1, en bas) en préparation pour la dissection larvaire.
4. Préparer les pipettes de colle de capillaire de verre borosilicaté moyen d’un extracteur de microélectrodes standard pour obtenir le cône désiré et Astuce taille.
5. Doucement briser au large de la pointe de la micropipette et à l’autre extrémité, attachez les 2 pieds de tube en plastique souple (1/32" diamètre intérieur, ID, 3/32" diamètre extérieur, OD, 1/32" mur ; Table des matières) avec bouche raccord (P2 de pipette).
6. Remplissez un petit récipient (capuchon du tube Eppendorf 0,6 mL) avec un petit volume (~ 20 µL) de colle (Table des matières) en préparation pour la dissection larvaire.
7. Remplir la chambre avec du sérum physiologique (en mM) : 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl₂, 1 CaCl₂, saccharose 70 et acide 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic 5 (HEPES) pH 7,2.
8. Ajouter anti-raifort (HRP) anticorps conjugués à Alexa Fluor 647 (anti-HRP:647 ; diluée 01:10 provenant d’un stock de 1 mg/mL) pour l’étiquetage de la NMJ terminaison présynaptique au cours de la dissection^21,22.
9. À l’aide d’un pinceau fin (taille 2), enlever un troisième stade errant dans le flacon de nourriture et placez-la sur le couvercle en verre revêtement élastomère.
10. Remplir la pointe d’une micropipette de verre avec une petite quantité de colle à l’aide de la pression d’air négative générée par la bouche avec pièce jointe (étape 1.5).
11. Position larve dorsale vers le haut avec la pince et colle la tête à la lamelle de revêtement élastomère avec une petite goutte de colle à l’aide de la pression d’air positive par la bouche.
12. Répétez cette procédure avec l’extrémité postérieure de la larve, en s’assurant que l’animal soit tendu tendu entre les deux fixations de colle.
13. À l’aide de ciseaux (lames 3 mm ; Table des matières), faites une coupe horizontale (~ 1 mm) au postérieur et une coupe verticale tout au long de la ligne médiane dorsale.
14. À l’aide de pinces fines (n ° 5, Table des matières), délicatement enlever dorsale trachée, intestin, corps gras et autres organes internes couvrant la musculature.
15. Répétez la procédure de collage pour les quatre volets de paroi du corps, en veillant à étirer doucement la paroi du corps aussi bien horizontalement que verticalement.
16. Soulever le cordon nerveux ventral (VNC) à l’aide de pinces, coupez soigneusement les nerfs moteurs avec les ciseaux et puis supprimer complètement la VNC.
17. Remplacer la solution saline de dissection avec Ca^{2 +}-gratuit saline (identique à la saline de dissection ci-dessus sans le CaCl₂) pour arrêter la SV cyclisme.

2. option 1 : Chargement de colorant FM haute [K⁺]

1. D’une solution mère FM1-43 (4 mM), ajouter 1 µL à 1 mL de 90 mM de solution de KCl (haute [K⁺] dans une solution saline de dissection) pour une concentration finale de 4 µM.
2. À l’aide d’une pipette, remplacer le Ca^{2 +}-saline gratuite dans la chambre d’imagerie avec la solution de colorant [K⁺] FM haute pour stimuler l’absorption de teinture SV endocytose.
3. Commencer immédiatement une minuterie numérique pour la durée prédéterminée des hauts [K⁺] période de stimulation de dépolarisation (e.g., 5 min ; La figure 2).
4. Pour confirmer une saine préparation larvaire, notez les fortes contractions de la musculature pour la durée de la grande période de dépolarisation [K⁺].
5. Après la fin de la période de minuterie, rapidement enlever la solution de colorant [K⁺] FM haute et remplacer par Ca^{2 +}-saline libre d’arrêter SV cyclisme.
6. Laver en succession rapide avec le Ca^{2 +}-gratuit saline (5 x 1 min) pour s’assurer que la solution de colorant [K⁺] FM haute est totalement supprimée.
7. Maintenir la préparation larve fraîches Ca^{2 +}-saline libre d’imagerie immédiat sur la microscopie confocale.

3. imagerie : Microscopie confocale

1. Utiliser un microscope confocal vertical avec un 40 X objectif à immersion d’eau à fluorescence de colorant NMJ image (autres microscopes peuvent être utilisés).
2. Image des muscles 4 NMJ des segments abdominaux 2-4 (autres NMJ peut être photographiée) et de recueillir des images à l’aide des logiciels appropriés (Table des matières).
3. Utiliser un laser HeNe 633 nm à exciter HRP:647 (avec filtre pass-long > 635 nm) et un laser à Argon 488 nm pour exciter FM1-43 (avec bandpass filter 530-600 nm).
4. Sur le plan opérationnel déterminer gain optimal et l’offset pour les deux canaux.
   Remarque : Ces paramètres demeurera constants tout au long du reste de l’expérience.
5. Prenez une pile Z confocale à travers l’ensemble NMJ sélectionné du haut HRP-marqué en bas du terminal synaptique.
6. Prendre bonne note de la NMJ imagé (segment, latéral et muscle) pour garantir l’excès à l’exacte NMJ même après FM teindre de déchargement.

4. haute [K⁺] Stimulation : FM colorant déchargement

1. Remplacer Ca^{2 +}-saline gratuite avec la haute [K⁺] solution saline (sans colorant FM1-43) à la dépolarisation de la voiture, sortie de l’exocytose et colorant SV.
2. Commencer immédiatement une minuterie numérique pour la durée prédéterminée de la grande période de stimulation [K⁺] (p. ex.., 2 min ; La figure 2).
3. Après la fin de la période de minuterie, immédiatement supprimer la grande saline [K⁺] et remplacez par Ca^{2 +}-saline libre d’arrêter SV cyclisme.
4. Laver en succession rapide avec Ca^{2 +}-gratuit saline (5 x 1 min) pour assurer la grande saline [K⁺] est totalement supprimée.
5. Maintenir la préparation larve fraîches Ca^{2 +}-saline libre d’imagerie immédiat sur la microscopie confocale.
6. S’assurer de l’image de la fluorescence de colorant FM1-43 à la NMJ même mentionné ci-dessus en utilisant les mêmes paramètres confocale.

5. option 2 : Stimulation électrique FM colorant chargement

1. Préparer une pipette d’aspiration à l’aide de l’extracteur de la microélectrode (Table des matières) pour obtenir le cône requis et Astuce taille.
2. Feu-vernis à l’extrémité de la microélectrode avec une micro-forge jusqu'à ce qu’un seul nerf moteur peut être sucé vers le haut avec un ajustement serré.
3. Faites glisser la pipette d’aspiration sur le porte-électrode sur un micromanipulateur et fixer le tube de plastique flexible long et une seringue.
4. Définir les paramètres de stimulateur (e.g., 15 V, fréquence 20 Hz, durée 20 ms et l’heure de 5 min (Figure 2) ou 1 min (Figure 3)).
5. Remplacer le Ca^{2 +}-saline gratuite sur la préparation de larve avec au-dessus de saline FM1-43 (4 µM ; 1 mM CaCl₂) sur le banc de l’électrophysiologie.
6. Mettre la préparation sur la platine du microscope et relever l’étape jusqu'à ce que la larve et la pipette d’aspiration sont en discussion (objectif 40-immersion dans l’eau).
7. Aspirer une boucle de coupe nerveuses motrices innervant le hemisegment sélectionné avec la pression d’air négative générée par la seringue dans l’électrode d’aspiration.
8. Testez la fonction électrode d’aspiration avec une courte rafale de la stimulation tout en contrôlant visuellement la contraction musculaire dans le hemisegment sélectionné.
9. Stimuler le nerf moteur en utilisant les paramètres sélectionnés (étape 5.4) pour conduire l’endocytose de la SV et l’absorption de teinture FM1-43 (Figure 2).
10. Laver en succession rapide avec Ca^{2 +}-gratuit saline (5 x 1 min) pour s’assurer que la solution de colorant FM1-43 est totalement supprimée.
11. Maintenir la préparation larve fraîches Ca^{2 +}-saline gratuite pour l’imagerie immédiate en utilisant le protocole d’imagerie confocal par dessus.
12. Prenez soin de noter le NMJ imagé (segment, côté et muscle) pour garantir l’accès à l’exacte NMJ même après le déchargement de colorant de FM.

6. électrostimulation : FM colorant déchargement

1. Remplacer le Ca^{2 +}-sans une solution saline avec une solution saline normale (sans colorant FM1-43) et placer la préparation revient sur la scène de rig électrophysiologie.
2. Définir les paramètres de stimulateur de déchargement (p. ex., 15 V, fréquence 20Hz, durée 20 ms et temps de 2 min (Figure 2) ou 20 s (Figure 3)).
3. Aspirer le nerf moteur même dans la même électrode comme indiqué ci-dessus et ensuite stimuler pour activer l’exocytose SV et FM1-43 communiqué de colorant.
4. Laver en succession rapide avec Ca^{2 +}-libre de sérum physiologique (5 x 1 min) afin d’assurer la teinture extérieure est totalement supprimée.
5. Maintenir la préparation larve fraîches Ca^{2 +}-saline libre d’imagerie immédiat sur la microscopie confocale.
6. Veiller à l’image de la fluorescence de colorant FM1-43 à la NMJ même mentionné ci-dessus en utilisant les mêmes paramètres confocale.

7. option 3 : Channelrhodopsin Stimulation FM colorant chargement

1. Soulever le ChR2 exprimant des larves sur les denrées alimentaires contenant le rétinal en tout-trans ChR2 cofacteur (dissous dans l’éthanol ; concentration finale de 100 µM).
2. Placez la préparation larvaire dans la chambre de plexiglass sur une dissection des microscopes équipés d’un port de l’appareil photo.
3. Attacher une LED bleu (470 nm ; Table des matières) à un stimulateur programmable en utilisant un câble coaxial et placer le LED dans le port de la caméra.
4. Concentrer le faisceau lumineux LED bleu sur la fonction larvaire disséqué en utilisant la fonction de zoom du microscope.
5. Remplacer le Ca^{2 +}-saline gratuite sur la préparation de larve avec au-dessus de saline FM1-43 (4 µM ; 1 mM CaCl₂) sur la scène optogenetic.
6. Définissez les paramètres de LED à l’aide de l’appareil (par exemple, 15 V, fréquence 20Hz, de durée 20 ms et de temps de 5 min (Figure 2)).
7. Commencer la stimulation légère et suivre avec une minuterie pour la durée prédéterminée de la période de stimulation optogenetic (p. ex., 5 min ; La figure 2).
8. Lorsque la minuterie s’arrête, rapidement enlever la solution de colorant de FM et remplacer par Ca^{2 +}-saline libre d’arrêter la SV cyclisme.
9. Laver en succession rapide avec le Ca^{2 +}-gratuit saline (5 x 1 min) pour s’assurer que la solution de colorant FM est totalement supprimée.
10. Maintenir la préparation larve fraîches Ca^{2 +}-saline libre d’imagerie immédiat sur la microscopie confocale utilisant le protocole d’imagerie d’en haut.
11. Prenez soin de noter le NMJ imagé (segment, côté et muscle) pour garantir l’accès à l’exacte NMJ même après le déchargement de colorant de FM.

8. Channelrhodopsin Stimulation : colorant FM déchargement

1. Remplacer Ca^{2 +}-saline libre avec une solution saline normale (sans colorant FM1-43) sur la platine du microscope dissection avec port appareil photo LED axé sur la larve.
2. Définir les paramètres de stimulateur de déchargement (p. ex., 15 V, fréquence 20Hz, de durée 20 ms et de temps de 2 min (Figure 2)).
3. Commencer la stimulation légère et suivre avec une minuterie pour la durée prédéterminée de la période de stimulation optogenetic (p. ex., 2 min ; La figure 2).
4. Après la fin de la période de minuterie, rapidement enlever la solution de colorant de FM et remplacer par Ca^{2 +}-saline libre d’arrêter la SV cyclisme.
5. Laver en succession rapide avec Ca^{2 +}-libre de sérum physiologique (5 x 1 min) afin d’assurer la teinture extérieure est totalement supprimée.
6. Maintenir la préparation larve fraîches Ca^{2 +}-saline libre d’imagerie immédiat sur la microscopie confocale.
7. Veiller à l’image de la fluorescence de colorant FM1-43 à la NMJ même mentionné ci-dessus en utilisant les mêmes paramètres confocale.

9. Quantification de la fluorescence

1. Charger l’image dans l’Image J (OpenSource NIH) et de créer une projection de l’intensité maximale en cliquant sur Image | Piles | Projet de Z.
2. À l’aide de l’anti-HRP:647 canal, allez dans Image | Ajuster | Seuil et faire glisser la barre d’outils supérieure jusqu'à ce que juste la NMJ est mis en surbrillance.
3. À l’aide de l’outil baguette magique, cliquez sur le NMJ. Si le NMJ est discontinue, maintenez la touche Shift, puis sélectionnez toutes les pièces.
4. Changer l’image sur le canal de colorant FM1-43 et allez dans Analyze | Mesure d’obtenir la mesure de la fluorescence.
5. Répétez les étapes 9.1-9,4 pour l’image « déchargé » de la même NMJ (segment identifié, latéral et muscle).
6. Pour obtenir le pourcentage de colorant qui a été déchargé, prenez le rapport entre les intensités de fluorescence de déchargement/chargement.
   Remarque : Cette procédure peut être modifiée pour analyser la fluorescence sur une base de bouton-par-bouton en utilisant soit les outils de sélection « oval » ou « à la volée ». Fluorescence de fond peut être soustraite par l’échantillonnage de la fluorescence de muscle. Agents peuvent également être ajoutés afin de réduire cette toile de fond.

Résultats

La figure 1 illustre le flux de travail pour la teinture de FM activité-dépendant du protocole d’imagerie. L’expérience commence toujours par la dissection de larves colle même, peu importe la méthode de stimulation utilisée par la suite. Figure 1 a est une représentation schématique d’une larve disséquée, montrant le cordon nerveux ventral (VNC), irradiant les nerfs et modèle muscle hemisegmental répétées. VN...

Discussion

Haute [K⁺] la stimulation dépolarisante saline est de loin le plus facile des trois options pour la teinture de FM activité-dépendant du cyclisme, mais probablement la moins physiologique²⁹. Cette méthode simple dépolarise chaque cellule accessible chez l’animal entier et donc ne permet pas aux études dirigées. Il peut être possible d’appliquer localement élevés [K⁺] une solution saline avec une micropipette, mais cela sera toujours dépolariser les cellules pr?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
SylGard 184 Silicone Elastomer Kit	Fisher Scientific	NC9644388	To put on cover glass for dissections
Microscope Cover Glass 22x22-1	Fisherbrand	12-542-B	To put SylGard on for dissections
Aluminum Top Hot Plate Type 2200	Thermolyne	HPA2235M	To cure the SylGard
Plexi glass dissection chamber	N/A	N/A	Handmade
Borosilicate Glass Capillaries	WPI	1B100F-4	To make suction and glue micropipettes
Laser-Based Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-2000	To make suction and glue micropipettes
Tygon E-3603 Laboratory Tubing	Component Supply Co.	TET-031A	For mouth and suction pipette
P2 pipette tip	USA Scientific	1111-3700	For mouth pipette
0.6-mL Eppendorf tube cap	Fisher Scientific	05-408-120	Used to put glue in for dissection
Vetbond 3M	WPI	vetbond	Glue used for dissections
Potassium Chloride	Fisher Scientific	P-217	Forsaline
Sodium Chloride	Millipore Sigma	S5886	For saline
Magnesium Chloride	Fisher Scientific	M35-500	For saline
Calcium Chloride Dihydrate	Millipore Sigma	C7902	For saline
Sucrose	Fisher Scientific	S5-3	For saline
HEPES	Millipore Sigma	H3375	For saline
HRP:Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	123-605-021	To label neuronal membranes
Paintbrush	Winsor & Newton	94376864793	To manipulate the larvae
Dumont Dumostar Tweezers #5	WPI	500233	Used during dissection
7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm)	WPI	14177	Used during dissection
FM1-43	Fisher Scientific	T35356	Fluorescent styryl dye
Digital Timer	VWR	62344-641	For timing FM dye load/unload
LSM 510 META laser-scanning confocal microscope	Zeiss		For imaging the fluorescent markers
Zen 2009 SP2 version 6.0	Zeiss		Software for imaging on confocal
HeNe 633nm laser	Lasos		To excite HRP:647 during imaging
Argon 488nm laser	Lasos		To excite the FM dye during imaging
Micro-Forge	WPI	MF200	To fire polish glass micropipettes
20mL Syringe Slip Tip	BD	301625	To suck up the axon for electrical stimulation.
Micro Manipulator (magnetic base)	Narishige	MMN-9	To control the suction electrode for electrical stimulation
Stimulator	Grass	S48	To control the LED and electrical stimulation
Zeiss Axioskop Microscope	Zeiss		Used during electrical stimulation.
40X Achroplan Water Immersion Objective	Zeiss		Used during electrical stimulation and confocal imaging
All-trans Retinal	Millipore Sigma	R2500	Essential co-factor for ChR2
Zeiss Stemi Microscope with camera port	Zeiss	2000-C	Used during channelrhodopsin stimulation
LED 470nm	ThorLabs	M470L2	Used for ChR activation
T-Cube LED Driver	ThorLabs	LEDD1B	To control the LED
LED Power Supply	Cincon Electronics Co.	TR15RA150	To power the LED
Optical Power and Energy Meter	ThorLabs	PM100D	To measure LED intensity