시 냅 스에서 사이클링 하는 FM 염료: 높은 칼륨 도발은, 전기 및 Channelrhodopsin 자극을 비교

요약

시 냅 스 소포 (SV) 자전거는 신경 시 냅 스에서 세포 커뮤니케이션의 핵심 메커니즘. FM 염료 통풍 관 및 릴리스 양적 SV 엔도-및 exocytosis 시 금의 기본 수단입니다. 여기, 우리는 모든 자극 방법 FM1 43 초파리 신경 근육 학 교차로 (NMJ) 모델 시 냅 스에서 자전거를 비교 합니다.

초록

FM 염료는 시 냅 스 소포 (SV) 주기를 공부 하는 데 사용 됩니다. 이러한 amphipathic 프로브는 친수성 머리와 소수 성 꼬리, 수용 성 역 입력 하 고 종료 막 지질 bilayers 능력 들을 만들고 있다. 이러한 styryl 염료는 상대적으로 비-형광 수성 매체에 있지만 원형질 막의 외부 전단에 삽입 한 > 형광 40 X 증가. 신경 시 냅 스에서 FM 염료는 SV endocytosis, 매매 모두 시간과 SV 풀 사이 함께 출시 된 SV exocytosis neurotransmission의 연 접 단계를 시각화 하는 강력한 도구를 제공 하는 동안 내 면. Glutamatergic 냅 개발 및 기능의 기본 유전자 모델은 Drosophila 신경 근육 학 교차로 (NMJ), FM 영상을 염색 SV 역학 돌연변이 조건의 넓은 범위에서 계량을 광범위 하 게 사용 되었습니다. NMJ 시 냅 스 터미널은, 아름 다운 배열의 큰 시 냅 스 boutons 이미징 응용 프로그램에 적합 합니다. 여기, 우리가 비교와 초파리 NMJ 활동 종속 FM1 43 염료 글귀/릴리스를 자극 하는 세 가지 방법으로 대조: 높은 [⁺K] 신경 근육 학 조직 depolarize, 2) 흡입 전극 모터 신경의 응용 프로그램 1) 목욕 연 접 신경 맨끝, 및 3 depolarize를 자극) 대상의 도발은 빛 자극, 공간 제어를 위한 channelrhodopsin 이체의 유전자 변형 식. 이러한 메서드의 마다 장점과 단점 SV 주기 유전자 변이 효과의 연구에 대 한 초파리 NMJ에. 우리는 이러한 장점과 단점 각 전략을 구체적인 방법론을 함께 자극 방식의 선택에 도움을 논의할 예정 이다. 형광 이미징, 뿐만 아니라 FM 염료 ultrastructural 수준에서 SV 사이클 메커니즘 연구를 전송 전자 현미경 (TEM)을 사용 하 여 시각화 하는 전자 밀도 신호를 photoconverted 수 있습니다. 우리 confocal의 비교를 제공 하 고 전자 현미경 이미징 도움말 가이드에 초파리 NMJ 자극의 다른 방법에서 미래 실험 패러다임의 선택.

서문

초파리 애벌레 신경 근육 학 교차로 (NMJ) glutamatergic 냅 모델 아름 답게 특징은 시 냅 스 형성 유전자 섭¹의 광대 한 스펙트럼과 기능을 공부 하 고 사용 되었습니다. 여러 축 삭 분 지, 각각 많은 확대 시 냅 스 boutons 모터 신경 맨끝에 의하여 이루어져 있다. 이 널찍한 varicosities (최대 5 µ m 직경에서) neurotransmission 기계, 균일 한 glutamatergic 시 냅 스 소포를 포함 하 여 모든 포함 (SVs; ~ 40 nm 직경에서) cytosolic 예비에 쉽게 releasable 풀². 이 소포는 연 접 원형질 막 퓨전 사이트 활성 영역 (AZs), 어디 exocytosis 트랜스에 대 한 조미료 신경 전달 물질 방출을 중재에 도킹-시 냅 스 통신. 그 후, SVs는 반복된 엑 소/endocytosis 사이클 키스 실행 재활용 또는 clathrin 중재 된 endocytosis (CME)를 통해 원형질 막에서 검색 됩니다. Drosophila NMJ은 쉽게 접근 가능 하 고 모두 분리 및 SV 주기 돌연변이 적합. 앞으로 유전 스크린을 사용 하 여, 새로운 돌연변이 SV 사이클³에 대 한 중요 한 새로운 유전자의 식별을 끌고있다. 또한, 이미 알려진된 유전자로 시작 하는 역 유전 접근은 돌연변이 고기⁴사이클의 주의 설명을 통해 새로운 SV 사이클 메커니즘의 해명에 이르렀다. Drosophila NMJ 광학 트랙 소포 neurotransmission 동안 순환 하는 방법을 통해 SV endocytosis 및 exocytosis 메커니즘을 해 부에 대 한 실험 시 냅 스 준비로 거의 이상적 이다.

다양 한 형광 마커 중 역학, 소포의 시각적 추적 허용 하지만 가장 다재 다능 한 마오, F., 동부 표준시 알에 의해 처음 합성 FM 염료 아날로그. ⁵. FM 염료는 친수성 머리와 스펙트럼 속성 부여 중앙 지역으로 향기로운 반지를 통해 연결 된 질 성 꼬리를 포함 하는 구조적으로. 이러한 styryl 염료 역 막에 분할 할 하지 '플립플롭' 막 전단지 사이 고 그래서 결코, cytosol에서 무료 고 물⁵보다 훨씬 더 막에 형광. 지질 bilayer에 가역 삽입 형광⁶에 40-fold 증가 발생합니다. 신경 시 냅 스에서 클래식 FM 염료 라벨 실험 SV endocytosis 통해 염료를 로드 depolarizing 자극 하는 동안 염료와 시 냅 스 준비 목욕 이루어져 있다. 외부 염료 다음 씻 고 SV 주기 이미지 로드 시 냅 스⁷를 칼슘 무료 벨소리 솔루션에 체포 됩니다. 염료 무료 목욕에 자극의 두 번째 라운드 exocytosis, 형광 강도 감소를 측정 하 여 따라 할 수 있는 과정을 통해 FM 석방을 트리거합니다. 풀 vesicles의 수백을 포함 하는 단일 소포에서 SV 인구 양적 모니터링된^6,7일 수 있다. 기능적으로 뚜렷한 SV 풀의 활동-종속 동원 해 부 키스-및-실행 CME 사이클링^8,9대를 비교 하 고 FM 염료 사용 되었습니다. 방법은 별도로 분석 결과 갖는, 자연과 소형 시 냅 스 사이클 활동 (아주 작은 형광 변화를 감지 하 여 photobleaching를 줄이기 위해 매우 중요 한 장비)와¹⁰에 수정 되었습니다. 분석 실험으로 확장할 수 있습니다 ultrastructural 단계로 photoconverting 형광 FM 신호 전송 전자 현미경 검사 법^{11,12,13,14 전자 밀도 라벨으로} .

역사적으로, 칼륨 ("높은 [K⁺]" 라 함)의 높은 농도에 입욕 시 냅 스 준비 되었습니다 depolarizing SV 사이클링;을 유도 하는 자극에 대 한 선택의 방법 개구리 해 NMJ⁵년까지 경작 설치류 두뇌 hippocampal 신경¹⁵, 초파리 glutamatergic NMJ 모델^16,17. 높은 [K⁺] 이렇게 간단, 특수 장비, 필요 고 따라서 대부분의 실험실에 액세스할 수 하지만 응용 프로그램 및 데이터 해석에 대 한 제한이 있습니다. 훨씬 더 순수 적절 한 방법을 사용 하는 신경^4,5,12의 흡입 전극 전기 자극. 이 방법은 활동 전위 전파 연 접 신경의 직접적인 자극에 대 한 터미널, 고 결과 electrophysiological 분석 neurotransmission 함수^{13,14의 직접 비교 될 수 있다 15}, 하지만 특수 장비를 필요로 하 고 기술적으로 훨씬 더 도전적인는. Optogenetics의 출현으로 channelrhodopsin 신경 자극의 사용 이진 Gal4/UAS 시스템²⁰을 사용 하 여 채널 식의 꽉 spatiotemporal 제어를 포함 하 여 추가적인 이점이 있다. 이 방법은 흡입 전극 자극 보다 기술적으로 훨씬 쉽게 하며 매우 저렴 한 LED 광원 보다 아무것도 더. 우리 모두 비교 하 고 대조 초파리 NMJ에서 이러한 세 가지 다른 자극 방법 FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) pyridinium dibromide)의 이미지를 사용 하는 여기,: 간단한 높은 [K⁺ ], 전기 및 새로운 channelrhodopsin 접근을 도전.

프로토콜

1. 애벌레 접착제 해 부

1. 철저 하 게 혼합 실리콘 탄성 엘라 스토 머 키트 (자료 테이블)에서 에이전트를 경화 실리콘 탄성 중합체의 1 부분으로 기본의 10 개 부분.
2. 몇 시간 (때까지 더 이상 터치 스티커)에 대 한 탄성 중합체와 75 ˚C에서 뜨거운 접시에 치료 22 x 22 m m 유리 coverslips 코트.
3. 단일 탄성 중합체 코팅 유리 coverslip을 애벌레 해 부에 대 한 준비에 맞춤 plexi 유리 절 개 챔버 (그림 1, 하단)에 넣으십시오.
4. 표준 microelectrode 끌어당기는 사람을 사용 하 여 원하는 테이퍼 팁 크기를 붕 규 산 유리 모 세관에서 접착제 펫을 준비 합니다.
5. 부드럽게 micropipette 팁 오프 하 고 다른 쪽 끝을, 유연한 플라스틱 튜브 (1/32"내부 직경, ID 3/32" 외부 직경, OD, 1/32"벽;의 2 피트 자료의 테이블) 와 입 (P2 피 펫 팁) 피팅.
6. 애벌레 해 부에 대 한 준비에 접착제 (자료 테이블)의 작은 양 (~ 20 µ L)으로 작은 컨테이너 (0.6 mL Eppendorf 관 모자)를 채우십시오.
7. 챔버 (mM)에 염 분 채우기: 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl₂, 1 CaCl₂, 70 자당 및 5 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic 산 (HEPES) pH 7.2.
8. 알 렉 사 Fluor 647에 활용 된 안티-말 무 과산화 효소 (HRP) 항 체를 추가 (안티-HRP:647; 1 mg/mL 재고에서 희석 1시 10분)은 NMJ를 라벨에 대 한 해 부^21,22동안 연 접 맨끝.
9. 좋은 붓 (크기 2)를 사용 하, 식품 유리병에서 방황 하 고 세 번째 탈피를 제거 하 고 탄성 중합체 코팅 커버 유리에 놓습니다.
10. 유리 제 micropipette 팁을 첨부 (1.5 단계)와 입에 의해 생성 된 부정적인 공기 압력을 사용 하 여 접착제의 작은 볼륨을 채우십시오.
11. 위치 유 충 등 사이드를 집게와 접착제 탄성 중합체 코팅 coverslip 작은 머리 입으로 긍정적인 공기 압력을 사용 하 여 접착제의 드롭.
12. 확인 하 고 동물 상당량이 두 접착제 첨부 파일 사이의 긴장 된 유 충의 후부 끝이 절차를 반복 합니다.
13. 가 위를 사용 하 여 (블레이드 3 m m; 테이블의 자료), 후부 및 수직 컷 등 쪽 midline 따라 수평 컷 (~ 1 m m)를 확인.
14. 부드럽게 잘 집게 (#5, 테이블의 자료)를 사용 하 여 등 기관, 창 자, 뚱뚱한 몸 및 다른 내부 장기를 덮고 있는 근육 제거.
15. 4 몸 벽 날개, 수평 및 수직으로 체 벽을 부드럽게 스트레칭 하를 접착제로 붙이는 절차를 반복 합니다.
16. 집게를 사용 하 여 복 부 신경 코드 (VNC), 신중 하 게 모터 신경은가 위로 잘라 들어올린 다음 VNC를 완전히 제거.
17. 해 부 생리를 바꿉니다 캘리포니아^{2 +}-SV를 막으려고 (CaCl₂없이 위의 해 부 식 염 수와 동일)는 염 분을 무료 자전거.

2. 옵션 1: 높은 [K⁺] FM 염료 로드

1. FM1 43 재고 솔루션 (4 m m)에서 90 m KCl 해결책 (높은 [K⁺] 해 부 염 분에서) 4 µ M의 최종 농도 대 한 m의 1 mL에 1 µ L를 추가 합니다.
2. 교체를 피 펫을 사용 하 여 Ca^{2 +}-SV endocytosis 염료의 통풍 관을 자극 하 고 [K⁺] FM 염료 솔루션과 영상 실에서 무료 염 분.
3. 즉시 시작 자극 기간 depolarizing [K⁺]의 미리 결정 된 기간에 대 한 디지털 타이머 (예., 5 분; 그림 2)입니다.
4. 건강 한 애벌레 준비를 확인 하려면 높은 [K⁺] 도발은 기간 동안은 근육의 강한 수축 note.
5. 타이머 기간 끝나면 신속 하 게 높은 [K⁺] FM 염료 솔루션을 제거 하 고 대체 캘리포니아^{2 +}-SV를 막으려고 무료 염 분 사이클링.
6. 캘리포니아^{2 +}빠른 승계에서 세척-높은 [K⁺] FM 염료 솔루션 완전히 제거 되도록 하기 위해 식 염 수 (5 x 1 분)을 무료.
7. 신선한 캘리포니아^{2 +}에서 애벌레 준비를 유지-confocal 현미경으로 즉시 이미징에 대 한 무료 염 분.

3. 영상: Confocal 현미경 검사 법

1. 똑바로 confocal 현미경을 사용 하 여 이미지 NMJ 염료 형광 (다른 현미경 사용 될 수 있다)에 물 집중 목표 X 40.
2. 이미지 근육 복 부 세그먼트 2-4 (다른 NMJs 몇 군데 수)의 4 NMJ 적절 한 소프트웨어 (테이블의 재료)를 사용 하 여 이미지를 수집 하 고.
3. HeNe 633 nm 레이저를 사용 하 여 HRP:647 (와 긴 패스 필터 > 635 nm)와 아르곤 488 nm 레이저 FM1-43 (대역 통과 필터 530-600 nm)와 자극을 자극.
4. 운영 체제는 최적의 이득 및 두 채널에 대 한 오프셋을 결정 합니다.
   참고:이 설정은 실험의 나머지 부분에 걸쳐 일정 한 유지 됩니다.
5. 시 냅 스 터미널의 바닥에 HRP 표시 위에서 전체 선택한 NMJ 통해 confocal Z 스택 가져가 라.
6. 주의 주의 NMJ 몇 군데 (세그먼트, 측면 및 근육)의 FM 역 염색 후 정확한 동일한 NMJ에 초과 되도록 합니다.

4. 높은 [K⁺] 자극: FM 염료 내리기

1. 대체 캘리포니아^{2 +}-무료 염 분 높은 [K⁺] 염 (FM1 43 염료) 없이 드라이브 도발은를 가진 SV exocytosis 염료 릴리스.
2. 높은 [K⁺] 자극 기간 미리 결정 된 기간에 대 한 디지털 타이머를 즉시 시작 (예., 2 분; 그림 2)입니다.
3. 타이머 기간 끝나면 즉시 높은 [K⁺] 염 분을 제거 하 고 대체 캘리포니아^{2 +}-SV를 막으려고 무료 염 분 사이클링.
4. 캘리포니아^{2 +}빠른 승계에서 세척-높은 [K⁺] 염 분 완전히 제거 되도록 하기 위해 식 염 수 (5 x 1 분)을 무료.
5. 신선한 캘리포니아^{2 +}에서 애벌레 준비를 유지-confocal 현미경으로 즉시 이미징에 대 한 무료 염 분.
6. 동일한 confocal 설정을 사용 하 여 위에서 설명한 동일한 NMJ에 FM1 43 염료 형광 이미지를 특정 수 있습니다.

5. 옵션 2: 전기 자극 FM 염료 로드

1. 필요한 테이퍼 팁 크기를 microelectrode 끌어당기는 사람 (테이블의 재료)를 사용 하 여 흡입 피 펫을 준비 합니다.
2. 화재-폴란드어 마이크로 포지 microelectrode 끝까지 단일 모터 신경 꽉 맞는와 빨려 수 있습니다.
3. micromanipulator에 흡입 피 펫 전극 홀더에 고 긴 유연한 플라스틱 튜브와 주사기를 연결 하십시오.
4. 자극 매개 변수 설정 (예., 15 V, 20 Hz 주파수, 20 ms 기간 및 시간 5 분 (그림 2) 또는 1 분 (그림 3)).
5. 대체 Ca^{2 +}-FM1 43 염 분 (4 µ M, 1 mM CaCl₂) 전기 생리학 장비에 위의 애벌레 준비에 무료 염 분.
6. 현미경 단계에 준비 넣고 유 충과 흡입 피펫은 초점 (40 X 물 침수 목표)에 때까지 무대를 마련 합니다.
7. 부정적인 공기 압력 흡입 전극으로 주사기에 의해 생성 된 선택 된 hemisegment를 innervating 컷된 모터 신경의 루프를 빨 아.
8. 선택 된 hemisegment에 있는 근육 수축에 대 한 시각적으로 모니터링 하는 동안 자극의 짧은 버스트와 함께 흡입 전극 기능을 테스트 합니다.
9. SV endocytosis를 선택한 매개 변수 (단계 5.4) 및 FM1 43 염료의 통풍 관 (그림 2)를 사용 하 여 모터 신경 자극.
10. 캘리포니아^{2 +}빠른 승계에서 세척-FM1 43 염료 솔루션 완전히 제거 되도록 하기 위해 식 염 수 (5 x 1 분)을 무료.
11. 신선한 캘리포니아^{2 +}에서 애벌레 준비를 유지-위에서 confocal 영상 프로토콜을 사용 하 여 즉시 이미징에 대 한 무료 염 분.
12. (세그먼트, 측면 및 근육) FM 염료 내리기 후 정확한 동일한 NMJ에 대 한 액세스를 보장 하기 위해 몇 군데 NMJ의 주의 기록해 둡니다.

6. 전기 자극: FM 염료 내리기

1. 대체 Ca^{2 +}-(FM1 43 염료) 없이 일반 식 염 수와 염 분 및 전기 생리학 장비 무대에 다시 준비를 놓습니다.
2. 역에 대 한 자극 매개 변수 설정 (예를 들어, 15 V, 20 Hz 주파수, 20 ms 기간 및 2 분 (그림 2) 또는 20 시간 (그림 3)).
3. 동일한 모터 신경, 위와 같이 동일한 전극에 빨 아 그리고 SV exocytosis FM1 43 염료 릴리스를 활성화 하 자극.
4. 캘리포니아^{2 +}빠른 승계에서 세척-외부 염료 완전히 제거 되도록 하기 위해 식 염 수 (5 x 1 분)을 무료.
5. 신선한 캘리포니아^{2 +}에서 애벌레 준비를 유지-confocal 현미경으로 즉시 이미징에 대 한 무료 염 분.
6. 동일한 confocal 설정을 사용 하 여 위에서 설명한 동일한 NMJ에 FM1 43 염료 형광 이미지를 확인 합니다.

7. 옵션 3: Channelrhodopsin 자극 FM 염료 로드

1. ChR2 공동 인자 모든 trans 망막 (에탄올에 용 해, 100 µ M 최종 농도)를 포함 하는 음식에 ChR2 표현 애벌레를 올립니다.
2. 카메라 포트를 장착 해 부 현미경 스테이지에 플 렉 시 유리 챔버에 애벌레 준비를 놓습니다.
3. 파란색 LED를 연결 (470 nm; 자료의 테이블) 프로그래밍 가능한 자극 하는 동축 케이블을 사용 하 고 카메라 포트에 LED를 배치.
4. 블루 LED 빛 빔 현미경 확대/축소 기능을 사용 하 여 해 부 애벌레 함수에 초점.
5. 대체 Ca^{2 +}-optogenetic 스테이지의 FM1 43 염 분 (4 µ M, 1 mM CaCl₂) 위의 애벌레 준비에 무료 염 분.
6. (예를 들어, 15 V, 20 Hz 주파수, 20 ms 기간 및 시간 5 분 (그림 2)의) 자극 기를 사용 하 여 LED 매개 변수를 설정 합니다.
7. 빛 자극을 시작 하 고 (예를 들어, 5 분; optogenetic 자극 기간 미리 결정 된 기간에 대 한 타이머 추적 그림 2)입니다.
8. 타이머 중지, 신속 하 게 FM 염료 솔루션을 제거 하 고 대체 캘리포니아^{2 +}-SV를 막으려고 무료 염 분 사이클링.
9. 캘리포니아^{2 +}빠른 승계에서 세척-FM 염료 솔루션 완전히 제거 되도록 하기 위해 식 염 수 (5 x 1 분)을 무료.
10. 신선한 캘리포니아^{2 +}에서 애벌레 준비를 유지-confocal 현미경 위에서 이미징 프로토콜을 사용 하 여 즉시 이미징에 대 한 무료 염 분.
11. (세그먼트, 측면 및 근육) FM 염료 내리기 후 정확한 동일한 NMJ에 대 한 액세스를 보장 하기 위해 몇 군데 NMJ의 주의 기록해 둡니다.

8. Channelrhodopsin 자극: FM 염료 내리기

1. 대체 캘리포니아^{2 +}-카메라 포트 LED와 해 부 현미경 스테이지 (FM1 43 염료) 없이 일반 염 분으로 무료 염 분 유 충에 초점을 맞춘.
2. 언로드 (예를 들어, 15 V, 20 Hz 주파수, 20 ms 기간 및 2 분 (그림 2)의 시간)에 대 한 자극 매개 변수를 설정 합니다.
3. 빛 자극을 시작 하 고 optogenetic 자극 기간 미리 결정 된 기간에 대 한 타이머 추적 (예: 2 분; 그림 2)입니다.
4. 타이머 기간 끝나면 빨리 FM 염료 솔루션을 제거 하 고 바꿉니다 캘리포니아^{2 +}-SV를 막으려고 무료 염 분 사이클링.
5. 캘리포니아^{2 +}빠른 승계에서 세척-외부 염료 완전히 제거 되도록 하기 위해 식 염 수 (5 x 1 분)을 무료.
6. 신선한 캘리포니아^{2 +}에서 애벌레 준비를 유지-confocal 현미경으로 즉시 이미징에 대 한 무료 염 분.
7. 동일한 confocal 설정을 사용 하 여 위에서 설명한 동일한 NMJ에 FM1 43 염료 형광 이미지를 확인 합니다.

9. 형광 정량화

1. 이미지 J (NIH 오픈 소스)에서 이미지를 로드 하 고 이미지를 클릭 하 여 최대 강도 투영을 만듭니다 | 스택 | Z 프로젝트입니다.
2. 안티를 사용 하 여-HRP:647 채널, 이미지 이동 | 조정 | 임계값와 슬라이드 그냥 NMJ 선택 될 때까지 상단 도구 모음.
3. 자동 선택 도구 사용 하는 NMJ에 클릭 합니다. 불연속은 NMJ 이면 Shift 버튼을 누른 상태 고 모든 부품을 선택 합니다.
4. FM1 43 염료로 이미지를 변경 하 고 이동 분석 | 형광 측정을 측정 합니다.
5. (식별 된 세그먼트, 측면 및 근육) 같은 NMJ에서 "내려진된" 이미지에 대 한 단계 9.1-9.4 반복 합니다.
6. 로드 된 염료의 백분율을 얻으려면, 언로드/로드 형광 강렬의 비율을 가져가 라.
   참고:이 절차는 "타원형" 또는 "자유형" 선택 도구를 사용 하 여 bouton 당 bouton 기준 형광 분석을 수정할 수 있습니다. 배경 형광 근육 형광을 샘플링 하 여 공제 될 수 있습니다. 에이전트를 줄이기 위해이 배경을 추가할 수 있습니다.

결과

그림 1 프로토콜 이미징 활동 종속 FM 염료에 대 한 작업 흐름을 보여 줍니다. 실험은 항상 이후에 사용 되는 자극 방법에 관계 없이 같은 애벌레 접착제 해 부로 시작 합니다. 그림 1a 보여주는 복 부 신경 코드 (VNC), 신경 및 반복된 hemisegmental 근육 패턴을 발산 해 부 유 충의 회로도 이다. VNC 제거 되 고 준비 FM1-43 (...

토론

높은 [K⁺] 염 분 depolarizing 자극은 훨씬 활동 종속 FM 염료 사이클링, 하지만 가능성이 적어도 생리²⁹에 대 한 세 가지 옵션의 쉬운. 이 간단한 방법은 모든 액세스할 수 셀 전체 동물에 depolarizes 하 고 그래서 감독된 연구를 허용 하지 않습니다. 로컬로 micropipette와 높은 [K⁺] 염 분을 적용 하는 것만이 여전히 사전/postsynaptic 세포와 시 냅 스 연결 가능성이 명과

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
SylGard 184 Silicone Elastomer Kit	Fisher Scientific	NC9644388	To put on cover glass for dissections
Microscope Cover Glass 22x22-1	Fisherbrand	12-542-B	To put SylGard on for dissections
Aluminum Top Hot Plate Type 2200	Thermolyne	HPA2235M	To cure the SylGard
Plexi glass dissection chamber	N/A	N/A	Handmade
Borosilicate Glass Capillaries	WPI	1B100F-4	To make suction and glue micropipettes
Laser-Based Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-2000	To make suction and glue micropipettes
Tygon E-3603 Laboratory Tubing	Component Supply Co.	TET-031A	For mouth and suction pipette
P2 pipette tip	USA Scientific	1111-3700	For mouth pipette
0.6-mL Eppendorf tube cap	Fisher Scientific	05-408-120	Used to put glue in for dissection
Vetbond 3M	WPI	vetbond	Glue used for dissections
Potassium Chloride	Fisher Scientific	P-217	Forsaline
Sodium Chloride	Millipore Sigma	S5886	For saline
Magnesium Chloride	Fisher Scientific	M35-500	For saline
Calcium Chloride Dihydrate	Millipore Sigma	C7902	For saline
Sucrose	Fisher Scientific	S5-3	For saline
HEPES	Millipore Sigma	H3375	For saline
HRP:Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	123-605-021	To label neuronal membranes
Paintbrush	Winsor & Newton	94376864793	To manipulate the larvae
Dumont Dumostar Tweezers #5	WPI	500233	Used during dissection
7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm)	WPI	14177	Used during dissection
FM1-43	Fisher Scientific	T35356	Fluorescent styryl dye
Digital Timer	VWR	62344-641	For timing FM dye load/unload
LSM 510 META laser-scanning confocal microscope	Zeiss		For imaging the fluorescent markers
Zen 2009 SP2 version 6.0	Zeiss		Software for imaging on confocal
HeNe 633nm laser	Lasos		To excite HRP:647 during imaging
Argon 488nm laser	Lasos		To excite the FM dye during imaging
Micro-Forge	WPI	MF200	To fire polish glass micropipettes
20mL Syringe Slip Tip	BD	301625	To suck up the axon for electrical stimulation.
Micro Manipulator (magnetic base)	Narishige	MMN-9	To control the suction electrode for electrical stimulation
Stimulator	Grass	S48	To control the LED and electrical stimulation
Zeiss Axioskop Microscope	Zeiss		Used during electrical stimulation.
40X Achroplan Water Immersion Objective	Zeiss		Used during electrical stimulation and confocal imaging
All-trans Retinal	Millipore Sigma	R2500	Essential co-factor for ChR2
Zeiss Stemi Microscope with camera port	Zeiss	2000-C	Used during channelrhodopsin stimulation
LED 470nm	ThorLabs	M470L2	Used for ChR activation
T-Cube LED Driver	ThorLabs	LEDD1B	To control the LED
LED Power Supply	Cincon Electronics Co.	TR15RA150	To power the LED
Optical Power and Energy Meter	ThorLabs	PM100D	To measure LED intensity