Tintura di FM in bicicletta alla sinapsi: confronto tra alto potassio depolarizzazione, elettrica e stimolazione Channelrhodopsin

Riepilogo

Delle vescicole sinaptiche (SV) la bicicletta è il meccanismo di base della comunicazione intercellulare alle sinapsi neuronali. Rilascio e l'assorbimento della tintura di FM sono il mezzo primario di quantitativamente analizzante SV endo - ed esocitosi. Qui, mettiamo a confronto tutti i metodi di stimolazione per guidare FM1-43 ciclismo alla sinapsi Drosophila giunzione neuromuscolare (NMJ) modello.

Abstract

FM coloranti vengono utilizzati per studiare il ciclo delle vescicole sinaptiche (SV). Queste sonde di amphipathic hanno una testa idrofila e coda idrofobica, rendendoli solubili in acqua con la possibilità di reversibilmente entrare ed uscire lipidici di membrana. Questi coloranti styryl sono relativamente non fluorescente in ambiente acquoso, ma inserire il foglietto esterno della membrana plasmatica provoca un > 40 X aumentare in fluorescenza. Nelle sinapsi neuronali, FM coloranti sono interiorizzati durante endocitosi SV, smerciata sia all'interno che tra piscine SV e rilasciato con esocitosi SV, fornendo un potente strumento per visualizzare le fasi presinaptici della neurotrasmissione. Un modello genetico primario di sviluppo di sinapsi glutammatergiche e funzione è la Drosophila giunzione neuromuscolare (NMJ), dove FM tingere imaging è stato ampiamente utilizzata per quantificare la dinamica di SV in una vasta gamma di condizioni mutante. Il terminale sinaptico NMJ è facilmente accessibile, con una bella serie di grandi boutons sinaptici ideale per applicazioni di imaging. Qui, mettiamo a confronto e contrasto i tre modi per stimolare la drosofila NMJ guidare tintura l'assorbimento/rilascio di attività-dipendente FM1-43: applicazione 1) vasca di alta [K⁺] a depolarizzarsi tessuti neuromuscolari, 2) del nervo motore elettrodo di aspirazione stimolazione a depolarizzarsi nervi presinaptici terminali e 3) mirati transgenici espressione delle varianti channelrhodopsin per luce-stimolato un controllo spaziale di depolarizzazione. Ciascuno di questi metodi presenta vantaggi e svantaggi per lo studio degli effetti di mutazione genetica sul ciclo SV presso la drosofila NMJ. Discuteremo di questi vantaggi e svantaggi per facilitare la scelta dell'approccio stimolazione, insieme con le metodologie specifiche per ogni strategia. Oltre a formazione immagine fluorescente, FM coloranti possono essere photoconverted a elettrone-densi segnali visualizzati mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per lo studio dei meccanismi di ciclo SV a livello ultrastrutturale. Forniamo i confronti di confocale e la microscopia elettronica imaging da diversi metodi di stimolazione di Drosophila NMJ, per aiutare a guidare la selezione dei futuri paradigmi sperimentali.

Introduzione

Il modello splendidamente caratterizzato Drosophila larvale della giunzione neuromuscolare (NMJ) glutamatergic sinapsi è stato utilizzato per studiare la formazione della sinapsi e funzione con un vasto spettro di perturbazioni genetica¹. Il terminale del neurone di motore è costituito da più rami dell'assone, ognuno con molti boutons sinaptici allargata. Queste varicosità capiente (fino a 5 µm di diametro) contengono tutte la macchine di neurotrasmissione, comprese le vescicole sinaptiche glutamatergic uniforme (SVs; ~ 40 nm di diametro) nella riserva citosolico e facilmente rilasciabile piscine². Queste vescicole attraccano a zone attive di sito del fusione di membrana presinaptica (AZs), dove l'esocitosi media il rilascio di neurotrasmettitore glutammato per trans-comunicazione sinaptica. Successivamente, il SVs vengono recuperato dalla membrana plasmatica tramite bacio-and-run riciclaggio o endocytosis clathrin-mediato (CME) per cicli ripetuti exo/endocitosi. La Drosophila NMJ è facilmente accessibile e ben adatto per isolamento e caratterizzazione di mutanti di ciclo SV. Utilizzando schermi genetici avanti, mutazioni novelle hanno portato all'identificazione di nuovi geni critici per il ciclo di SV³. Inoltre, approcci genetici inverso a partire con geni già noti hanno portato alla delucidazione dei meccanismi di ciclo nuovi SV attraverso la descrizione accurata del mutante ciclismo fenotipi⁴. La Drosophila NMJ è quasi ideale come preparazione per dissezione meccanismi di endocitosi ed esocitosi SV tramite metodi di otticamente della vescicola di pista in bicicletta durante la neurotrasmissione sinaptica sperimentale.

Una gamma di marcatori fluorescenti permettono tracking visivo delle vescicole durante la pedalata dinamica, ma il più versatile sono analoghi di tintura di FM che è sintetizzato per la prima volta da Mao, F., et al. ⁵. strutturalmente, FM coloranti contengono una testa idrofila e una coda lipofilica collegato attraverso un anello aromatico, con una regione centrale che conferisce proprietà spettrali. Questi styryl coloranti partizione reversibilmente in membrane, non 'Flip-flop' tra membrana volantini e così non sono mai gratuito nel citosol e sono molto più fluorescente in membrane di acqua⁵. Inserimento reversibile in un bilayer del lipido provoca un volta 40 aumento nella fluorescenza⁶. Alle sinapsi neuronali, gli esperimenti d'etichettatura di colorante classici di FM consistono di balneazione la preparazione sinaptica con la tintura durante la depolarizzazione stimolazione per caricare tintura via il endocytosis SV. Tintura esterna viene quindi lavata e il ciclo SV viene arrestato in una soluzione di ringer senza calcio all'immagine caricata sinapsi⁷. Un secondo ciclo di stimolazione in un bagno di tintura-libero innesca il rilascio di FM attraverso l'esocitosi, un processo che può essere seguito misurando la diminuzione di intensità di fluorescenza. Popolazioni di SV da una vescicola singola per piscine contenenti centinaia di vescicole possono essere quantitativamente monitorati^6,7. FM coloranti sono stati utilizzati per sezionare la mobilitazione di attività-dipendente delle piscine SV funzionalmente distinte e per confrontare bacio-and-run vs CME ciclismo^8,9. Il metodo è stato modificato alla separatamente saggio evocato, ciclo sinaptica spontanea e miniatura attività (con attrezzature altamente sensibile per rilevare le variazioni molto piccole di fluorescenza e ridurre photobleaching)¹⁰. Le analisi possono essere estesa a livello ultrastrutturale di photoconverting il segnale FM fluorescente in un'etichetta elettrone-densi per trasmissione microscopia elettronica^11,12,13,14 .

Storicamente, la balneazione preparazioni sinaptiche in un'alta concentrazione di potassio (in appresso denominato "alta [K⁺]") è stato il metodo di scelta per depolarizzazione stimolazione per indurre SV ciclismo; compreso tra la rana colinergici NMJ⁵, coltivate roditore cervello neuroni ippocampali¹⁵, per il modello^16,di Drosophila glutamatergic NMJ¹⁷. Questo approccio [K⁺] alto è semplice, non richiede nessun attrezzature specializzate e pertanto è accessibile alla maggior parte dei laboratori, ma ha limitazioni per applicazione e interpretazione dei dati. Un metodo molto più fisiologicamente appropriato consiste nell'utilizzare l'aspirazione degli elettrodi di stimolazione elettrica del nervo^4,5,12. Questo approccio unità terminale la propagazione del potenziale d'azione per stimolazione diretta dei nervi presinaptici e risultati possono essere confrontati direttamente per le analisi elettrofisiologiche di neurotrasmissione funzione^{13,14, 15}, ma richiede attrezzature specializzate ed è tecnicamente molto più impegnativo. Con l'avvento di optogenetica, l'uso della stimolazione di un neurone channelrhodopsin ha altri vantaggi, tra cui uno stretto controllo spazio-temporale dell'espressione di canale utilizzando il binario sistema Gal4/UAS²⁰. Questo approccio è tecnicamente molto più facile che la stimolazione di aspirazione elettrodo e non richiede niente di più di una sorgente di luce LED molto a buon Mercata. Qui, ci avvaliamo di formazione immagine della FM1-43 (dibromuro di pyridinium-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl)N) sia e confrontare questi tre metodi di stimolazione diversi presso la drosofila NMJ: semplice alta [K⁺ ], sfidando channelrhodopsin elettrici e nuovi approcci.

Protocollo

1. larvale colla dissezione

1. Mescolare bene 10 parti di elastomero di silicone base con 1 parte di elastomero di silicone induritore dal kit di elastomero (Tabella materiali).
2. Cappotto 22x22 mm lamelle di vetro con l'elastomero e cura su un piatto caldo a 75 ˚ c per diverse ore (fino a quando non è più appiccicoso al tatto).
3. Posizionare un coprioggetto in vetro rivestite con elastomero singolo nella camera di dissezione di vetro plexi su misura (Figura 1, in basso) in preparazione per la dissezione larvale.
4. Preparare le pipette di colla dal capillare di vetro borosilicato con l'estrattore microelettrodo standard per ottenere la conicità desiderata e dimensione della punta.
5. Delicatamente rompere fuori la punta della micropipetta e a altra estremità, allegare 2 ft di tubo di plastica flessibile (1/32" diametro interno, ID; 3/32" diametro esterno, OD; 1/32" parete; Tabella materiali) con bocca raccordo (punta della pipetta P2).
6. Riempire un piccolo contenitore (cappuccio del tubo Eppendorf 0,6 mL) con un piccolo volume (~ 20 µ l) di colla (Tabella materiali) in preparazione per la dissezione larvale.
7. Riempire la camera con soluzione fisiologica (in mM): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl₂, 1 CaCl₂, saccarosio 70 e l'acido 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic 5 (HEPES) pH 7.2.
8. Aggiungere anti-rafano perossidasi (HRP) anticorpo coniugato a Alexa Fluor 647 (anti-HRP:647; diluito 01:10 da uno stock di 1 mg/mL) per l'etichettatura NMJ terminale presinaptico durante la dissezione^21,22.
9. Usando un pennello fine (taglia 2), rimuovere un errante instar terzo dal flaconcino di cibo e posto sul coperchio vetro rivestite con elastomero.
10. Riempire la punta di una micropipetta di vetro con una piccola quantità di colla usando pressione aria negativa generata dalla bocca con allegato (punto 1.5).
11. Posizione della larva dorsale dal lato con il forcipe e colla testa per il coprioggetto rivestite con elastomero con una piccola goccia di colla utilizzando la pressione dell'aria positiva per bocca.
12. Ripetere questa procedura con l'estremità posteriore della larva, assicurandosi che l'animale sia teso teso tra i due allegati di colla.
13. Utilizzando le forbici (lame 3 mm; Tabella materiali), fare un taglio orizzontale (~ 1 mm) al posteriore e un taglio verticale lungo la linea mediana dorsale.
14. Utilizzando una pinzetta (n. 5, Tabella materiali), delicatamente rimuovere trachea dorsale, dell'intestino, del grasso corporeo e altri organi interni che copre la muscolatura.
15. Ripetere la procedura di incollaggio per i quattro lembi di parete del corpo, facendo attenzione a stendere delicatamente la parete del corpo sia orizzontalmente che verticalmente.
16. Sollevare il cavo ventrale del nervo (VNC) usando il forcipe, accuratamente tagliato i nervi motori con le forbici e quindi rimuovere completamente il VNC.
17. Sostituire le saline di dissezione con Ca^{2 +}-gratis salino (stesso come le saline di dissezione sopra senza il CaCl₂) per interrompere SV in bicicletta.

2. opzione 1: High [K⁺] FM Dye caricamento

1. Da una soluzione madre di FM1-43 (4 mM), è necessario aggiungere 1 µ l ad 1 mL di soluzione di KCl (alto [K⁺] in soluzione salina dissezione) per una concentrazione finale di 4 µM di 90 mM.
2. Utilizzando una pipetta, sostituire il Ca^{2 +}-soluzione fisiologica gratis nella camera di imaging con la soluzione di colorante [K⁺] FM alta per stimolare l'assorbimento del colorante di endocitosi SV.
3. Avviare immediatamente un timer digitale per la durata predeterminata dell'alto [K⁺] depolarizzanti periodo di stimolazione (ad es., 5 min; Figura 2).
4. Per confermare una sana preparazione larvale, notare le forti contrazioni della muscolatura per tutta la durata del periodo di depolarizzazione alta [K⁺].
5. Al termine del periodo di timer, rimuovere la soluzione di colorante [K⁺] FM alta e sostituire rapidamente con Ca^{2 +}-libera soluzione fisiologica per interrompere SV in bicicletta.
6. Lavare in rapida successione con il Ca^{2 +}-gratis salino (5x per 1 min) per garantire la soluzione di colorante [K⁺] FM alta viene completamente rimosso.
7. Mantenere la preparazione larvale in fresco Ca^{2 +}-soluzione fisiologica gratuito per formazione immagine immediata con il microscopio confocale.

3. imaging: Microscopia confocale

1. Utilizzare un microscopio confocale dritto con un 40 X obiettivo a immersione in acqua a fluorescenza di tintura NMJ immagine (possono essere usati altri microscopi).
2. Immagine 4 NMJ dei segmenti addominali 2-4 (può essere imaged altri NMJs) del muscolo e raccogliere immagini usando il software adatto (Tabella materiali).
3. Utilizzare laser HeNe 633 nm per eccitare HRP:647 (con filtro passa-lungo > 635 nm) e un laser di Argon 488 nm per eccitare FM1-43 (con passa-banda filtro 530-600 nm).
4. Operativamente determinare ottima guadagno e offset per entrambi i canali.
   Nota: Queste impostazioni rimarrà costante per tutto il resto dell'esperimento.
5. Prendere uno Z-stack confocale attraverso intero NMJ selezionato dall'alto HRP-segnata verso il basso del terminale sinaptico.
6. Prendere nota delle NMJ imaged (segmento, lato e muscolare) per garantire in eccesso di NMJ stesso esatto dopo FM tingere lo scarico.

4. alta [K⁺] stimolazione: FM Dye scarico

1. Sostituire Ca^{2 +}-libera soluzione fisiologica con la soluzione fisiologica [K⁺] alta (senza tintura FM1-43) a depolarizzazione in auto, rilascio di esocitosi e tintura SV.
2. Avviare immediatamente un timer digitale per la pre-determinata durata del periodo di stimolazione [K⁺] alta (ad es., 2 min; Figura 2).
3. Al termine del periodo di timer, immediatamente rimuovere le saline [K⁺] alta e sostituirli con Ca^{2 +}-libera soluzione fisiologica per interrompere SV in bicicletta.
4. Lavare in rapida successione con Ca^{2 +}-gratis salino (5x per 1 min) per garantire l'alta soluzione salina [K⁺] viene completamente rimosso.
5. Mantenere la preparazione larvale in fresco Ca^{2 +}-soluzione fisiologica gratuito per formazione immagine immediata con il microscopio confocale.
6. Essere certi di immagine la fluorescenza di tintura FM1-43 alle NMJ stesso indicato in precedenza utilizzando le stesse impostazioni confocale.

5. opzione 2: Stimolazione elettrica FM Dye caricamento

1. Preparare una pipetta aspirazione usando l'estrattore di microelettrodi (Tabella materiali) per ottenere la conicità necessaria e dimensione della punta.
2. Fuoco-polacco la punta microelettrodo con un micro-forge fino a quando un singolo nervo motore può essere aspirato con una perfetta aderenza.
3. Far scorrere aspirazione pipetta sul supporto elettrodo un micromanipolatore e collegare il tubo di plastica lungo e flessibile e una siringa.
4. Impostare i parametri dello stimolatore (ad es., 15 V, frequenza di 20 Hz, 20 ms durata e tempo di 5 min (Figura 2) o 1 min (Figura 3)).
5. Sostituire il Ca^{2 +}-salino gratuito sulla preparazione larvale con sopra salino FM1-43 (4 µM; 1 mM CaCl₂) sull'impianto di perforazione di elettrofisiologia.
6. Mettere il preparato sulla fase di microscopio e alzare il tavolino fino a quando la larva e pipetta di aspirazione sono a fuoco (obiettivo a immersione in acqua X 40).
7. Aspirare con un ciclo di taglio del nervo motore che innerva il selezionato hemisegment con pressione aria negativa generata dalla siringa in aspirazione elettrodo.
8. Verificare la funzione di aspirazione elettrodo con una breve raffica di stimolazione monitorando visivamente per la contrazione muscolare nella hemisegment selezionata.
9. Stimolare il nervo motore utilizzando parametri selezionati (punto 5.4) per guidare endocitosi SV e l'assorbimento della tintura di FM1-43 (Figura 2).
10. Lavare in rapida successione con Ca^{2 +}-gratis salino (5x per 1 min) per garantire la soluzione di colorante FM1-43 viene completamente rimosso.
11. Mantenere la preparazione larvale in fresco Ca^{2 +}-salino gratuito per formazione immagine immediata utilizzando il protocollo di imaging confocale dall'alto.
12. Prendere nota delle NMJ imaged (segmento, lato e muscolare) per garantire l'accesso a NMJ stesso esatto dopo lo scarico della tintura di FM.

6. elettrostimolazione: FM Dye scarico

1. Sostituire il Ca^{2 +}-gratis salino con soluzione salina normale (senza tintura FM1-43) e posizionare la preparazione torna sulla scena del impianto di perforazione di elettrofisiologia.
2. Impostare i parametri di stimolatore per lo scarico (per esempio, 15 V, frequenza 20 Hz, 20 ms di durata e tempo di 2 min (Figura 2) o 20 s (Figura 3)).
3. Succhiano il nervo motore stesso l'elettrodo stesso come sopra e quindi stimolare per attivare SV esocitosi e rilascio di tintura FM1-43.
4. Lavare in rapida successione con Ca^{2 +}-gratis salino (5x per 1 min) per garantire la tintura esterna è completamente rimosso.
5. Mantenere la preparazione larvale in fresco Ca^{2 +}-soluzione fisiologica gratuito per formazione immagine immediata con il microscopio confocale.
6. Garantire per la fluorescenza di tintura FM1-43 alle NMJ stesso indicato in precedenza utilizzando le stesse impostazioni di confocale di immagine.

7. opzione 3: Channelrhodopsin stimolazione FM Dye caricamento

1. Sollevare le larve ChR2-esprimendo il cibo contenente retinico ChR2 co-fattore tutto-trans (disciolto in etanolo; una concentrazione finale di 100 µM).
2. Luogo la preparazione larvale nella camera di plexiglass su una fase di microscopio di dissezione dotata di una porta di fotocamera.
3. Collegare un LED blu (470 nm; Tabella materiali) a uno stimolatore programmabile tramite un cavo coassiale e posizionare il LED alla porta della fotocamera.
4. Focalizzare il fascio di luce LED blu sulla funzione larvale dissecata utilizzando la funzione di zoom microscopio.
5. Sostituire il Ca^{2 +}-salino gratuito sulla preparazione larvale con sopra salino FM1-43 (4 µM; 1 mM CaCl₂) sul palco optogenetica.
6. Impostare i parametri di LED utilizzando lo stimolatore (ad es., 15 V, frequenza 20 Hz, 20 ms di durata e tempo di 5 min (Figura 2)).
7. Avviare la stimolazione luminosa e traccia con un timer per la pre-determinata durata del periodo di stimolazione di optogenetica (ad es., 5 min; Figura 2).
8. Quando il timer si arresta, rapidamente rimuovere la soluzione di colorante FM e sostituirli con Ca^{2 +}-salino gratuito per fermare la SV in bicicletta.
9. Lavare in rapida successione con il Ca^{2 +}-gratis salino (5x per 1 min) per garantire la soluzione di colorante FM viene completamente rimosso.
10. Mantenere la preparazione larvale in fresco Ca^{2 +}-salino gratuito per formazione immagine immediata con il microscopio confocale mediante imaging protocollo dall'alto.
11. Prendere nota delle NMJ imaged (segmento, lato e muscolare) per garantire l'accesso a NMJ stesso esatto dopo lo scarico della tintura di FM.

8. Channelrhodopsin stimolazione: FM Dye scarico

1. Sostituire Ca^{2 +}-libera soluzione fisiologica con salino normale (senza tintura FM1-43) sul tavolino del microscopio di dissezione con porta telecamera LED focalizzato sulla larva.
2. Impostare i parametri di stimolatore per scarico (ad es., 15 V, frequenza 20 Hz, 20 ms di durata e tempo di 2 min (Figura 2)).
3. Avviare la stimolazione luminosa e traccia con un timer per il pre-determinata durata del periodo di stimolazione optogenetica (ad es., 2 min; Figura 2).
4. Al termine del periodo di timer, rimuovere la soluzione di colorante FM e sostituire rapidamente con Ca^{2 +}-salino gratuito per fermare la SV in bicicletta.
5. Lavare in rapida successione con Ca^{2 +}-gratis salino (5x per 1 min) per garantire la tintura esterna è completamente rimosso.
6. Mantenere la preparazione larvale in fresco Ca^{2 +}-soluzione fisiologica gratuito per formazione immagine immediata con il microscopio confocale.
7. Garantire per la fluorescenza di tintura FM1-43 alle NMJ stesso indicato in precedenza utilizzando le stesse impostazioni di confocale di immagine.

9. fluorescenza quantificazione

1. Caricare l'immagine in immagine J (opensource NIH) e creare una proiezione di massima intensità cliccando immagine | Stack | Progetto di Z.
2. Usando l'anti-HRP:647 canale, vai a immagine | Regolare | Soglia e far scorrere la barra degli strumenti in alto finché non viene evidenziato solo NMJ.
3. Usando lo strumento bacchetta, fate clic sulla giunzione neuromuscolare. Se la giunzione neuromuscolare è discontinuo, tenere premuto il tasto MAIUSC e selezionare tutte le parti.
4. Cambiare l'immagine per il canale di tintura FM1-43 e andare a Analyze | Misura per ottenere la misura della fluorescenza.
5. Ripetere i passaggi 9.1-9.4 per l'immagine "scaricato" dalla stessa giunzione neuromuscolare (segmento identificato, lato e muscolo).
6. Per ottenere la percentuale di tintura che è stata scaricata, prendere il rapporto tra le intensità di fluorescenza scaricati/caricati.
   Nota: Questa procedura può essere modificata per analizzare fluorescenza su una base di bouton-a-bouton utilizzando gli strumenti di selezione "ovale" o "a mano libera". Fluorescenza di fondo può essere sottratto campionando la fluorescenza di muscolo. Agenti possono anche essere aggiunti per ridurre questo sfondo.

Risultati

La figura 1 Mostra il flusso di lavoro per la tintura di FM di attività-dipendente imaging protocol. L'esperimento inizia sempre con la dissezione larvale colla stessa, indipendentemente dal metodo di stimolazione utilizzato successivamente. Figura 1a è un disegno schematico di una larva dissecata, mostrando il cavo ventrale del nervo (VNC), irradiando i nervi e pattern muscolari ripetute hemisegmental. Il VNC è rimosso e la p...

Discussione

Alta [K⁺] Salina depolarizzazione stimolazione è di gran lunga la più semplice delle tre opzioni per tintura di FM di attività-dipendente in bicicletta, ma probabilmente il meno fisiologico²⁹. Questo semplice metodo depolarizza ogni cellula accessibile nell'animale intero e così non permette studi diretti. Potrebbe essere possibile applicare localmente alta [K⁺] soluzione fisiologica con una micropipetta, ma questo sarà ancora depolarizzarsi cellule pre/post-sinaptica e ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
SylGard 184 Silicone Elastomer Kit	Fisher Scientific	NC9644388	To put on cover glass for dissections
Microscope Cover Glass 22x22-1	Fisherbrand	12-542-B	To put SylGard on for dissections
Aluminum Top Hot Plate Type 2200	Thermolyne	HPA2235M	To cure the SylGard
Plexi glass dissection chamber	N/A	N/A	Handmade
Borosilicate Glass Capillaries	WPI	1B100F-4	To make suction and glue micropipettes
Laser-Based Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-2000	To make suction and glue micropipettes
Tygon E-3603 Laboratory Tubing	Component Supply Co.	TET-031A	For mouth and suction pipette
P2 pipette tip	USA Scientific	1111-3700	For mouth pipette
0.6-mL Eppendorf tube cap	Fisher Scientific	05-408-120	Used to put glue in for dissection
Vetbond 3M	WPI	vetbond	Glue used for dissections
Potassium Chloride	Fisher Scientific	P-217	Forsaline
Sodium Chloride	Millipore Sigma	S5886	For saline
Magnesium Chloride	Fisher Scientific	M35-500	For saline
Calcium Chloride Dihydrate	Millipore Sigma	C7902	For saline
Sucrose	Fisher Scientific	S5-3	For saline
HEPES	Millipore Sigma	H3375	For saline
HRP:Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	123-605-021	To label neuronal membranes
Paintbrush	Winsor & Newton	94376864793	To manipulate the larvae
Dumont Dumostar Tweezers #5	WPI	500233	Used during dissection
7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm)	WPI	14177	Used during dissection
FM1-43	Fisher Scientific	T35356	Fluorescent styryl dye
Digital Timer	VWR	62344-641	For timing FM dye load/unload
LSM 510 META laser-scanning confocal microscope	Zeiss		For imaging the fluorescent markers
Zen 2009 SP2 version 6.0	Zeiss		Software for imaging on confocal
HeNe 633nm laser	Lasos		To excite HRP:647 during imaging
Argon 488nm laser	Lasos		To excite the FM dye during imaging
Micro-Forge	WPI	MF200	To fire polish glass micropipettes
20mL Syringe Slip Tip	BD	301625	To suck up the axon for electrical stimulation.
Micro Manipulator (magnetic base)	Narishige	MMN-9	To control the suction electrode for electrical stimulation
Stimulator	Grass	S48	To control the LED and electrical stimulation
Zeiss Axioskop Microscope	Zeiss		Used during electrical stimulation.
40X Achroplan Water Immersion Objective	Zeiss		Used during electrical stimulation and confocal imaging
All-trans Retinal	Millipore Sigma	R2500	Essential co-factor for ChR2
Zeiss Stemi Microscope with camera port	Zeiss	2000-C	Used during channelrhodopsin stimulation
LED 470nm	ThorLabs	M470L2	Used for ChR activation
T-Cube LED Driver	ThorLabs	LEDD1B	To control the LED
LED Power Supply	Cincon Electronics Co.	TR15RA150	To power the LED
Optical Power and Energy Meter	ThorLabs	PM100D	To measure LED intensity