Wahl und No-Wahl Bioassays zur Untersuchung der Verpuppung Präferenz und Entstehung Erfolg der Ectropis grisescens

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Untersuchung der Verpuppung Präferenz der Reife Larven von Ectropis Grisescens in Reaktion auf Boden Faktoren (z.B. Substrat Art und Feuchtigkeit-Inhalt) mit Wahl Bioassays. Wir präsentieren auch ein Protokoll der keine-Wahl Bioassays, die Faktoren zu bestimmen, die die Verpuppung Verhalten beeinflussen und Hinterbliebene von E. Grisescens.

Zusammenfassung

Viele Insekten Leben als Larven und Erwachsene über dem Boden und verpuppen sich als unter der Erde. Im Vergleich zu den oberirdischen Stadien ihres Lebenszyklus, hat weniger Aufmerksamkeit wie ökologische Faktoren beeinflussen diese Insekten ausgezahlt wenn sie im Boden zu verpuppen. Die Tee-Looper, Ectropis Grisescens Warren (Lepidoptera: Geometridae), ist eine schwere Pest von Teepflanzen und führte zu große wirtschaftlichen Verlusten in Süd-China. Die Protokolle beschrieben hier zu untersuchen, durch Multiple-Choice-Bioassays zielen darauf ab, ob ältere letzte Instar E. Grisescens Larven können Boden Variablen wie das Substrat Art und Feuchtigkeit-Inhalt zu unterscheiden und zu bestimmen, durch nicht-Wahl Biotests, die Auswirkungen Substrat Art und Feuchtigkeit Inhalt Verpuppung Verhaltensweisen und der Entstehung Erfolg E. Grisescens. Die Ergebnisse würde fördern das Verständnis für die Verpuppung Ökologie E. Grisescens und Einblicke in Bodenmanagement Taktik für die Unterdrückung von E. Grisescens Bevölkerungen bringen können. Darüber hinaus können diese Bioassays geändert werden, um die Einflüsse verschiedener Faktoren auf die Verpuppung Verhaltensweisen und Survivorship Boden Orchideenfarmen Schädlinge zu studieren.

Einleitung

Im Vergleich zu den Larven und adulten Stadien von Insekten, ist das Puppenstadium sehr anfällig, aufgrund der begrenzten mobilen Fähigkeit von Puppen, die aus gefährlichen Situationen schnell entweichen kann. Verpuppung im Boden ist eine gemeinsame Strategie, die von verschiedenen Gruppen von Insekten verwendet (z. B.in den Aufträgen Diptera^1,2,3,4, Coleoptera⁵, Hymenoptera⁶, Thysanoptera⁷und Lepidoptera^8,9,10,11,12) vor oberirdischen Raubtiere und Gefahren für die Umwelt zu schützen. Viele davon sind schwere Land- und forstwirtschaftliche Schädlinge^{1,2,3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12}. Die Reifen Larven dieser Erde Orchideenfarmen Insekten in der Regel verlassen ihre Wirte, auf den Boden fallen, um eine richtige Website finden, in den Boden graben und bauen eine pupal Kammer zur Verpuppung^8,10wandern.

Die Tee-Looper, Ectropis Grisescens Warren (Lepidoptera: Geometridae), ist eines der bedeutendsten Defoliator Schädlinge von den Tee Pflanze Camellia Sinensis L.¹³. Obwohl dieser Art erstmals im Jahr 1894 beschrieben wurde, es wurde fälschlicherweise als identifiziert Ectropis Obliqua Prout (Lepidoptera: Geometridae) in der Vergangenheit Jahrzehnte^14,15. Die Unterschiede in der Morphologie, Biologie und geografische Verteilung zwischen den beiden Geschwister-Arten wurden in einigen jüngsten Studien^14,15,16beschrieben. Zum Beispiel, Zhang Et al. ¹⁵ berichtet, dass E. schräg vor allem an den Grenzen der drei Provinzen (Anhui, Jiangsu und Zhejiang) aufgetreten, während E. Grisescens eine viel breitere Streuung im Vergleich hat zu E. schräg. Daher die wirtschaftlichen Verluste durch E. Grisescens sind weitgehend übersehen, und das Wissen von diesem Schädling muss umfassend überarbeitet und erneuert^16,17,18,19 . Unsere früheren Studien zeigten, dass E. Grisescens im Boden zu verpuppen gern aber könnte auch verpuppen, wenn Boden nicht verfügbar (keine-Verpuppung-Substrat Bedingungen)^11,12.

Dieses Dokument enthält eine schrittweise Anleitung (1) bestimmen die Verpuppung Bevorzugung von E. Grisescens als Reaktion auf Faktoren wie Substrattyp und Feuchtigkeit Inhalt mithilfe von Multiple-Choice-Bioassays und (2) bestimmen Sie die Auswirkungen von abiotischen Faktoren auf die Verpuppung Verhaltensweisen und Entstehung Erfolg von E. Grisescens mithilfe von Bioassays keine Wahl. Alle diese Bioassays sind unter kontrollierten Laborbedingungen durchgeführt. Auch sind diese Bioassays angepasst, um den Einfluss anderer Faktoren auf die Verpuppung Verhaltensweisen und Hinterbliebene von unterschiedlichen Böden Orchideenfarmen Insekten zu bewerten.

Protokoll

(1) Feuchtigkeit-Wahl Bioassays zu bestimmen Verpuppung Bevorzugung von E. grisescens

1. Beschaffung von Reifen letzte Instar Larven von E. grisescens
   1. Schneiden Sie frische trieben (30-40 cm Länge) der Teepflanzen (Camellia Sinensis L.). Eine dreieckige Flasche 250 mL stecken Sie 25-30 Triebe. Füllen Sie die Flasche mit Wasser aus dem Wasserhahn. Setzen Sie 3-4 Flaschen (mit Tee Triebe) in einen Kunststoff Becken (Oberseite: 51 cm im Durchmesser; unten: 40 cm Durchmesser, Höhe: 16 cm).
   2. Lassen Sie 1.000-2.000 Larven (zweite bis fünfte instar) der Labor-Kolonie von E. Grisescens auf die Blätter der Tee Triebe in jedem Becken. Diese Larven bei kontrollierten Laborbedingungen zu erhalten [eine Photoperiode von 14 h Licht gefolgt von 10 h dunkel (14:10 L:D), 60-90 % Relative Luftfeuchtigkeit (RH) und 24-28 ° C]. Übertragen Sie den Larven auf frische Blätter sorgfältig von Hand alle 1-2-d. Jeden Tag entfernen Sie Kot und Schmutz am Boden der Becken.
   3. Wählen Sie Reife letzte Instar-Larven, die aus den Blättern der Tee Triebe und aktiv Wandern auf dem Boden des Beckens. Erhalten Sie mindestens 240 Reifen Larven um sicherzustellen, dass genug Larven für die Bioassays zur Verfügung stehen.
      Hinweis: Wählen Sie nur aktiv wandernde Larven für die Experimente. Wählen Sie Larven, die auf den Blättern bleiben nicht aus, da diese nicht zum verpuppen bereit sind. Wählen Sie Prepupae mit eingeschränkten mobilen Aktivitäten auch nicht, weil sie nicht aktiv für die richtigen Bedingungen zu suchen werden nach seiner Freilassung in die Bioassay-Arenen.
2. Substrataufbereitung
   1. Sammeln und 4 Arten von Substrat zu identifizieren (z.B.Sand, sandiger Lehm 1, sandigen Lehm 2 und Schlick Lehm) mit dem Hydrometer Methode²⁰. Sterilisieren Sie die Erde und Sand bei 80 ° C Backofen Trockner für > 3-d, und dann trocknen Sie vollständig des Bodens und der Sand bei 50 ° C für mehrere Wochen, bis das Trockengewicht der Substrat-Proben nicht mehr im Laufe der Zeit ändert.
   2. Boden der trockenen Boden mit hölzernen Stößel und Mörser. Der Sand und der geerdeten Boden durch ein 3 mm Sieb sichten und in verschließbaren Plastikbeutel aufbewahren.
   3. Berechnen Sie die unterschiedliche Feuchtigkeitsgehalte von jedem Substrat (Sand, sandiger Lehm 1, sandigen Lehm 2 oder Schluff, Lehm) wie folgt²:
      
   4. Fügen Sie die erforderliche Menge an destilliertem Wasser in den verschließbaren Plastikbeutel mit dem trockenen Boden oder Sand, 5 vorzubereiten %-20 %-35 %, 50 % - 65 % und 80 % feuchte Substrat. Mischen Sie das destillierte Wasser und die Erde oder Sand.
3. Bioassay Arena Vorbereitung
   1. Ebenso teilen die Polypropylen Behälter (Oberseite: 20,0 cm lang x 13,5 cm breit, Unterseite: 17,0 cm lang x 10,0 cm in der Breite, Höhe: 6,5 cm) in 6 Kammern mit wasserdichten Polyvinylchlorid (PVC) Blätter (Höhe: 3,5 cm). Fixieren Sie die PVC-Platten und versiegeln Sie die Risse mit Heißkleber.
      Hinweis: Vollständig zu verschließen irgendein Sprung um Wassereintrag zu verhindern.
   2. Füllen Sie für jeden Test, 6 Kammern, die mit der gleichen Art des Substrates mit verschiedenen Feuchtigkeitsgehalt (5 %-20 %-35 %-50 % - 65 % und 80 % Feuchtigkeit) (Abbildung 1a).
      Hinweis: Verwenden Sie nur 1 Art von Substrat aus verschiedenen Feuchtigkeitsgehalt in jedem Test. Nach dem Zufallsprinzip ordnen Sie die Reihenfolge der Kammern, die das Substrat mit dem 6-Feuchtigkeit-Inhalt enthalten.
   3. Fügen Sie 4-6 Stücke frischen Teeblätter mit kleine Stücke der Band um die Innenfläche der Lider der Polypropylen-Container (Abbildung 1 b) zu decken.

Abbildung 1: Beispiele für Bioassay Arenen für die Choice-Tests. (ein) wasserdicht Polyvinylchlorid (PVC) Pläne dienen, ebenso die Polypropylen Behälter in 6 Kammern zu unterteilen. PVC-Platten sind mit Heißkleber fixiert, und Risse sorgfältig abgedichtet. In diesem Beispiel sandiger Lehm 2 mit verschiedenen Feuchtigkeitsgehalt (5 %, 20 %, 35 %, 50 %, 65 % und 80 % Feuchtigkeit) werden verwendet, um die Kammern in die nach dem Zufallsprinzip zugeordneten Aufträge zu füllen. (b) frischen Tee Blätter aufgeklebt auf der Innenseite der Deckel wo die ausgereifte Ectropis Grisescens Larven erscheinen wird. (c) PVC-Blätter werden verwendet, um gleichermaßen die Polypropylen Behälter in 4 Kammern, unterteilen, die gefüllt sind mit 4 Typen von Substraten (Sand, sandiger Lehm 1, sandigen Lehm 2 und Schlick Lehm) bei 50 % Feuchtigkeit. Diese Zahl wurde von Wang Et Al. modifiziert ¹¹. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

4. Bioassay Einstellung und Datenaufzeichnung
   1. Lassen Sie 30 Reifen letzte Instar Larven (erhältlich im Schritt 1.1.3) auf die frischen Teeblätter auf dem Deckel des Behälters Polypropylen eingefügt. Stürzen Sie den Deckel vorsichtig und bedecken Sie dicht die Polypropylen Behälter.
   2. Wiederholen Sie jeden test 8 X. Pflegen Sie die Bioassay-Arenen in einer Klimakammer bei einer Photoperiode 14:10 (L:D) und 26 ° C.
   3. Am 5. Tag die Anzahl der Puppen auf der Oberfläche des Bodens in jeder Kammer. Auch die Bioassays demontieren und die Anzahl der Puppen in das Substrat.
      Hinweis: Nur zählen Sie die live Puppen auf oder in das Substrat. Überprüfen Sie die Puppen Lebensfähigkeit durch Beobachtung Abdominal-Bewegungen nach dem Berühren der Puppen mit Pinzette.
5. Datenanalysen
   1. Berechnen Sie für jeden Test den Prozentsatz der Puppen gefunden in jeder Kammer jedes replizieren. Datenübertragung der Prozentsatz der Log-Verhältnis mit der Methode von Kucera und Malmgren²¹zur Verfügung gestellt.
   2. Vergleichen Sie den Prozentsatz der Puppen (transformierten Daten) in jeder Kammer mit einem One-Way Varianzanalyse (ANOVA). Stellen Sie die Bedeutung Pegel bei α = 0,05 für jeden Test.

(2) Substrat-Wahl Bioassays bestimmen die Verpuppung Bevorzugung von E. grisescens

1. Wiederholen Sie Schritt 1.1 Reifen letzte Instar Larven zu erhalten, und Schritt 1.2 um das Substrat mit verschiedenen Feuchtigkeitsgehalt vorzubereiten. Diesmal, nur 20 %, 50 % und 80 % feuchte Substrat sind erforderlich.
2. Vorbereitung der Bioassay Arenen
   1. Ähnlich wie bei Schritt 1.3.1, ebenso die Polypropylen Behälter in 4 Kammern mit PVC-Folien aufteilen. Fixieren Sie die PVC-Platten und versiegeln Sie die Risse mit Heißkleber.
   2. Für jeden Test, füllen die Kammern mit 4 Typen von Substraten (Sand, sandiger Lehm 1, sandigen Lehm 2 und Schluff, Lehm), die den gleichen Feuchtigkeitsgehalt (20 %, 50 % oder 80 % Feuchtigkeit) mit zufällig zugewiesenen Aufträge (Abbildung 1 c). Wiederholen Sie Schritt 1.3.3 die Deckel vorbereiten.
3. Wiederholen Sie Schritt 1.4 die Bioassays und notieren Sie die Daten und Schritt 1.5 um die Daten zu analysieren.

3. No-Wahl Bioassays Boden wühlen Verhalten und Entstehung Erfolg von E. Grisescens bestimmen

1. Wiederholen Sie Schritt 1.1, die Reife letzte Instar Larven zu erhalten, und Schritt 1.2 zur Vorbereitung der 4 Substrate (Sand, sandiger Lehm 1, sandigen Lehm 2 und Schlick Lehm) bei 3 Feuchtigkeitsgehalt (20 %, 50 % und 80 % Feuchtigkeit).
2. Bioassay Einstellung
   1. Fügen Sie das Substrat in einem Plastikbehälter (Oberseite: 11,5 cm im Durchmesser; unten: 8,5 cm im Durchmesser, Höhe: 6,5 cm) bis zu einer Tiefe von 3 cm. Insgesamt sicherzustellen Sie, dass es 12 Behandlungen (die Kombinationen von 4 Arten von Substrat und 3 Feuchtigkeitsgehalt). Wiederholen Sie jede Behandlung 7 X.
   2. Lassen Sie 15 Reifen letzte Instar Larven auf das Substrat von jeder Bioassay-Arena. Versiegeln Sie die Behälter durch die Deckel dicht abdecken. Pflegen Sie die Bioassays in einer Klimakammer bei einer Photoperiode 14:10 (L:D) und 26 ° C.
      Hinweis: Es werden keine Notwendigkeit, frischen Teeblätter auf den Deckeln, wie bereits in der Wahl Bioassays einfügen.
3. Datenaufzeichnung und Analysen
   1. Am 3. Tag die Anzahl der Puppen und Toten Larven an der Oberfläche des Substrates von jedem replizieren. Den Prozentsatz der E. Grisescens Einzelpersonen, die in das Substrat wie folgt eingegraben zu berechnen:
      
   2. Notieren Sie die Anzahl der aufstrebenden Erwachsene pro Tag, bis keine weiteren Erwachsenen für 15 entstanden d. Entstehung Erfolg wie folgt berechnen:
      
   3. Vergleichen Sie den Prozentsatz der eingegrabene Einzelpersonen und der Entstehung Erfolg unter den Behandlungen mit One-Way ANOVA. Stellen Sie die Bedeutung Pegel bei α = 0,05.

Ergebnisse

Die Feuchtigkeit-Wahl Bioassays zeigten, dass deutlich mehr E. Grisescens Individuen pupated auf oder innerhalb von 5 % und 35 % Feuchtigkeit Sand im Vergleich zu den 80 %-Feuchtigkeit-Sand (Abbildung 2a). Jedoch deutlich lieber mehr Menschen verpuppen sich auf oder im Boden (1 und 2 sandiger Lehm und Schlamm Lehm), der einen mittleren Feuchtigkeitsgehalt (Abbildungen 2 b - 2d) hatte.

Diskussion

Verpuppung Vorlieben reagieren auf verschiedene Böden Variablen sind in ein paar Schädlinge^6,9,22,23untersucht worden. Um beispielsweise die Präferenz der Reife Larven Bactrocera Tryoni (Froggatt) studieren (Diptera: Morgan) unter verschiedenen Bodenbedingungen Feuchtigkeit Hulthen und Clarke²² Bühnenbild ein 3 x 3 Latein-Platz mit 9 Behälter gefüllt mit B...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Triangular flask	Bomex Chemical (Shanghai) Co., LTD	99	250 mL
Plastic basin	Chahua, Fuzhou, China	100	upper side: 51 cm in diameter; bottom side: 40 cm in diameter; height: 16 cm
Zip lock bags	Glad, Guangzhou, China	126/133
Polypropylene containers	Youyou Plastic Factory, Taian, China	139/155/160/161/190	upper side: 20.0 cm [L] × 13.5 cm [W], bottom side: 17.0 cm [L] × 10.0 cm [W], height: 6.5 cm
Waterproof polyviny chloride sheet	Yidimei, Shanghai, China	141
Tape	V-tech, Guangzhou, China	VT-710
Oven drier	Kexi, Shanghai, China	KXH-202-3A
Environmental chamber	Life Apparatus, Ningbo, China	PSX-280H