Chromatin Immunopräzipitation der murinen braunen Fettgewebe

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll für effiziente Chromatin Immunopräzipitation (ChIP), gefolgt von Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung (ChIP-Seq) von braunen Fettgewebe (BAT) isoliert von einer Maus. Dieses Protokoll eignet sich für sowohl mapping Histon Änderungen und genomweite Lokalisierung von Histonproteine von Interesse in Vivozu untersuchen.

Zusammenfassung

Die zelluläre Prozesse werden durch transkriptionelle Modulation der spezifischen Genprogramme geregelt. Diese Modulation wird durch die kombinierte Aktionen einer breiten Palette von Transkriptionsfaktoren (TFs) und Cofaktoren Vermittlung transkriptionelle Aktivierung oder Unterdrückung über Veränderungen in der Chromatinstruktur erreicht. Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) ist eine nützliche molekularbiologische Ansatz für mapping Histon Änderungen und Transkription Faktoren/Cofaktoren Bindung an DNA-profiling, wodurch eine Momentaufnahme der dynamischen nuklearen Veränderungen während der verschiedenen biologische Prozesse.

Um transcriptional Regelung im Fettgewebe zu studieren, abgeleitete von in-Vitro Zellkulturen von Proben verewigt oder Primärzelle Linien werden oft wegen der Fülle des Ausgangsmaterials in ChIP-Assays begünstigt und biologischen Variabilität reduziert. Jedoch stellen diese Modelle eine begrenzte Momentaufnahme des tatsächlichen Chromatin Staates in lebenden Organismen. So gibt es eine kritische Notwendigkeit für optimierte Protokolle, ChIP an Fettgewebe Proben abgeleitet aus Tiermodellen durchzuführen.

Hier beschreiben wir ein Protokoll für effiziente ChIP-Seq Histon-Modifikationen und Histonproteine im braunen Fettgewebe (BAT) isoliert von einer Maus. Das Protokoll ist für die Untersuchung von genomweiten Lokalisierung der Proteine des Interesses und epigenetischen Markern in der Fledermaus, die ein morphologisch und physiologisch unterschiedlichen Gewebe unter Fettdepots ist optimiert.

Einleitung

Während weißen Fettgewebe (WAT) zur Speicherung von Energie spezialisiert ist, zerstreut braunes Fettgewebe (BAT) Energie in Form von Wärme aufgrund seiner Fähigkeit, Kohlenhydraten und Lipiden in Wärmeenergie über mitochondriale abkoppeln¹umwandeln. Aufgrund dieser speziellen Funktion ist das Fledermaus-Depot für die Wartung der Körpertemperatur unter physiologischen Bedingungen und als Reaktion auf kalten Belichtung erforderlich. Während Veränderungen der Genexpression während BAT Differenzierung und nach thermogene Stress ausgiebig in vivo und in vitro untersucht wurden, die molekularen Mechanismen, die diese Änderungen meist seziert in immortalisierte Zelllinien und primäre gewesen Pre-Fettzellen, mit Ausnahme von mehreren Studien in vivo^2,3,4,5.

Regulierung der spezifischen Ausdruck Genprogramme durch transcriptional Regelung wird erreicht durch koordinierte Änderungen im Chromatin Struktur über verschiedene Transkription Faktoren und Co Faktoren Aktionen. Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) ist ein wertvolles Molekularbiologie-Ansatz für die Rekrutierung dieser Faktoren an der DNA zu untersuchen und für die Profilierung der damit einhergehenden Veränderungen in der Chromatin-Landschaft. Schlüsselfaktoren für den Erfolg des ChIP-Experimente gehören Optimierungen der Vernetzung und Chromatin Scheren Konsistenz in verschiedenen Proben, Verfügbarkeit von angemessenen Ausgangsmaterial und vor allem Qualität der Antikörper. Bei ChIP aus dem gesamten Gewebe, es ist auch wichtig zu prüfen, Heterogenität der Proben und das Protokoll zur Verbesserung der Effizienz der Kerne Isolation zu optimieren, wobei letztere ein besonders sensibler Schritt beim Arbeiten mit Fettgewebe aufgrund der erhöhte Fettgehalt. In der Tat, molekulare Isolierungstechniken aus ganzen adipösen Depots werden erschwert durch das Vorhandensein von hohe Konzentrationen von Triglyceriden und Protokolle müssen optimiert werden, um die Menge von Chromatin Isolierung erhöhen. Schließlich, wenn Hochdurchsatz-Sequenzierung nach ChIP-DNA-Isolierung durchgeführt wird, ist die Sequenzierung Tiefe entscheidend für die Bestimmung der Anzahl von Gipfeln, die sicher erkannt werden.

Hier verweisen wir auf die Arbeitsstandards und allgemeine Richtlinien zur ChIP-Seq-Experimente von ENCODE und ModENCODE Konsortien⁶ best Practices empfohlen, und wir konzentrieren uns auf eine schrittweise Beschreibung eines Protokolls für ChIP-Seq von BAT optimiert. Das beschriebene Protokoll ermöglicht effiziente Isolierung des Chromatins aus Fettgewebe genomweite Sequenzierung für DNA-bindenden Faktoren mit klar definierten Gipfeln sowie Histon-Marken mit diffuser Signale durchführen.

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Protokoll

Der Umgang mit tierischen Schritte des Protokolls wurden von Boston University institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt.

1. Tag 1: Präparation und Vorbereitung der Fledermaus für Chromatin Immunopräzipitation (ChIP)

1. Mäuse mit einer Kammer Kohlendioxid (CO₂) einschläfern, und führen Sie die Dissektion sofort danach. Sprühen Sie Maus Fell mit 70 % Ethanol vor dem Schnitt. Platzieren Sie die Maus mit dem Rücken nach oben, dann die Haut entlang der Hals aufgeschnitten. Suchen Sie den Schläger direkt unter der Haut zwischen den Schultern (Interskapuläre; es scheint, als zwei Lappen, Schmetterling-förmige, mit einer dünnen Schicht von Fett, die unbedingt beachtet werden muss⁷entfernt).
   Hinweis: Für ein 3 Monate Alter C57BL/6J Maus, die eine regelmäßige Chow-Diät (Maus Gewicht in dieser Altersspanne zwischen 27 und 30 g) gespeist wird, ist jeder BAT Lappen ca. 1 cm lang. Die Fledermaus-Depot wiegt ca. 0,15 g bei männlichen und weiblichen Mäusen.
2. Verwenden Sie 1 BAT Pad für 3 ChIPs. Mehreren Fledermaus-Pads können bis Beschallung gleichzeitig bearbeitet werden.
3. Crosslink jede Fledermaus pad in 10 mL von Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 1 % Formaldehyd für 15 min bei 150 u/min bei Raumtemperatur (RT) drehen.
4. Vernetzung zu stillen, indem Sie eine Endkonzentration von 125 mM für 5 min, bei 150 u/min bei RT 2,5 M Glycin hinzufügen
5. Übertragen Sie das Fledermaus-Pad zu 500 µL hypotone Lyse-Puffer (10 mM HEPES, 1,5 mM MgCl₂, 10 mM KCl, 0,5 mM DTT, 0,2 mM PMSF) geben und 2 Edelstahl-Kugeln (Größe: 3,2 mm Durchmesser, siehe Tabelle der Materialien) für jedes Fledermaus-Pad. Verwenden Sie eine Perle-basierte Gewebe-Homogenisator (siehe Tabelle der Materialien), um das Gewebe zu zerkleinern.
6. Beginnen Sie mit 5 min bei max. Leistung. Bei Bedarf verlängern Sie die Zeit, bis das Gewebe homogenisiert wird und Einzelzellen sind getrennt. Übertragen Sie die Proben in einen neuen Schlauch und Zentrifuge bei 4 ° C bei 16.000 X g für 10 Minuten.
7. Nach Zentrifugation übertragen des Überstands in ein neues Rohr und halten Sie die Zelle Pellet auf Eis. Zentrifugieren des Überstands bei 4 ° C bei 16.000 x g für 10 min bis zum Verlust der Einzelfelder zu verhindern. Den endgültige überstand verwerfen und Aufschwemmen beide Zelle Pellets zusammen in 300 µL SDS Lyse Puffer (SDS 1 %; EDTA-10 mM; Tris-HCl pH 8, 50 mM) mit 1 x Protease-Hemmer (siehe Tabelle der Materialien). Inkubieren Sie für 10 min auf Eis.
8. Beschallen Sie Lysates um DNA-Fragmente 200 – 500 Basenpaare lang zu generieren. Entfernen Sie nach Beschallung die Ablagerungen durch Zentrifugation für 10 min bei 16.000 X g bei 4 ° C und überprüfen Sie den Erfolg der Beschallung über DNA Elektrophorese auf einem 1 % Agarose-Gel. Laufen Sie für eine mittelgroße Gel bei 120 V; eine gute Trennung wird nach 45 min erreicht.
   Hinweis: Beschallung Optimierung eventuell auf die richtige Größe der Fragmente zu erreichen. Mit der gewählten Sonikator (siehe Tabelle der Materialien), dazu 2 x 320 W Ausgangsleistung und 20 KHz Frequenz für 10 min, mit Zyklen von 30 s/30 s off.
9. Der überstehende Teil 10-fach verdünnen (Endvolumen beträgt 3 mL für jede Fledermaus-Pad) in ChIP Verdünnungspuffer (SDS 0,01 %; Triton 1,1 %; EDTA-1,2 mM; Tris-HCl pH 8, 16,7 mM; NaCl-167 mM) mit 1 x Protease-Inhibitor. 1 % dieser Chromatin-Lösung (entspricht 30 µL für 3 mL) als ChIP Eingabe beiseite. Halten Sie die Eingänge über Nacht bei 4 ° C (bis Schritt 2.4).
   Hinweis: Der oben genannten Bruch wird die Eingabe für relative Quantifizierung von Immunoprecipitated Material im Vergleich zu der Menge an DNA in jeder Probe vor Immunopräzipitation Bezugsrahmen.
10. Fügen Sie den ChIP-Antikörper (siehe Tabelle der Materialien für die Antikörper verwendet hier als Beispiel) zu 1 mL der Chromatin-Lösung und Inkubation über Nacht bei 4 ° C mit Rotation. Führen Sie parallel Immunopräzipitation mit entsprechenden Pre-immun IgG, falls vorhanden, oder normale IgG Artgenossen (zB., regelmäßige Kaninchen IgG, wenn der Antikörper in einem Kaninchen produziert wird). Alternativ speichern Sie 1 mL der Chromatin-Lösung für eine keine-Antikörper-Kontrolle.
    Hinweis: Die optimale Menge des Antikörpers sollte für jeden neuen Antikörper experimentell ermittelt werden, wenn die Antikörperkonzentration nicht bekannt ist. Ansonsten ist 2 – 5 µg des Antikörpers einen angemessenen Ausgangsbetrag zu verwenden. Verwenden Sie ChIP-Grade Antikörper möglichst oder Antikörper, die validiert wurden für Immunopräzipitation.

(2) Tag 2: Sammlung von der Immunkomplexe

1. Die Immunkomplexe 50 µL Protein A Agarose 50 % Gülle hinzufügen und 1 h bei 4 ° C mit Rotation bei 150 u/min inkubieren.
2. Pellet-die Perlen durch Zentrifugation für 1 min bei 100 X g bei 4 ° C. Führen Sie sequentielle wäscht der Perlen mit Puffern Stringenz zu erhöhen.
   1. Erstens, waschen Sie mit Waschpuffer salzarme (150 mM NaCl; Tris-HCl pH 8, 20 mM; EDTA-2 mM; Triton-X 1 %; SDS 0,1 %), dann mit hohem Salzgehalt Waschpuffer (500 mM NaCl; Tris-HCl pH 8, 20 mM; 2 mM, Triton-X1 % EDTA; SDS 0,1 %), dann mit LiCI waschen (0,25 M LiCI; Tris-HCl pH 8, 10 mM; EDTA-1 mM; Igepal 1 %; Deoxicholate 1 %), und schließlich mit 1 X TE (Tris-HCl pH 8, 10 mM; EDTA).
   2. Führen Sie alle Waschungen auf 0,45 µm PVDF zentrifugale Filter Spalten (Table of Materials) durch die erste Übertragung der Perlen in den Spalten mit 500 µL Waschpuffer salzarme. Die Perlen in den Spalten für 3 min bei 2.500 X gPellets. Verwerfen Sie der durchströmten und wiederholen Sie 1 Mal für alle in Schritt 2.2.1 aufgeführten waschen-Puffer.
3. Nach Abschluss der Wäschen eluieren der Immunkomplexe durch Zugabe von 300 µL der Elution Puffer 1 % SDS, 0,1 M Nahco3₃) um die gebeizte Perlen in den Spalten. 30 min auf einen Shaker bei 400 u/min bei RT inkubieren. Das Eluat durch Spinnen sich Spalten für 3 min bei 2.500 X g in einem frischen Rohr zu sammeln.
4. Rückseite der Querverbindungen durch Inkubation Eluat und Eingänge in Schritt 1,9 bei 65 ° C über Nacht gesammelt.

3. Tag 3: Wiederherstellung der DNA mit Phenol/Chloroform Extraktion

1. 300 µL Phenol: Chloroform: IAA, 1:1 auf das Eluat und die Eingänge hinzufügen. Wirbel für 10 s.
2. Drehen Sie bei 4 ° C für 15 Minuten bei 21.000 X g. Übertragen Sie den Überstand auf eine frische Rohr. Fügen Sie 3 µL von Glykogen, 30 µL 3 M Natriumacetat und 750 µL kalt 100 % Ethanol. Vortex für 10 S. Store bei-80 ° C 2 h.
3. Spin-down bei 21.000 x g bei 4 ° C für 20 min, das Pellet zu halten und den Überstand verwerfen. Wash-Pellet mit 1 mL kaltem 70 % EtOH, dann Spin-down bei 21.000 X g bei 4 ° C für 5 min. überstand verwerfen und das Pellet an der Luft trocknen.
4. Das Pellet in 70 µL DNAse-freies Wasser Aufschwemmen.
5. Gehen Sie zu Schritt 4 für die Prüfung von Chromatin-Belegung auf spezifische genomische Regionen durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) oder zu Schritt 5, um Proben für die Sequenzierung vorzubereiten.

4. Analyse der ChIP mit qPCR (richtige Gene auslesen)

1. Verdünnen Sie die Eingabe DNA aus Schritt 3.4 um ein standard-Referenz-Kurve zu erzeugen. Serielle Verdünnungen von 1/10, 1/100, 1/1000 sind in der Regel ausreichend, um den linearen Bereich zu erfassen, wobei weitere Verdünnungen für mehr konzentrierte Proben erforderlich sein.
2. Für jede Primerpaar (hier, wir haben Primer auf NDUFV1 und TOMM20 Promotoren verwendet), bereiten Sie zwei Sätze von qPCR Reaktionen: eine mit der verdünnten Eingabe Proben von Schritt 4.1, und eine zweite mit den DNA-Proben durch Immunopräzipitation aus Schritt 3.4 isoliert. Führen Sie jede Reaktion in dreifacher Ausfertigung.
   Hinweis: Reaktionen können parallel für mehrere Gene mit 96 oder 384-Well Platten eingerichtet werden.
3. Richten Sie eine Reaktionsvolumen von 10 μL pro Well mit 5 μl 2 X PCR-Mix (Table of Materials), 1 μL Grundierung mischen (1 μM forward Primer und rückwärts-Primer 1 μM), und 4 μl DNA-ChIP (oder das Eingabesteuerelement).
4. Kurz spin-down der Platte.
5. Führen Sie die qPCR-Reaktionen auf ein Echtzeit-PCR-System unter Verwendung des Protokolls, der vom Hersteller empfohlenen für Reagenz-Erkennung (Table of Materials). Hier haben wir die folgenden Bedingungen verwendet: 1) 1 s bei 95 ° C für 1 Zyklus; (2) 1 s bei 95 ° C, gefolgt von 20 s bei 60 ° C für 45 Zyklen; (3) 15 s bei 95 ° C gefolgt von 60 s bei 60 ° C, gefolgt von 15 s bei 95 ° C für 1 Zyklus.
   Hinweis: Überprüfen Sie die Dissoziation-Kurve: das Vorhandensein von einem Gipfel in der thermische Dissoziation Handlung schlägt einen einzigen Amplifikate entsteht aus der PCR-Reaktion. Wenn mehr als ein Höhepunkt visualisiert wird, ist dies möglicherweise Anzeichen für mehrere, nicht-spezifischen Amplifikate; in diesem Fall empfehlen wir die Gestaltung von alternativen Primer-Paaren.
6. Bestimmen Sie die lineare Phase des exponentiellen Amplifikation der PCR-Reaktion für jede Berechnung der Standardkurve mit der Reihe von verdünnten genomischer DNA in Schritt 4.1 festgelegten Grundierung. nach der Ct (Zyklus Schwelle) Wert.
7. Wenn die Ct-Werte der DNA von ChIP und input-Regler innerhalb der linearen Bereich von Ct-Wert sind, berechnen Sie die Anreicherung von DNA aus ChIP im Vergleich zu den Eingang nach der Verdünnungsfaktor der DNA von ChIP und Eingabesteuerelement im Schritt 4.1.

(5) Verstärkung von DNA-Chips für Hochdurchsatz-Sequenzierung (genomweite auslesen)

Hinweis: Dieser Schritt kann eine zentrale wissenschaftliche Einrichtung oder kommerzielle Sequenzierung Unternehmen ausgelagert werden, wenn Sequenzierung Funktionen intern nicht zur Verfügung stehen.

1. Bereiten Sie eine DNA-Bibliothek von der extrahierten DNA mit einer entsprechenden ChIP Bibliothek Vorbereitung kit (siehe Tabelle der Materialien) nach den Anweisungen des Herstellers.
2. Sequenz die Bibliothek auf einem Hochdurchsatz-Sequenzierung System, mit 50 bp Einend-als auslesen (siehe Tabelle der Materialien).
   Hinweis: Nach ChIP-Seq-Richtlinien von ENCODE⁶vorgeschlagen empfiehlt ein Minimum von 10 Millionen Mal gelesen Säugetier-Genome.

6. Rohdatenanalyse

1. Durchführen Sie Qualitätskontrolle auf rohe Sequenzierung liest mit FastQC⁸.
   Hinweis: Gemeinsamen Sequenzierung Qualitätsmetriken gehören pro Basensequenz Qualität, pro Basensequenz Inhalt, Reihenfolge GC Inhalt, Sequenz Länge und Sequenz Vervielfältigung Ebenen. In der Regel einen lesen Sie Qualitätsfaktor q > 30 über jede Grundposition ist bezeichnend für hochwertige Sequenzierung Ergebnisse. Die Verteilung der GC-Gehalt über alle Lesevorgänge sollte etwa eine Normalverteilung, mit einem Spitzenwert im Mittelpunkt der Art tatsächliche genomische GC Content Prozentsatz ähneln.
2. Entfernen Sie Sequenzierung Adapter Kontamination und minderwertige Lesevorgänge durch das Lesen trimmen Dienstprogramm Trimmomatic⁹.
   Hinweis: Die implementierten Default-Parameter angeben, die Beseitigung von Plattform abhängige Adapter, Entfernung der führende und nachfolgende minderwertige Grundlagen und Verwendung von einer 4-Basis breit Schiebefenster zu trimmen liest wann die durchschnittliche Qualität pro base Tropfen unterhalb einer bestimmten Schwelle.
3. Richten Sie verarbeiteten Lesezugriffe auf die Maus MM10 Bezug Genom¹⁰ mit dem Bowtie2 Aligner¹¹ Standard-Parameter verwenden.
4. Ausgerichteten liest nach Entfernen von Personen mit einer Bowtie2-Zuordnung-Qualität Filtern score (MAPQ) von weniger als 10 mit Samtools¹².
5. Verschiedenen Post-Ausrichtung Qualitätsmetriken zu bestimmen, wie z. B. Prozent Lesevorgänge zugeordnet, Strang, Kreuzkorrelation kumulative lesen Sie Abdeckung und Probe Reproduzierbarkeit replizieren.
   Hinweis: Verschiedene Pakete einschließlich SPP¹³, stehen ChIPqc¹⁴und Deeptools¹⁵ diese Qualitätsmetriken berechnen.
6. Führen Sie Spitze aufrufenden Analyse mit einem Eingabesteuerelement oder entsprechende KO-Probe mit MACS-Algorithmus (MACS2)¹⁶ mit Standardparametern.
7. Entfernen Sie alle genannten Gipfeln, die Überschneidungen mit bekannten auf der schwarzen Liste Regionen¹⁷ aus der mm10 Annotation mit Bedtools¹⁸.
   Hinweis: Auf der schwarzen Liste Regionen sind Bereiche im Genom, die nachweislich hohe Signal oder lesen Sie zählt unabhängig von der Zelllinie oder Sequenzierung Technik haben. Diese Regionen Anzeige künstlich hoch Artefakt Signale in bestimmten Regionen des Genoms, die aus funktionellen Genom-Sequenzierung Experimente gefiltert werden können. Alle Wiederholungen sollten unabhängig voneinander durch die Pipeline verarbeitet werden und dann für Unreproduzierbarkeit Entdeckung Rate (IDR) verwendet werden. IDR wird eingesetzt, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse auf Wiederholungen durch die Methode zu messen, wie Li, braun, Huang und Bickel^19,20beschrieben. Die IDR-Methode quantitativ bewertet Konsistenz zwischen Wiederholungen und wird von ENCODE und ModENCODE als Teil ihrer ChIP-Seq-Leitlinien empfohlen.
8. Verwenden Sie statistisch signifikante Spitzen für verschiedene nachgelagerte Auswertungen wie gen Ontologie^21,22, Bereicherung oder Motiv Analyse²³.

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Ergebnisse

Abbildung 1: ChIP-Validierung von qPCR. ChIP-qPCR Analyse der Vertreter GPS2 gezielt Gene NDUFV1 (links) und TOMM20 (rechts) in der Fledermaus von WT und GPS2 AKO Mäusen zeigt relative Änderungen in der Ebene der H3K9-Methylierung und GPS2 und Pol2 Bindung. Die Balkendiagramme darstellen den Stichprobe-Mittelwert von 3 Wiederholungen mit * p < 0,05 und ** p < 0,01 mit d...

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Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll stellt ein wertvolles Werkzeug für die Durchführung von ChIP aus murinen Geweben, speziell optimiert für braunen Fettgewebe. Eine der größeren Herausforderungen bei der Durchführung von ChIP von Gewebe ist eine ausreichende Anzahl von Zellen während der Probenvorbereitung erholen. Scheren die Fledermaus mit einem Gewebe Homogenisator Mixer gepaart mit Edelstahl Perlen statt einem kanonischen Glas Stößel deutlich reduziert die Anzahl der Zellen durch ununterbrochene Gewebe verloren...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bullet Blender Tissue Homogenizer	Next Advence	BBX24
Stainless Steel Beads 3.2 mm Diameter	Next Advence	SSB32
Bioruptor Sonicator	Diagenode
1.5 mL Micro Tube TPX Plastic	Diagenode	C30010010-5
Complete-Protease inhibitor	Roche	11836145001
Protein A Agarose Slurry	Invitrogen	101041
GPS2 antibody	In house		Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018)
Pol2 antibody	Diagenode	C15100055
h3K9me3 antibody	Millipore	05-1242
Fast Syber Green Master Mix	Aplied Biosytem	4385612
ViiA7	Aplied Biosytem
TruSeq ChIP Library Preparation Kit	Illumina	IP-202-1012
HiSeq 2000	Illumina