JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы описываем протокол для иммунопреципитации эффективного chromatin (обломока) следуют высокопроизводительного секвенирования ДНК (чип seq) коричневый жировой ткани (BAT), изолированных от мыши. Этот протокол является подходящей для сопоставления изменения гистона и изучения генома всей локализации не гистоны интерес в vivo.

Аннотация

Наиболее клеточные процессы регулируются транскрипционный анализ модуляции программ конкретных генов. Такие модуляции достигается за счет комбинированного действия широкого круга факторов транскрипции (TFs) и кофакторов, посреднические transcriptional активации или репрессий через изменения в структуре хроматина. Иммунопреципитации Chromatin (обломока) является полезным молекулярной биологии подход для сопоставления изменения гистона и профилирование транскрипции факторы/кофакторов привязки к ДНК, обеспечивая моментальный снимок динамических ядерные изменения, происходящие во время различных биологические процессы.

Для изучения регуляцию в жировой ткани, увековечен образцов, полученных в пробирке клеток культур или начальные клеточные линии часто выступает в чип анализов из-за обилия исходного материала и снижение биологической вариативности. Однако эти модели представляют ограниченный снимок состояния фактической хроматина в живых организмах. Таким образом существует насущная потребность оптимизированный протоколов для выполнения чип на образцах адипозных тканей, полученных от животных моделей.

Здесь мы описываем протокол для эффективного чип seq изменения гистона и гистоны в коричневый жировой ткани (BAT), изолированных от мыши. Протокол оптимизирован для изучения генома общесистемной Локализация белков интерес и эпигенетические маркеры в BAT, который является морфологически и физиологически собственный ткани среди жировых депо.

Введение

В то время как белой жировой ткани (Ват) специализирован для хранения энергии, коричневая жировая ткань (BAT) рассеивает энергию в виде тепла из-за его способность преобразовать углеводы и липиды в тепловой энергии через Митохондриальные расцеплять1. Из-за этой специализированной функции BAT депо требуется для поддержания температуры тела в физиологических условиях и в ответ на холодной воздействия. В то время как изменения выражения гена во время дифференциация BAT и после термогенный стресса были широко изучены в vivo и in vitro, молекулярные механизмы, лежащие в основе этих изменений были в основном расчлененный в увековечен клеточных линий и первичной предварительно адипоциты, за исключением нескольких в vivo исследований2,3,4,5.

Регулирование конкретных генов выражение программ через регуляцию достигается путем скоординированных изменений chromatin структуры через различные транскрипции факторы и факторы совместного действия. Иммунопреципитации Chromatin (обломока) является ценным молекулярной биологии подход для изучения набора этих факторов ДНК и для профилирования связаны изменения в ландшафте хроматина. Ключевые факторы успеха чип экспериментов включают оптимизацию условий сшивки и хроматина сдвига последовательности на протяжении различных образцов, наличие адекватных исходного материала, и, прежде всего, качество антител. При выполнении чип от всей ткани, важно также учитывать неоднородность образцов и оптимизировать протокол для повышения эффективности работы ядер изоляции, с последним будучи особо чувствительных шаг при работе с жировой ткани из-за содержание повышенных липидов. В самом деле методы молекулярной изоляции от всего жировых депо осложняется наличием высокий уровень триглицеридов, и протоколы должны быть оптимизированы для увеличения объема хроматина изоляции. Наконец когда высокопроизводительного секвенирования проводится после чип-ДНК изоляции, глубина последовательности имеет решающее значение для определения числа вершин, которые уверенно распознаются.

Здесь мы ссылаемся на стандарты работы и общие руководящие принципы для чип seq экспериментов, рекомендованный кодирования и modENCODE консорциумов6 для наилучшей практики, и мы концентрируем внимание на пошаговое описание протокола, оптимизированный для чип seq от Бат. Для эффективной изоляции хроматина из жировой ткани описанных протокол позволяет выполнять генома общесистемной последовательности ДНК связывающих факторов с четко определенными пики, а также меток гистона с более диффузный сигналов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Шаги обработки животных протокола были одобрены Бостонского университета институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC).

1. день 1: Вскрытие и подготовка BAT для иммунопреципитации Chromatin (обломока)

  1. Усыпить мышей, используя камеру углекислого газа (CO2) и выполнять вскрытие сразу же после этого. Спрей мыши мех с 70% этанол до разреза. Поместите курсор мыши с его обратно вверх, затем разрезать на кожу вдоль шеи. Найдите BAT непосредственно под кожей между плеч (межлопаточной; она появляется как двумя лопастями, бабочка образного, с тонким слоем белого жира, который должен быть тщательно удалены7).
    Примечание: Для 3 месяц старый C57BL/6J мыши является откармливаются регулярные Чоу (вес мыши на этот возраст колеблется от 27 и 30 g) каждый лепесток BAT — около 1 см в длину. Общий вес BAT депо составляет примерно 0,15 g как мужчин, так и женские мышей.
  2. Использование 1 бат площадку для 3 фишки. Несколько бат колодки могут обрабатываться одновременно до sonication.
  3. Crosslink каждый BAT площадку в 10 мл фосфат амортизированное физиологический (PBS) содержащий 1% формальдегида для 15 мин, вращающихся на 150 об/мин при комнатной температуре (RT).
  4. Утолить сшивки, добавив 2,5 метров глицина в конечной концентрации 125 мм для 5 мин, вращающихся на 150 об/мин на RT.
  5. Передача BAT pad 500 мкл буфера lysis гипотонический (10 мм HEPES, 1,5 мм2MgCl 10 KCl, 0.5 мм DTT, 0.2 мм PMSF) и добавить 2 бусины из нержавеющей стали (размер: 3,2 мм диаметр, смотрите Таблицу материалы) для каждой площадки BAT. Использовать ткани на основе бисера гомогенизатора (см. Таблицу материалы) лоскуток ткани.
  6. Начните с 5 минут на максимальной мощности. В случае необходимости, продлить время до гомогенизированный ткани и отделены одной клетки. Передача образцов в новой трубки и центрифуги на 4 ° C на 16000 x g за 10 мин.
  7. После центрифугирования передача супернатант в новой трубки и сохранить клетки гранул на льду. Центрифуга супернатант на 4 ° C на 16000 x g 10 мин для предотвращения потери плавающей клетки. Отменить последний супернатант и Ресуспензируйте обе ячейки окатыши вместе в 300 мкл буфера lysis SDS (SDS 1%; ЭДТА 10 мм; Tris-HCl рН 8, 50 мм) с 1 x ингибитор протеазы (см. Таблицу материалы). Инкубируйте на льду за 10 мин.
  8. Sonicate лизатов для создания ДНК фрагментов 200 – 500 пар долго. После sonication удалите мусор центрифугированием 10 мин на 16000 x g при 4 ° C и проверьте успех sonication через ДНК электрофорез на геле агарозы 1%. Для геля среднего размера, на 120 V; хорошее разделение достигается через 45 мин.
    Примечание: Sonication оптимизация может потребоваться для достижения надлежащего размера фрагментов. С выбранной sonicator (см. Таблицу материалы), это требует 2 раза на 320 Вт выходная мощность и частота 20 кГц для 10 мин, используя циклы 30/30 сек выкл.
  9. Разбавить супернатанта фракция 10 (окончательный объем — 3 мл для каждой площадки BAT) в чип буфером для разбавления проб (SDS 0,01%; Тритон 1,1%; ЭДТА 1,2 мм; Трис-HCl рН 8, 16,7 мм; NaCl 167 мм) с 1 x ингибитор протеазы. Храните в сторону 1% раствора этой хроматина (равный 30 мкл для 3 мл) как чип ввода. Держите входов на ночь при 4 ° C (до шаг 2.4).
    Примечание: Выше доля обеспечит ввода ссылки относительной количественной оценки immunoprecipitated материала по сравнению с количество ДНК присутствует в каждом образце до иммунопреципитации.
  10. Добавить чип антитела (см Таблицу материалов для антитела, которые используются здесь в качестве примера) в 1 мл раствора хроматина и инкубировать на ночь при 4 ° C с вращением. Выполнение параллельной иммунопреципитации с соответствующей предварительной иммунной IgG, если таковые имеются, или нормальной IgG того же вида (например., регулярные кролик IgG, если антитела производится в кролика). Кроме того сохраните 1 мл раствора chromatin для элемента управления нет антитела.
    Примечание: Оптимальное количество антител следует определить экспериментально для каждой новой антитела, если концентрация антител не известна. В противном случае 2 – 5 мкг антитела является отправной разумного использования. Используйте чип класс антител, когда это возможно, или антител, которые были проверены для иммунопреципитации.

2. день 2: Коллекция иммунных комплексов

  1. Добавьте 50 мкл суспензии 50% белка агарозы иммунных комплексов и инкубировать 1 час при температуре 4 ° C с вращением на 150 об/мин.
  2. Пелле бисер центрифугированием за 1 мин на 100 x g при 4 ° C. Выполните последовательный моет бисер с буферами увеличения жесткости.
    1. Во-первых мыть с низким содержанием соли мыть буфера (150 мм NaCl; Трис-HCl рН 8, 20 мм; ЭДТА 2 мм; Тритон X 1%; SDS 0,1%), а затем с высоким содержанием соли мыть буфера (500 мм NaCl; Трис-HCl рН 8, 20 мм; ЭДТА 2 мм, Тритон-X1%; SDS 0,1%), а затем с LiCl мыть (0.25 M LiCl; Трис-HCl рН 8, 10 мм; ЭДТА 1 мм; Igepal 1%; deoxicholate 1%) и наконец с 1 x TE (Tris-HCl рН 8, 10 мм; ЭДТА).
    2. Выполните все моет на 0,45 мкм PVDF центробежного фильтра столбцов (Таблица материалов), первая передача бусины в столбцах с помощью 500 мкл буфера мытья низким содержанием соли. Пелле бусины в столбцах 3 мин на 2500 x g. Отказаться от потока через и повторить 1 раз для всех буферов мыть, перечисленные на шаге 2.2.1.
  3. После смывки, элюировать иммунных комплексов, добавив 300 мкл Элюирующий буфер 1% SDS, 0.1 М NaHCO3) для гранулированных бусины в столбцах. Инкубируйте на RT 30 мин на шейкер на 400 об/мин. Соберите элюата спиннинг вниз столбцы для 3 мин на 2500 x g в свежий трубку.
  4. Обратный сшивки, инкубации элюата и материалы, собранные в шаге 1.9 при 65 ° C на ночь.

3. день 3: Восстановление ДНК с извлечение фенола/хлороформ

  1. Добавьте 300 мкл фенола: хлороформ: IAA, 1:1 до элюата и входов. Вортекс для 10 s.
  2. Спина на 4 ° C на 15 мин на 21 000 x g. Супернатант передать свежие трубки. 3 мкл гликогена, 30 мкл ацетат натрия 3 M и 750 мкл холодной 100% этанола. Вортекс для 10 s. магазина на-80 ° C в течение 2 ч.
  3. Спин вниз на 21 000 x g при 4 ° C в течение 20 мин, держать гранулы и удалить супернатант. Пелле мыть с 1 мл холодного 70% EtOH, затем спин вниз на 21 000 x g при 4 ° C за 5 минут удалить супернатант и просушите гранулы.
  4. Ресуспензируйте гранулы в 70 мкл DNAse свободной воды.
  5. Перейдите к шагу 4 для тестирования хроматина размещение на конкретных регионах геномной количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР) или к шагу 5 подготовить образцы для виртуализации.

4. анализ чип с помощью ПЦР (Single/Multiple генов индикация)

  1. Разбавьте ввода ДНК из шага 3.4 для создания стандартной исходной кривой. Серийных разведений от 1/10, 1/100 и 1/1000 обычно достаточно захватить линейному диапазону, но дальнейшего разведения могут потребоваться для более концентрированной образцов.
  2. Для каждой пары праймера (здесь, мы использовали грунты, против NDUFV1 и TOMM20 промоутеров), подготовить два комплекта реакций ПЦР: один с использованием разреженных ввода образцов из шаг 4.1 и второй с образцами ДНК, изолированные иммунопреципитации из шага 3.4. Выполнение каждой реакции в трех экземплярах.
    Примечание: Реакции могут создаваться параллельно для нескольких генов с помощью 96 - или 384-ну пластины.
  3. Настройка реакции объем 10 мкл в колодец с 5 мкл 2 x PCR смеси (Таблица материалов), 1 мкл грунтовки смешивают (1 мкм вперед грунт и обратный грунтовка 1 мкм) и 4 мкл ДНК от чип (или элемент управления вводом).
  4. Кратко вращаться вниз плита.
  5. Запустите реакций ПЦР в системе реального времени PCR используя протокол рекомендован производителем для обнаружения реагента (Таблица материалов). Здесь мы использовали следующие условия: 1) 1s при 95 ° C за 1 цикл; 2) 1 s при 95 ° C, после чего 20 s при 60 ° C для 45 циклов; 3) 15 s при 95 ° C, после чего 60 s при 60 ° C, после чего 15 s при 95 ° C за 1 цикл.
    Примечание: Проверка кривой диссоциации: наличие одного пика в участок термической диссоциации предполагает единый ампликон генерируется из реакции PCR. Если более чем один пик визуализируется, это потенциально свидетельствует о нескольких, неспецифичный ампликонов; в этом случае мы рекомендуем разработке альтернативных грунтовка пар.
  6. Определите Линейная фаза экспоненциального усиление реакции PCR для каждого праймера, набор путем расчета калибровочной кривой с помощью серии разреженных геномной ДНК в шаге 4.1. по данным КТ (цикл порог) значение.
  7. Если значение Ct ДНК от чипа и управления вводом в значении линейного диапазона Ct, вычислить обогащения ДНК от чипа по отношению к входу, согласно коэффициент разбавления ДНК от чипа и управления вводом на шаге 4.1.

5. амплификация ДНК от чип для высокопроизводительного секвенирования (генома общесистемной индикация)

Примечание: Этот шаг могут быть переданы академической основной объект или коммерческих виртуализации компании при доме не доступны возможности виртуализации.

  1. Подготовить библиотеки ДНК из ДНК с соответствующей подготовкой библиотеки чип комплекта (см. Таблицу материалы) следуя инструкциям производителя.
  2. Последовательности библиотеки на систему высокопроизводительного секвенирования, используя 50 bp сингл конце как индикации (см. Таблицу материалы).
    Примечание: По словам чип seq руководящие принципы, предложенные ENCODE6минимум 10 миллионов читает рекомендуется для млекопитающих геномов.

6. необработанных данных анализа

  1. Выполняйте контроль качества сырой последовательности чтения с помощью FastQC8.
    Примечание: Метрики качества общей последовательности включают в себя за качество базовой последовательности, за базовый порядковый содержание, содержание последовательности GC, длина последовательности и последовательности дублирования уровней. Как правило, показатель качества чтения из Q > 30 через каждого базового положения свидетельствует о последовательности высокого качества результатов. Распространение контента GC во всех читает примерно должно напоминать нормальное распределение, с пик вокруг этих видов фактической геномной GC контента процент.
  2. Удалите последовательность адаптер загрязнения и низкого качества чтения через чтение, обрезки утилита Trimmomatic9.
    Примечание: Реализованный по умолчанию параметры удаления платформы зависимые блоки, удаление начальные и конечные низкого качества баз и использования широкой скользящего окна 4-база для отделки читает когда среднее качество за базовый падает ниже заданного порога.
  3. Совместите обработанные читает генома мыши мм10 ссылка10 с Bowtie2 каппу11 с использованием параметров по умолчанию.
  4. Фильтрации унифицированных читает, удалив те с качеством сопоставления Bowtie2 Оценка (MAPQ) меньше чем 10, используя Samtools12.
  5. Определите различные метрики после выравнивания качества, такие как процент читает сопоставлены, стренги кросс корреляции, совокупный читать, освещение и образец повторить воспроизводимость.
    Примечание: Различные пакеты, включая SPP13, ChIPqc14и15 Deeptools доступны для расчета этих показателей качества.
  6. Анализ пик вызова с помощью элемента управления вводом или соответствующие KO образца с помощью Маки алгоритм (MACS2)16 с параметрами по умолчанию.
  7. Удалите любые называется пиков, которые перекрываются с17 известных черный список регионов от мм10 заметки с помощью Bedtools18.
    Примечание: Черный список регионов являются районы в геноме, которые показали, чтобы иметь высокий сигнал или чтения графов независимо от ячейки строки или последовательности техника. Эти регионы отображения сигналов искусственно завышенных артефакт в некоторых регионах, которые могут быть отфильтрованы из экспериментов функциональных геномные последовательности генома. Все реплицирует должны обрабатываться независимо через конвейер и может затем использоваться для невоспроизводимость открытия ставки ("РДЭ"). РДЭ используется для измерения воспроизводимость результатов между реплицирует через метод, как описано в Li, Браун, Хуан и Bickel19,20. РДЭ метод количественно оценивает соответствие между реплицирует и рекомендуется КОДИРОВАТЬ и modENCODE как часть их чип seq руководящих принципов.
  8. Используйте статистически пиков для различных течению анализов, таких, как генная онтология21,22, обогащения или мотив анализ23.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

figure-results-58
Рисунок 1: чип проверки путем ПЦР. Чип ПЦР анализ представитель GPS2 целевых генов NDUFV1 (слева) и TOMM20 (справа) в BAT мышей WT и GPS2-АКО, показаны относительные изменения в уровень метилирования H3K9 и GPS2 и Pol2 привязки....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Протокол, описанные здесь представляет собой ценный инструмент для выполнения чип из мышиных тканей, специально оптимизированный для коричневая жировая ткань. Одна из более проблем в выполнении чип из ткани является восстановление достаточное количество клеток во время подготовки п?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Bullet Blender Tissue Homogenizer Next Advence BBX24
Stainless Steel Beads 3.2 mm DiameterNext Advence SSB32
Bioruptor SonicatorDiagenode
1.5 mL Micro Tube TPX Plastic DiagenodeC30010010-5
Complete-Protease inhibitorRoche 11836145001
Protein A Agarose Slurry Invitrogen 101041
GPS2 antibodyIn houseRabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018)
Pol2 antibody DiagenodeC15100055
h3K9me3 antibodyMillipore 05-1242
Fast Syber Green Master MixAplied Biosytem4385612
ViiA7Aplied Biosytem
TruSeq ChIP Library Preparation KitIllumina IP-202-1012
HiSeq 2000 Illumina 

Ссылки

  1. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. , (2004).
  2. Cardamone, M. D., et al. Mitochondrial Retrograde Signaling in Mammals Is Mediated by the Transcriptional Cofactor GPS2 via Direct Mitochondria-to-Nucleus Translocation. Molecular Cell. 69, (2018).
  3. Emmett, M. J., et al. Histone deacetylase 3 prepares brown adipose tissue for acute thermogenic challenge. Nature. , (2017).
  4. Harms, M. J., et al. PRDM16 binds MED1 and controls chromatin architecture to determine a brown fat transcriptional program. Genes & Development. , (2015).
  5. Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes & Development. , (2017).
  6. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).
  7. Liisberg Aune, U., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells. Journal of Visualized Experiments. , e50191(2013).
  8. Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (2010).
  9. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).
  10. Genome Browser Gateway. , Available from: https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?db=mm10 (2018).
  11. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. , 357-359 (2012).
  12. Li, H., et al. The Sequence alignment/map (SAM) format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  13. Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).
  14. Carroll, T. S., Liang, Z., Salama, R., Stark, R., de Santiago, I. Impact of artifact removal on ChIP quality metrics in ChIP-seq and ChIP-exo data. Frontiers in Genetics. 5, 75(2014).
  15. Ramírez, F., et al. deepTools2: A next Generation Web Server for Deep-Sequencing Data Analysis. Nucleic Acids Research. , (2016).
  16. Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, R137(2008).
  17. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  18. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
  19. Li, Q., Brown, J. B., Huang, H., Bickel, P. J. Measuring reproducibility of high-throughput experiments. Annals of Applied Statistics. 5 (3), 1752-1779 (2011).
  20. Irreproducible Discovery Rate (IDR). , Available from: https://github.com/nboley/idr (2018).
  21. The Gene Ontology Consortium. Expansion of the Gene Ontology Knowledgebase and Resources. Nucleic Acids Research. 45, D331-D338 (2017).
  22. Ashburner, M., et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nature Genetics. 25, 25-29 (2000).
  23. Boeva, V. Analysis of Genomic Sequence Motifs for Deciphering Transcription Factor Binding and Transcriptional Regulation in Eukaryotic Cells. Frontiers in Genetics. 7, 24(2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

141Chromatin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены