Immunoprécipitation de la chromatine du murin tissu adipeux brun

Résumé

Nous décrivons ici un protocole pour l’immunoprécipitation de la chromatine efficace (ChIP) suivi par séquençage haut-débit (ChIP-seq) du tissu adipeux brun (TAB) isolé à partir d’une souris. Ce protocole est convenable pour les cartographie des modifications d’histone et enquêter sur tout le génome de localisation des protéines non histones d’intérêt in vivo.

Résumé

Processus plus cellulaires sont réglementées par transcriptional modulation de programmes spécifiques de gènes. Cette modulation est obtenue par l’action combinée d’un large éventail de facteurs de transcription (TFs) et cofacteurs médiation activation de la transcription ou de répression par des changements dans la structure de la chromatine. Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est une approche de la biologie moléculaire utiles pour la cartographie des modifications d’histone et profilage des facteurs de transcription/cofacteurs liaison à l’ADN, permettant ainsi un aperçu des changements dynamiques nucléaires survenant au cours de différentes processus biologiques.

Afin d’étudier la régulation de la transcription dans le tissu adipeux, les échantillons provenant de cultures de cellules in vitro d’immortalisé ou lignées cellulaires primaires sont souvent favorisées lors d’essais de puce à cause de l’abondance de la matière première et réduit la variabilité biologique. Cependant, ces modèles représentent un instantané limité de l’état réel de la chromatine dans les organismes vivants. Ainsi, il y a un besoin crucial pour les protocoles optimisés effectuer la puce sur des échantillons de tissus adipeux dérivées de modèles animaux.

Nous décrivons ici un protocole pour ChIP-seq efficace des modifications d’histone tant des protéines non histones dans le tissu adipeux brun (TAB) isolé à partir d’une souris. Le protocole est optimisé pour l’étude Génome-large la localisation des protéines d’intérêt et les marqueurs épigénétiques dans la chauve-souris, qui est un tissu morphologiquement et physiologiquement distinct parmi les dépôts de graisse.

Introduction

Alors que le tissu adipeux blanc (WAT) spécialisé dans le stockage de l’énergie, tissu adipeux brun (TAB) dissipe l’énergie sous forme de chaleur en raison de sa capacité à convertir les glucides et lipides en énergie thermique via mitochondriales découplantes¹. En raison de cette fonction spécialisée, le dépôt de chauve-souris est nécessaire pour le maintien de la température du corps dans les conditions physiologiques et en réponse à l’exposition au froid. Tandis que les modifications de l’expression génique au cours de la différenciation de la chauve-souris et sur stress thermogène ont été intensivement étudiées in vivo et in vitro, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ces changements ont surtout été disséqué en lignées cellulaires immortalisées et primaire pré-adipocytes, à l’exception de plusieurs études in vivo^2,3,4,5.

Réglementation des programmes d’expression de gènes spécifiques par le biais de régulation transcriptionnelle est obtenue par changements coordonnés dans la chromatine structure via transcription divers facteurs et facteurs conjointement des actions. Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est une approche de la biologie moléculaire précieux pour enquêter sur le recrutement de ces facteurs à l’ADN et les modifications connexes dans le paysage de la chromatine par profilage. Les facteurs clés du succès des expériences de puce incluent optimisations des conditions de réticulation et la chromatine cisaillement cohérence tout au long des échantillons différents, disponibilité du matériel de départ adéquat et, surtout, la qualité des anticorps. Si la puce de tissus entiers, il est également important de tenir compte de l’hétérogénéité des échantillons et d’optimiser le protocole pour améliorer l’efficacité de l’isolement des noyaux, ce dernier étant une étape particulièrement sensible lorsque vous travaillez avec le tissu adipeux due à la teneur en lipides élevés. En fait, les techniques d’isolation moléculaire de dépôts adipeux ensemble sont compliquées par la présence de niveaux élevés de triglycérides, et les protocoles doivent être optimisés pour augmenter la quantité d’isolement de la chromatine. Enfin, lorsque le séquençage haut-débit est effectué après l’isolement de l’ADN-ChIP, la profondeur de séquençage est essentielle pour déterminer le nombre de pics qui sont détectés en toute confiance.

Ici, nous nous référons aux étalons de travail et des orientations générales pour les expériences de ChIP-seq recommandés par le consortium ENCODE et modENCODE⁶ pour les meilleures pratiques, et nous nous concentrons sur une description étape par étape d’un protocole optimisé pour ChIP-seq de BAT. Le protocole décrit permet une isolation efficace de la chromatine du tissu adipeux pour effectuer le séquençage du génome pour facteurs de liaison à l’ADN avec des pics bien définies ainsi que histone marques avec les signaux plus diffus.

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Protocole

Les étapes de gestion d’animaux du protocole ont été approuvés par animalier institutionnel de l’Université de Boston et d’utilisation Comité (IACUC).

1. jour 1 : Dissection et préparation des chauve-souris pour l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)

1. Euthanasier la souris à l’aide d’une chambre de dioxyde de carbone (CO₂) et réaliser la dissection immédiatement par la suite. Pulvériser la souris fourrure avec l’éthanol à 70 % avant l’incision. Placez votre souris avec le dos vers le haut, puis fend la peau le long du cou. Localiser la chauve-souris directement sous la peau entre les épaules (interscapulaire ; il semble que deux lobes, en forme de papillon, d’une fine couche de graisse blanche qui doit être soigneusement enlevé⁷).
   Remarque : Pour un 3 mois C57BL/6J souris qui est soumis à un régime régulier de chow (poids de la souris à cet âges entre 27 et 30 g), chaque lobe BAT est environ 1 cm de long. Le poids total de l’entrepot de chauve-souris est d’environ 0,15 g chez les souris mâles et femelles.
2. Utiliser 1 BAT tampon pour 3 jetons. Plusieurs coussins BAT peuvent être traitées simultanément jusqu'à la sonication.
3. Crosslink chaque BAT pad dans 10 mL de tampon phosphate salin (PBS) contenant 1 % de formaldéhyde pendant 15 min à 150 tr/min à température ambiante (RT).
4. Étancher la réticulation en ajoutant 2,5 M glycine à une concentration finale de 125 mM pendant 5 min, en tournant à 150 tr/min à température ambiante.
5. Transvaser le pad BAT à 500 µL de tampon de lyse hypotonique (10 mM HEPES, 1,5 mM MgCl₂, 10 mM KCl, 0,5 mM DTT, PMSF à 0,2 mM) et ajouter 2 billes en acier inoxydable (taille : 3,2 mm de diamètre, voir Table des matières) pour chaque pad BAT. Utiliser un homogénéisateur tissu axée sur le talon (voir Table des matières) pour détruire les tissus.
6. Commencer avec 5 min à puissance maximum. Le cas échéant, prolonger le délai jusqu'à ce que le tissu est homogénéisé et cellules individuelles sont séparées. Transférer les échantillons dans un nouveau tube et centrifuger à 4 ° C à 16 000 x g pendant 10 min.
7. Après centrifugation, transvaser le surnageant dans un nouveau tube et garder le culot cellulaire sur la glace. Centrifuger le surnageant à 4 ° C à 16 000 x g pendant 10 min éviter la perte de cellules de flottant. Jeter le surnageant final et remettre en suspension les deux pastilles de cellules ensemble dans 300 µL de tampon de lyse SDS (SDS 1 % ; EDTA 10 mM ; PH Tris-HCl 8, 50 mM) avec 1 x inhibiteur de la protéase (voir Table des matières). Incuber sur glace pendant 10 min.
8. Laisser agir les lysats pour générer le long de paires de bases du 200 – 500 fragments ADN. Après la sonication, enlever les débris par centrifugation pendant 10 min à 16 000 x g à 4 ° C et vérifier le succès de sonication via ADN électrophorèse sur un gel d’agarose à 1 %. Pour un gel de taille moyenne, à 120 V ; une bonne séparation est obtenue après 45 min.
   Remarque : Optimisation de la sonication devrez peut-être vérifier la taille des fragments de réaliser. Avec le sonicateur choisie (voir Table des matières), cela nécessite 2 fois à 320 W puissance de sortie et une fréquence de 20 KHz pendant 10 min, en utilisant les cycles de 30 s/30 s éteint.
9. Diluer la fraction surnageante 10 fois (volume final est de 3 mL pour chaque pad BAT) dans le tampon de dilution de puce (SDS 0,01 % ; Triton 1,1 % ; EDTA 1,2 mM ; Tris-HCl pH 8, 16,7 mM ; NaCl 167 mM) avec 1 x inhibiteur de la protéase. Garder de côté 1 % de cette solution de chromatine (égal à 30 µL de 3 mL) comme l’entrée de la puce. Garder les entrées durant la nuit à 4 ° C (jusqu'à l’étape 2.4).
   Remarque : La fraction ci-dessus fournira la référence d’entrée pour la quantification relative d’immunoprécipitée matériel par rapport à la quantité d’ADN présent dans chaque échantillon avant l’immunoprécipitation.
10. Ajouter l’anticorps ChIP (voir Table des matières pour les anticorps utilisés ici à titre d’exemple) à 1 mL de solution de la chromatine et incuber une nuit à 4 ° C, avec une rotation. Effectuer l’immunoprécipitation parallèle avec correspondant avant immunitaire IgG, si disponible, ou IgG normal de la même espèce (e.g., régulière IgG de lapin si l’anticorps est produit chez un lapin). Vous pouvez également enregistrer 1 mL de solution de chromatine pour un contrôle non-anticorps.
    Remarque : La quantité d’anticorps optimale doit être déterminée expérimentalement pour chaque nouveaux anticorps, si la concentration d’anticorps n’est pas connue. Sinon, 2 à 5 µg d’anticorps est un montant de départ raisonnable d’utiliser. Utiliser des anticorps ChIP-grade lorsque cela est possible, ou des anticorps qui ont été validés pour l’immunoprécipitation.

2. jour 2 : Collection des Complexes immuns

1. Ajouter 50 µL de lisier de 50 % de protéine A Agarose dans les complexes immuns et incuber pendant 1 h à 4 ° C avec rotation à 150 tr/min.
2. Les perles de granule par centrifugation pendant 1 min à 100 g à 4 ° C. Effectuer des lavages séquentielles des perles avec des tampons d’accroître la rigueur.
   1. Tout d’abord, laver avec du tampon de lavage de la faible teneur en sel (NaCl ; 150 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM ; EDTA 2 mM ; Triton-X 1 % ; SDS 0,1 %), puis avec le tampon de lavage de la forte teneur en sel (NaCl ; 500 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM ; EDTA 2 mM, Triton-X1 % ; SDS 0,1 %), puis avec LiCl lavage (0,25 M LiCl ; Tris-HCl pH 8, 10 mM ; EDTA 1 mM ; Igepal 1 % ; deoxicholate 1 %) et enfin avec 1 x TE (Tris-HCl pH 8, 10 mM ; EDTA).
   2. Effectuer tous les lavages sur 0,45 µm PVDF filtre centrifuge des colonnes (Table des matières) par le premier transfert de perles dans les colonnes à l’aide de 500 µL de tampon de lavage de faible teneur en sel. Granulés de perles dans les colonnes pendant 3 min à 2 500 g. Jeter le cheminement et répétez 1 fois pour tous les tampons de lavage dans l’étape 2.2.1.
3. Après les lavages sont terminés, éluer les complexes immuns en ajoutant 300 µL de tampon-élution 1 % SDS, 0,1 M NaHCO₃) aux talons pressés dans les colonnes. Incuber 30 min sur un agitateur à 400 tr/min à RT. Recueillir l’éluat par rotation dans des colonnes pendant 3 min à 2 500 g dans un nouveau tube.
4. Inversez les croisements en incubant l’éluat et entrées recueillies à l’étape de 1,9 à 65 ° C pendant la nuit.

3. jour 3 : Récupération de l’ADN avec Extraction phénol/chloroforme

1. Ajouter 300 µL de phénol : chloroforme : IAA, 1:1 dans les entrées et l’éluat. Vortexer pendant 10 s.
2. Tourner à 4 ° C à 21 000 x gpendant 15 minutes. Transférer le surnageant dans un nouveau tube. Ajouter 3 µL de glycogène, 30 µL d’acétate de sodium 3M et 750 µL d’éthanol froid à 100 %. Vortexer pendant 10 s. conserver à-80 ° C pendant 2 h.
3. Tournez en bas à 21 000 x g à 4 ° C pendant 20 min, garder le diabolo et éliminer le surnageant. Pastille de lavage avec 1 mL de froid 70 % EtOH, puis centrifuger à 21 000 x g à 4 ° C pendant 5 min. jeter le surnageant et le culot sécher à l’air.
4. Resuspendre le culot dans 70 µL d’eau exempte de DNAse.
5. Passez à l’étape 4 pour le test d’occupation de la chromatine sur des régions génomiques précises par PCR quantitative (qPCR) ou à l’étape 5 pour préparer les échantillons pour le séquençage.

4. analyse des puces à l’aide de qPCR (lecture de gènes de récapitulation)

1. Diluer l’entrée l’ADN de l’étape 3.4 pour générer une courbe de référence standard. Des dilutions de 1/10, 1/100 et 1/1000 sont généralement suffisantes pour capturer la gamme linéaire, mais davantage des dilutions peuvent être nécessaires pour les échantillons plus concentrées.
2. Pour chaque paire d’amorces (ici, nous avons utilisé des amorces ciblant les promoteurs NDUFV1 et TOMM20), préparer deux ensembles de qPCR réactions : un en utilisant les échantillons dilués d’entrée à l’étape 4.1 et une seconde avec les échantillons d’ADN isolés par immunoprécipitation de l’étape 3.4. Effectuer chaque réaction en trois exemplaires.
   Remarque : Réactions peuvent être mises en place en parallèle de plusieurs gènes à l’aide de plaques de 96 ou 384 puits.
3. Mettre en place un volume réactionnel de 10 μL / puits avec 5 μL de 2 x PCR mix (Table des matières), 1 μL d’apprêt mix (1 μM avant apprêt et apprêt inverse de 1 μM) et 4 μL d’ADN provenant d’une puce (ou un contrôle d’entrée).
4. Tourner brièvement vers le bas de la plaque.
5. Exécutez les réactions de qPCR sur un système PCR en temps réel en utilisant le protocole recommandé par le fabricant pour la détection de réactif (Table des matières). Ici nous avons utilisé les conditions suivantes : 1) 1 s à 95 ° C pendant 1 cycle ; 2) 1 s à 95 ° C suivie de 20 s à 60 ° C pendant 45 cycles ; 3) 15 s à 95 ° C suivie de 60 s à 60 ° C suivie de 15 s à 95 ° C pendant 1 cycle.
   Remarque : Vérifier la courbe de dissociation : la présence d’un pic dans l’intrigue de dissociation thermique suggère un amplicon unique est généré par la réaction de PCR. Si plus d’un pic est visualisé, il s’agit potentiellement révélateur de multiples, non-spécifique amplicons ; dans ce cas, nous vous recommandons la conception des paires d’amorces alternatives.
6. Déterminer la phase linéaire d’amplification exponentielle de la réaction PCR pour chaque amorce la valeur en calculant la courbe d’étalonnage à l’aide de la série de l’ADN génomique dilué au point 4.1. selon la valeur de Ct (cycle seuil).
7. Si la valeur de Ct de l’ADN de la puce et le contrôle d’entrée dans la valeur de la gamme linéaire du Ct, calculer l’enrichissement de l’ADN de la puce par rapport à l’entrée, selon le facteur de dilution de l’ADN de la puce et le contrôle d’entrée à l’étape 4.1.

5. amplification de l’ADN de puce pour haut débit séquençage (génome-large affichage)

Remarque : Cette étape peut être sous-traitée à l’installation de la base académique ou la société commerciale de séquençage lorsque les capacités de séquençage ne sont pas disponibles interne.

1. Préparer une bibliothèque d’ADN de l’extrait d’ADN avec une préparation adéquate de bibliothèque puce nécessaire (voir la Table des matières) suivant les instructions du fabricant.
2. La bibliothèque sur un système de séquençage haut-débit, utilisant 50 bp single-end comme lecture de séquence (voir Table des matières).
   Remarque : Selon les directives de ChIP-seq suggérées par ENCODE⁶, un minimum de 10 millions de lectures est recommandé pour les génomes de mammifères.

6. raw Data Analysis

1. Réaliser un contrôle de qualité sur lectures de séquençage brutes à l’aide de FastQC⁸.
   Remarque : Mesures de qualité de séquençage commune comprennent par la qualité de la séquence de base, par la séquence de base contenu, par séquence GC contenu, durée d’une séquence et niveaux de duplication de séquence. En général, un score de qualité de lecture de Q > 30 dans chaque position de base est révélateur de résultats du séquençage de haute qualité. La distribution de contenu en GC à travers toutes les lectures doit ressembler à peu près à une distribution normale, avec un pic centré autour de génomique GC contenu pourcentage l’espèce.
2. Enlever toute contamination adaptateur séquençage et lectures de faible qualité par le biais de la lecture coupe utilitaire Trimmomatic⁹.
   Remarque : Les paramètres de mises en œuvre par défaut spécifient l’enlèvement des adaptateurs dépendant de la plate-forme, la suppression des bases de basse qualité de début et de fin et l’utilisation d’une fenêtre coulissante large 4-base pour garnitures de lit quand la qualité moyenne par base drops au-dessous d’un seuil spécifié.
3. S’aligner lectures transformés pour le génome de référence souris MM10¹⁰ l' aligneur de Bowtie2¹¹ en utilisant les paramètres par défaut.
4. Filtrer les lectures alignés en supprimant ceux avec une qualité de cartographie Bowtie2 score (MAPQ) inférieure à 10 à l’aide de Samtools¹².
5. Déterminer les diverses métriques de qualité après l’alignement comme pourcentage lectures mappés, brin intercorrélation, cumulative lire couverture et échantillon répliquent reproductibilité.
   Remarque : Différents forfaits incluant SPP¹³, ChIPqc¹⁴et¹⁵ de la Deeptools sont disponibles pour calculer ces paramètres de qualité.
6. Effectuer une analyse appelant pic avec un contrôle d’entrée ou un échantillon approprié de KO à l’aide de l' algorithme (MACS2) de MACS¹⁶ avec les paramètres par défaut.
7. Supprimer toute appelés pics qui se chevauchent avec les régions sur la liste noire connue¹⁷ de l’annotation mm10 utilisant Bedtools¹⁸.
   Remarque : Sur la liste noire des régions sont des zones dans le génome qui sont sont révélées avoir élevé de signal ou comtes lecture indépendante de lignée cellulaire ou technique de séquençage. Ces régions affichent des signaux artefact artificiellement élevés dans certaines régions du génome qui peuvent être filtrés hors des expériences de séquençage génomique fonctionnelle. Toutes les répétitions doivent être traitées indépendamment à travers le pipeline et peuvent alors être utilisées pour le taux de découverte reproducibilité (IDR). IDR sert à mesurer la reproductibilité des résultats entre les réplicats par le biais de la méthode telle que décrite par Li, Brown, Huang et Bickel^19,20. La méthode IDR quantitativement évalue la cohérence entre les répétitions et est recommandée par ENCODE et modENCODE dans le cadre de leurs directives de ChIP-seq.
8. Utilisez les pics statistiquement significatives pour diverses analyses en aval comme gene ontology^21,22, enrichissement ou motif analyse²³.

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Résultats

Figure 1 : validation de morceau de qPCR. Puce-qPCR analyse de représentant GPS2 cibler les gènes NDUFV1 (à gauche) et TOMM20 (à droite) dans la chauve-souris de souris WT et GPS2-AKO, montrant les variations relatives du niveau de la méthylation de l’H3K9 et la liaison GPS2 et Pol2. Les graphiques à barres représentent la moyenne de l’échantillon de 3 répé...

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Discussion

Le protocole décrit ici représente un outil précieux pour l’exécution de puce de tissus murins, spécialement optimisés pour le tissu adipeux brun. Parmi les plus grands défis dans l’accomplissement de morceau de tissu se remet un nombre suffisant de cellules au cours de la préparation de l’échantillon. Tonte la chauve-souris à l’aide d’un mélangeur homogénéisateur de tissu couplé avec des billes en acier inoxydable au lieu d’un pilon de verre canonique significativement réduit le nombre des cel...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bullet Blender Tissue Homogenizer	Next Advence	BBX24
Stainless Steel Beads 3.2 mm Diameter	Next Advence	SSB32
Bioruptor Sonicator	Diagenode
1.5 mL Micro Tube TPX Plastic	Diagenode	C30010010-5
Complete-Protease inhibitor	Roche	11836145001
Protein A Agarose Slurry	Invitrogen	101041
GPS2 antibody	In house		Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018)
Pol2 antibody	Diagenode	C15100055
h3K9me3 antibody	Millipore	05-1242
Fast Syber Green Master Mix	Aplied Biosytem	4385612
ViiA7	Aplied Biosytem
TruSeq ChIP Library Preparation Kit	Illumina	IP-202-1012
HiSeq 2000	Illumina