Murine 갈색 지방이 많은 직물의 염색 질 Immunoprecipitation

요약

여기는 갈색 지방이 많은 직물 (박쥐)는 마우스에서 분리의 높은 처리량 DNA 연속 (칩 seq) 다음 효율적인 chromatin immunoprecipitation (칩)에 대 한 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜은 히스톤 수정 매핑와 관심 비보의 비 히스톤 단백질의 게놈 넓은 지역화 조사에 적합 합니다.

초록

대부분 세포 프로세스는 특정 유전자 프로그램의 transcriptional 변조에 의해 통제 된다. 이러한 변조 다양 한 녹음 방송 요인 (TFs) 및 공동 인자 중재 transcriptional 활성화 또는 염색 질 구조에 변화를 통해 억압의 결합 된 행동을 통해 이루어집니다. Chromatin immunoprecipitation (칩)은 히스톤 수정 매핑 및 다른 하는 동안 발생 하는 동적 핵 변화의 스냅숏으로 제공 녹음 방송 요인/공동 인자 dna 바인딩 프로 파일링을 위한 유용한 분자 생물학 접근 생물 학적 프로세스입니다.

공부 하 고 지방 조직에 transcriptional 규칙, 체 외에서 세포 배양의에서 파생 된 샘플 불후 또는 1 차 셀 라인 시작 물자의 풍부 때문에 칩 분석 실험에 종종 선호 하 고 생물 다양성을 감소. 그러나, 이러한 모델 생명체에서 실제 chromatin 상태의 제한 된 스냅숏을 나타냅니다. 따라서, 동물 모델에서 파생 된 지방 조직 샘플에 칩을 수행 하기 위해 최적화 된 프로토콜에 대 한 중요 한 필요는.

여기 우리는 히스톤 수정 및 갈색 지방이 많은 직물 (박쥐)는 마우스에서 고립에 있는 비 히스톤 단백질의 효율적인 칩 seq에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜의 관심과 지방 저장소 사이 형태학 상으로 그리고 생리 적으로 뚜렷한 조직 박쥐에 epigenetic 마커 단백질의 게놈 넓은 지역화를 조사 하 고 최적화 되어 있습니다.

서문

반면 흰색 adipose 조직 (WAT)는 에너지 저장을 위해 전문화 된다, 갈색 지방이 많은 직물 (박쥐) 열 에너지를 통해 미토 콘 드리 아 연결을 푸는¹탄수화물과 지질을 변환 하는 기능으로 인해 열 형태로 에너지 없어져 요. 이 특수 기능 때문에 박쥐 디포는 생리 적 조건에 찬 노출에 대 한 응답에 체온의 유지 보수를 위해 필요 합니다. 진 식 변화와 박쥐 차별화 동안 thermogenic 스트레스에 따라 vivo에서 그리고 생체 외에서 광범위 하 게 공부 되었다, 그러나 분자 메커니즘 기본이 변경 되었습니다 주로 불멸 하 게 세포에 해 부와 기본 vivo에서 몇몇 예외 사전 adipocytes,^2,3,,45를 공부 한다.

Transcriptional 규칙을 통해 특정 유전자 식 프로그램의 조정된 변화 chromatin 구조를 통해 다양 한 녹음 방송 요인 및 공동 작업 요인에 의해 이루어집니다. Chromatin immunoprecipitation (칩)은 DNA 이러한 요소의 채용 조사 및 프로 파일링 chromatin 풍경에 관련 된 변화에 대 한 귀중 한 분자 생물학 접근 이다. 칩 실험의 성공에 대 한 핵심 요인 가교 조건 및 적절 한 시작 물자 및, 특히, 항 체의 품질의 다른 예제를 통해 chromatin 전단 일관성의 최적화를 포함합니다. 전체 조직에서 칩을 수행할 때 그것은 또한 중요 한 고려 하는 샘플의이 고 핵 격리의 효율성을 개선 하기 위해 프로토콜 최적화, 후자와 되 고 특히 민감한 단계 때문에 지방 조직에서 작업할 때 상승 된 지질 내용입니다. 사실, 전체 지방 창 고에서 분자 격리 기술을 높은 수준의 트리 글리세라이드의 존재에 의해 복잡은 고 chromatin 격리의 양을 증가 시키는 프로토콜을 최적화 해야 합니다. 마지막으로, 높은 처리량 시퀀싱 칩-DNA 분리 후 수행 될 때 시퀀싱 깊이 봉우리는 자신 있게 검색의 수를 결정 하기 위한 중요 합니다.

여기, 우리 작업 표준 및 인코딩 및 modENCODE 컨소시엄⁶ 모범 사례에 대 한 권장 하는 칩 seq 실험에 대 한 일반적인 지침을 참조 하 고 우리는 칩 seq 박쥐에서 최적화 된 프로토콜에 대 한 단계별 설명에 초점. 설명된 프로토콜 chromatin 지방 조직에서의 효율적인 절연에 대 한 더 확산 신호와 히스톤 부호 뿐만 아니라 잘 정의 된 봉우리 DNA 바인딩 요소에 대 한 게놈 넓은 시퀀싱을 수행 수 있습니다.

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프로토콜

프로토콜의 동물 처리 단계는 보스턴 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 되었습니다.

1. 주 1: 해 부와 Chromatin Immunoprecipitation (칩)에 대 한 박쥐의 준비

1. 이산화탄소 (CO₂) 챔버를 사용 하 여 마우스를 안락사 하 고 해 부를 즉시 수행 이후에. 절 개 전에 70% 에탄올 스프레이 마우스 모피. 다음 자르면 목 따라 피부는 다시 위로 향하도록 마우스를 놓습니다. 어깨 사이 피부 바로 아래 박쥐를 찾습니다 (interscapular; 그것은 신중 하 게 해야 하는 흰색 지방의 얇은 층으로 나비 모양의 두 엽 제거⁷나타납니다).
   참고: 마우스에 대 한 3 개월 된 C57BL/6J 일반 차 다이어트 (27과 30 g 사이이 연령 범위에 마우스 무게)을 먹이, 각 박쥐 엽 약 1 ㎝ 길이입니다. 박쥐 디포의 총 무게는 남성 및 여성 쥐에 있는 약 0.15 g 이다.
2. 1 박쥐 패드를 사용 하 여 3 칩. 여러 개의 박쥐 패드 쥡니다까지 동시에 처리할 수 있습니다.
3. Crosslink 각 박쥐 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 포함 1% 포름알데히드 실내 온도 (RT)에서 150 rpm에 회전 하는 15 분의 10 mL에 패드.
4. 실시간에서 150 rpm 회전 5 분 125 m m의 최종 농도에 2.5 M 글리신을 추가 하 여 가교를 끄다
5. 침투성 세포의 용 해 버퍼 (10 mM HEPES, 1.5 m m MgCl₂, 10 m m KCl, 0.5 m m DTT, 0.2 밀리미터 PMSF)의 500 µ L를 박쥐 패드를 전송 하 고 추가 2 스테인리스 구슬 (크기: 3.2 m m 직경 재료의 표참조) 각 박쥐 패드에 대 한. 구슬-기반 조직 균질 화기를 사용 하 여 조직 분쇄기를 (참조 테이블의 자료).
6. 최대 전력에서 5 분부터 시작. 필요한 경우 조직 무 균 때까지 시간을 확장 하 고 단일 셀 구분 됩니다. 새로운 튜브와 10 분 동안 16000 x g 에서 4 ° C에서 원심 분리기 샘플을 전송 합니다.
7. 원심, 후는 상쾌한 새로운 튜브로 전송 하 고 얼음에 셀 펠 릿을 유지 합니다. 셀의 손실을 방지 하기 위해 10 분 동안 16000 x g에서 4 ° C에서 상쾌한 원심 최종 상쾌한 취소 및 SDS 세포의 용 해 버퍼의 300 µ L에 두 셀 펠 릿을 함께 resuspend (SDS 1%; EDTA 10 밀리미터; Tris-HCl pH 8, 50mm) protease 억제제 x 1 ( 재료의 표참조). 10 분 동안 얼음에 품 어.
8. 긴 DNA 파편 200-500 기본 쌍을 생성 하 lysates sonicate 쥡니다, 후 4 ° C에서 16000 x g 에서 10 분 동안 원심 분리 하 여 파편을 제거 하 고 쥡니다 통해 DNA 전기 이동 법의 1 %agarose 젤에 성공을 확인 합니다. -젤 120 V;에서 실행 좋은 분리 45 분 후에 이루어집니다.
   참고: 쥡니다 최적화 파편의 적절 한 크기를 달성 하기 위해 필요할 수 있습니다. 선택한 sonicator와 ( 재료의 표참조)에서 30 s/30 s의 사이클을 사용 하 여이 320 W 출력 파워에 10 분, 20 KHz 주파수 2 배 필요 합니다.
9. 표면에 뜨는 분수를 10 배 희석 (최종 볼륨은 각 박쥐 패드 3 mL) 칩 희석 버퍼에서 (SDS 0.01%; 트리톤 1.1%; EDTA 1.2 m m; Tris HCl pH 8, 16.7 m m; NaCl 167 mM) protease 억제제 x 1. 옆으로 칩 입력으로이 chromatin 솔루션 (30 µ L 3 ml 같음)의 1%를 유지. 입력 하룻밤 4 ° C에서 (까지 계속 단계 2.4).
   참고: 위의 분수 DNA immunoprecipitation 전에 각 샘플에 존재의 금액에 비해 immunoprecipitated 소재의 상대 정량화에 대 한 기준 입력된을 제공할 것입니다.
10. 칩 항 체를 추가 (사용 하는 항 체에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오 예를 들어 여기) chromatin 솔루션의 1 mL에 회전 4 ° C에서 밤새 품 어 고. 해당 사전 면역 IgG, 가능한 경우, 또는 동일한 종의 정상 IgG 병렬 immunoprecipitation을 수행 (예. 일반, IgG 항 체는 토끼에서 생산 하는 경우에, 토끼). 또는, 아니오-항 체의 제어를 위한 chromatin 솔루션의 1 mL를 저장 합니다.
    참고: 항 체의 최적의 금액 결정 되어야 합니다 실험적으로 각 새로운 항 체에 대 한 항 체 농도 알 수 없는 경우. 그렇지 않으면, 2-5 µ g 항 체의 사용 하 여 합리적인 시작 금액입니다. 가능 하다 면, 칩 급 항 체 또는 검증 된 항 체를 사용 하 여 immunoprecipitation에 대 한.

2. 면역성이 있는 복합물의 제 2 일: 수집

1. 면역성이 있는 복합물을 단백질 A Agarose 50% 슬러리의 50 µ L을 추가 하 고 회전 150 rpm으로 4 ° C에서 1 시간에 품 어.
2. 4 ° c.에 100 x g 에서 1 분 동안 원심 분리 하 여 구슬을 펠 렛 증가 엄중의 버퍼와 구슬의 순차적 세척을 수행 합니다.
   1. 첫째, 낮은 소금 워시 버퍼 (150 m m NaCl; 세척 Tris HCl pH 8, 20 밀리미터; EDTA 2 밀리미터; 트리톤-X 1%; SDS 0.1%), 그 후에 높은 소금 워시 버퍼 (500 m m NaCl; Tris HCl pH 8, 20 밀리미터; EDTA 2mm, 트리톤 X1%; SDS 0.1%), 다음 LiCl 세척 (0.25 M LiCl; Tris HCl pH 8, 10 mM; EDTA 1 밀리미터; Igepal 1%; deoxicholate 1%), 그리고 마지막으로 1 x 테 (Tris HCl pH 8, 10 mM;와 EDTA)입니다.
   2. 첫 번째 전송 낮은 소금 워시 버퍼의 500 µ L를 사용 하 여 열에 구슬 0.45 μ m PVDF 원심 필터 열 (자료 테이블)에 모든 세척을 수행 합니다. 2500 x g에서 3 분에 대 한 열에 구슬 작은 통해 흐름 무시 하 고 단계 2.2.1에에서 나열 된 모든 워시 버퍼에 대 한 1 시간을 반복 합니다.
3. 세척 완료 차입 버퍼 1 %SDS, 0.1 M NaHCO₃의 300 µ L을 추가 하 여 면역 복합 elute) 열에서 수송과 구슬에. RT에서 400 rpm에서 통에 30 분 동안 품 어. eluate 신선한 튜브에 2500 x g 에서 3 분에 대 한 열 아래로 회전 하 여 수집 합니다.
4. 잠복기 eluate와 하룻밤 65 ° C에서 1.9 단계에서 수집 하는 입력으로는 crosslinks를 반대로.

3. 주 3: 페 놀/클로 프롬 추출 된 DNA의 복구

1. 페 놀: 클로 프롬: IAA, eluate 및 입력을 1: 1의 300 µ L를 추가 합니다. 10 소용돌이 s.
2. 21000 x g에서 15 분 동안 4 ° C에서 회전 합니다. 신선한 튜브는 상쾌한 전송. 글 리 코겐, 3m 나트륨 아세테이트, 30 µ L 및 감기 100% 에탄올의 750 µ L의 3 µ L를 추가 합니다. 2 h-80 ° C에서 10 s. 저장소에 대 한 소용돌이.
3. 20 분 동안 4 ° C에서 21000 x g에서 스핀 다운, 펠 릿, 유지 하 고는 상쾌한 삭제. 워시 펠 릿 찬 70%의 1 mL EtOH, 다음 5 분에 4 ° C에서 21000 x g 에 아래로 회전은 상쾌한 삭제와 펠 릿을 건조.
4. DNAse 무료 물 70 µ L에 펠 릿을 resuspend.
5. 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)에 의해 특정 게놈 지역에 chromatin 인을 테스트 하기 위한 4 단계 또는 시퀀싱에 대 한 샘플을 준비 하는 5 단계를 진행 합니다.

4. 정량 (Single/Multiple 유전자 해독)를 사용 하 여 칩의 분석

1. 희석 단계 표준 참조 커브를 생성 하는 3.4에서에서 입력 DNA. 직렬 희석의 1/10, 1/100, 1/1000는 일반적으로 선형 범위를 캡처하는 데 충분 하지만 더 희석 집중된 샘플에 대 한 필요할 수 있습니다.
2. 각 뇌관 쌍에 대 한 (여기, 우리는 NDUFV1 및 TOMM20 프로모터를 대상으로 하는 뇌관), 사용 정량 반응의 두 세트를 준비: 3.4 단계에서 immunoprecipitation에 의해 고립 된 DNA 샘플 단계 4.1, 및 두 번째에서 희석된 입력된 샘플을 사용 하 여 한. 3 중 각 반응을 수행 합니다.
   참고: 반응 96-또는 384-잘 접시를 사용 하 여 여러 개의 유전자에 대 한 동시에 설정할 수 있습니다.
3. 2 x PCR 혼합 (자료 테이블)의 5 μ와 잘 당 10 μ의 반응 볼륨 설정, 뇌관의 1 μ (1 μ M 앞으로 뇌관 및 역방향 뇌관 1 μ M)을 혼합 하 고, 그리고 DNA 칩 (또는 입력된 컨트롤)에서 4 μ.
4. 짧게 접시 아래로 회전 합니다.
5. 정량 Pcr 반응에서 실시간 PCR 시 약 검색 (자료 테이블)에 대 한 제조 업체에서 권장 하는 프로토콜을 사용 하 여 실행 합니다. 여기 우리가 다음 조건 사용: 1) 1 개 주기; 95 ° C에서 1 2) 1 20 뒤에 s 95 ° C에서 45 주기; 60 ° C에서 s 3) 15 s 95 ° C에서 60 다음 s 60 ° C에서 15 다음 1 주기 동안 95 ° C에서 s.
   참고: 분리 곡선 확인: 열 분리 음모에서 한 피크의 존재 제안 단일 amplicon PCR 반응에서 생성 됩니다. 하나 이상의 피크 시각 이다, 이것이 잠재적으로 나타내는 여러, 일반적인 amplicons; 어떤 경우에, 대체 뇌관 쌍의 디자인을 좋습니다.
6. 각 뇌관 단계 4.1에서에서 희석된 genomic DNA의 일련을 사용 하 여 표준 곡선을 계산 하 여 설정에 대 한 PCR 반응의 지 수 증폭의 선형 단계를 결정 합니다. Ct (사이클 임계값) 값에 따라.
7. DNA 칩 및 입력된 제어에서의 Ct 값 선형 Ct 값 안에 있다면, DNA 칩 및 단계 4.1에서에서 입력된 컨트롤의 희석 비율에 따라 입력을 기준으로 DNA 칩에서의 농축을 계산 합니다.

5. 높은 처리량 (게놈 넓은 판독) 시퀀싱에 대 한 칩에서 DNA의 증폭

참고: 이 단계 시퀀싱 기능 사용할 수 없을 때 사내 학술 핵심 시설 또는 상업적인 시퀀싱 회사 아웃소싱 될 수 있습니다.

1. 적절 한 칩 라이브러리 준비와 추출 된 DNA에서 DNA 도서관을 준비 ( 재료의 표참조) 키트 제조업체의 지침에 따라.
2. 시퀀스 판독으로 50 bp 싱글-엔드를 사용 하는 높은 처리량 시퀀싱 시스템 라이브러리 ( 재료의 표참조).
   참고: 지침에 따르면 칩 seq 인코딩⁶에 의해 제안, 포유류 게놈 10 백만 읽기의 최소 권장 합니다.

6. 원시 데이터 분석

1. FastQC⁸를 사용 하 여 원시 연속 읽기에서 품질 관리를 수행 합니다.
   참고: 일반적인 시퀀싱 품질 통계 기준 시퀀스 품질 당, 기본 시퀀스 콘텐츠 당, 시퀀스 GC 내용, 시퀀스 길이, 및 시퀀스 중복 수준 당 포함 됩니다. 일반적으로, 읽기 품질 평가 점수 Q의 > 30 각 기본 위치에 걸쳐 높은-품질 시퀀싱 결과 나타내는 것입니다. 모든 읽기에 걸쳐 GC 콘텐츠의 유통을 피크 종 실제 게놈 GC 컨텐츠 비율을 중심으로 정규 분포를 닮은 약 한다.
2. 모든 시퀀싱 어댑터 오염 및 낮은 품질 유틸리티 Trimmomatic⁹트리밍 읽기를 통해 읽기를 제거 합니다.
   참고: 구현 된 기본 매개 변수 지정 플랫폼 종속 어댑터 제거, 선행 및 후행 낮은 품질 기지의 제거 및 손질 때 읽고 4 기반 넓은 슬라이딩 윈도우를 사용 하 여 지정된 된 임계값 아래 기본 상품 당 평균 품질.
3. 기본 매개 변수를 사용 하 여 Bowtie2 aligner¹¹ 마우스 MM10 참조 게놈¹⁰ 처리 읽기를 맞춥니다.
4. 정렬 된 읽기 Bowtie2 매핑 품질에 그들을 제거 하 여 필터링 (MAPQ) 10 미만 Samtools¹²를 사용 하 여 점수.
5. % 읽기 매핑된, 스트랜드 교차 상관, 누적 읽을 적용률과 샘플 재현성 복제와 같은 다양 한 후 맞춤 품질 통계를 확인 합니다.
   참고: SPP¹³를 포함 한 다양 한 패키지, ChIPqc¹⁴및¹⁵ Deeptools 사용할 수 있습니다 이러한 품질 메트릭을 계산 하.
6. 피크 입력된 컨트롤 또는 기본 매개 변수가 있는 MAC 알고리즘 (MACS2)¹⁶ 을 사용 하 여 적절 한 코 샘플 호출 분석을 수행 합니다.
7. Bedtools¹⁸를 사용 하 여 mm10 주석에서 알려진된 블랙 리스트 지역¹⁷ 와 겹치는 모든 라는 봉우리를 제거 합니다.
   참고: 블랙 리스트는 높은 신호 또는 읽기 수 독립적으로 세포 선 또는 시퀀싱 기법을가지고 표시 되었습니다 게놈에 있는 지역. 이 지역 기능 게놈 시퀀싱 실험에서 필터링 할 수 있는 게놈의 특정 지역에서 인위적으로 높은 유물 신호를 표시 합니다. 모든 복제는 파이프라인을 통해 개별적으로 처리 되어야 합니다 그리고 irreproducibility 검색 속도 (IDR)에 사용할 수 있습니다. IDR 리, 갈색, 황, 및 강사^19,20에 의해 설명 된 대로 메서드를 통해 복제 사이 결과의 재현성을 측정 하기 위해 채택 된다. IDR 메서드는 양적 복제 사이의 일관성을 평가 하 고 그들의 칩 seq 지침의 일환으로 인코딩 및 modENCODE에 의해 권장 합니다.
8. 통계적으로 중요 한 봉우리를 사용 하 여 유전자 온톨로지^21,22, 농축, 또는 주제 분석²³등 다양 한 다운스트림 분석에 대 한.

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결과

그림 1: 정량 하 여 유효성 검사를 칩. 대표 GPS2의 칩 정량 분석 대상으로 H3K9 메 틸 화 및 GPS2 및 Pol2 바인딩 수준에서 상대적 변화를 보여주는 WT 및 GPS2-아카 호 쥐의 박쥐에 유전자 NDUFV1 (왼쪽)와 TOMM20 (오른쪽). 막대 그래프와 함께 3 복제의 표본 평균이 대표 * p < 0.05와 * * p < 0.01 계산 ?...

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토론

여기에 설명 된 프로토콜 murine 조직, 갈색 지방 조직 최적화에서 칩을 수행 하기 위한 유용한 도구를 나타냅니다. 조직에서 수행 하는 칩에 큰 과제 중 하나는 샘플 준비 하는 동안 세포의 충분 한 수를 회복 됩니다. 박쥐는 정식 유리 유 봉 대신 스테인리스 구슬 크게 결합 조직 균질 화기 믹서 기를 사용 하 여 전단 파손 되지 않는 조직으로 인해 손실 된 세포의 수를 줄입니다. 또한, 소형 버퍼에?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bullet Blender Tissue Homogenizer	Next Advence	BBX24
Stainless Steel Beads 3.2 mm Diameter	Next Advence	SSB32
Bioruptor Sonicator	Diagenode
1.5 mL Micro Tube TPX Plastic	Diagenode	C30010010-5
Complete-Protease inhibitor	Roche	11836145001
Protein A Agarose Slurry	Invitrogen	101041
GPS2 antibody	In house		Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018)
Pol2 antibody	Diagenode	C15100055
h3K9me3 antibody	Millipore	05-1242
Fast Syber Green Master Mix	Aplied Biosytem	4385612
ViiA7	Aplied Biosytem
TruSeq ChIP Library Preparation Kit	Illumina	IP-202-1012
HiSeq 2000	Illumina