Verwenden von Microtiter Dish Radiolabeling für mehrere In-Vivo-Messungen von Escherichia coli (p)ppGpp gefolgt von dünnschichtiger Chromatographie

Zusammenfassung

Das Wachstum von radioaktiv markierten Bakterienkulturen in Mikrotiter-Gerichten ermöglicht eine Probenahme mit hohem Durchsatz, die mehrere technische und biologische Replizierungen von Nukleotid-Pool-Überfluss ermöglicht, einschließlich der von (p)ppGpp. Die Auswirkungen von Wachstumsübergängen, die durch Quellen physiologischen Stresses sowie Erholung von Stress hervorgerufen werden, können überwacht werden.

Zusammenfassung

Das (p)ppGpp-Nukleotid fungiert als globaler Regulator bei Bakterien als Reaktion auf eine Vielzahl von körperlichen und ernährungsphysiologischen Belastungen. Es hat einen schnellen Beginn, in Sekunden, die zu einer Anhäufung von Ebenen führt, die sich denen von GTP-Pools nähern oder übertreffen. Stressumkehr gelegentlich ein schnelles Verschwinden von (p)ppGpp, oft mit einer Halbwertszeit von weniger als einer Minute. Das Vorhandensein von (p)ppGpp führt zu Veränderungen der zellulären Genexpression und des Stoffwechsels, die den schädlichen Auswirkungen von Stress entgegenwirken. Gram-negative und gram-positive Bakterien haben unterschiedliche Reaktionsmechanismen, aber beide hängen von (p)ppGpp-Konzentration ab. In jedem Fall ist es notwendig, gleichzeitig viele radioaktiv markierte Bakterienkulturen in Zeitintervallen zu überwachen, die während kritischer Stressübergangsperioden von 10 Sekunden bis Stunden variieren können. Dieses Protokoll behebt diese technische Herausforderung. Die Methode nutzt temperatur- und schüttergesteuerte Mikrotiter-Schalen-Inkubatoren, die eine parallele Überwachung des Wachstums (Absorption) und eine schnelle Probenahme von einheitlich phosphatradioaktiv markierten Kulturen ermöglichen, um Nukleotidbecken durch Dünnschichtchromatographie auf PEI-Zellulose. Für mehrere technische und biologische Wiederholungen von Analysen werden geringe Probenmengen benötigt. Komplexe Wachstumsübergänge wie diauxisches Wachstum und schnelle (p)ppGpp-Fluktuationsraten können mit dieser Methode quantitativ bewertet werden.

Einleitung

Der (p)ppGpp zweite Bote ist ein globaler Regulator, der die Expression einer großen Anzahl von Genen moduliert, einschließlich Genen zur Synthese von Ribosomen und Aminosäuren^1,2. Obwohl zunächst in Escherichia coli³entdeckt, (p)ppGpp kann sowohl in Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien als auch in pflanzende Chloroplasten^4,5gefunden werden. Bei E. coli und anderen Gram-negativen Bakterien interagiert (p)ppGpp direkt mit RNA-Polymerase an zwei verschiedenen Stellen^6,7,8. In Gram-Positiven hemmt (p)ppGpp die GTP-Fülle, die von CodY wahrgenommen wird, einem GTP-bindenden Protein mit genspezifischen DNA-Erkennungsmotiven, die zur Regulation^9,10führen. p)ppGpp sammelt sich als Reaktion auf den Hunger todbringend für verschiedene Nährstoffe und Stressbedingungen an, was zu langsamem Wachstum und Anpassungen der Genexpression führt, um eine Anpassung an Stress^11,12zu ermöglichen.

Der netto angesammelte ppGpp spiegelt ein Gleichgewicht zwischen Synthetase- und Hydrolaseaktivitäten wider. In E. coli RelA ist eine starke Synthetase und SpoT ist bifunktional, mit einer starken Hydrolase und einer schwachen Synthetase, die jeweils unterschiedlich in einer stressabhängigen Weise reguliert werden könnten. Die starke RelA-Synthetase wird aktiviert, wenn die Verfügbarkeit von codon-spezifizierter geladener tRNA an die ribosomale A-Stelle gebunden ist, wenn sie nicht mit den Anforderungen der Proteinsynthese^13,14,15Schritt hält. Die schwache SpoT (p)ppGpp-Synthetase wird aktiviert, während die starke (p)ppGpp-Hydrolase als Reaktion auf andere Stressbedingungen und durch andere Mechanismen gehemmt wird. Unter bestimmten Bedingungen können Proteine wie ACP oder Rsd an SpoT binden, was auch das Gleichgewicht zwischen Hydrolyse und Synthese^16,17verändert. In Gram-Positiven spiegeln Synthese und Hydrolyse ein komplexeres Gleichgewicht zwischen einem einzelnen RelA SpoT-Homolog (RSH)-Protein mit starken Synthese- und Hydrolyseaktivitäten sowie kleineren Hydrolasen und/oder Synthetasen¹²wider.

Die (p)ppGpp-Nukleotide wurden zuerst als ungewöhnliche ³²P-markierte Flecken entdeckt, die auf Autoradiogrammen von Dünnschichtchromatogrammen (TLC) während einer strengen Reaktion durch Aminosäurehunger³erschienen sind. Detailliertere Kennzeichnungsprotokolle wurden überprüft ¹⁸. Das hier beschriebene Protokoll (Abbildung 1) ist eine Änderung dieser Protokolle, die es ermöglicht, das Wachstum mehrerer Proben auf Mikrotiterplatten zu überwachen. Dies erleichtert mehrere biologische und technische Schätzungen von (p)ppGpp-Überflussänderungen und wurde ursprünglich für Studien von diauxischen Schichten¹⁹entwickelt. Die Kennzeichnung von (p)ppGpp mit ³²P und die Detektion durch TLC ermöglicht auch Messungen von (p)ppGpp Abbauraten. Es wurden alternative Methoden entwickelt, um (p)ppGpp-Spiegel wie Massenspektrometrie, HPLC²⁰, fluoreszierende Chemosensoren^21,22und GFP-Genfusionen an Promotoren zu bestimmen, die von ppGpp²³betroffen sind, ²⁴. Fluoreszierende Chemosensoren haben derzeit aufgrund kleiner Spektralverschiebungen nach Bindung ppGpp sowie Problemen bei der Unterscheidung zwischen ppGpp und pppGpp²¹einen begrenzten Einsatz. Diese Methode ist effizient, um (p)ppGpp in vitro zu erkennen, aber nicht in zellulären Extrakten. Die Methoden mit HPLC wurden^{um 20} verbessert, erfordern aber teure Geräte und sind nicht gut an hohe Durchsatz angepasst. Schließlich können GFP-Fusionen eine Schätzung der ppGpp-abhängigen Aktivierung oder Hemmung ergeben, messen jedoch ppGpp selbst nicht. Obwohl jede dieser alternativen Methoden wertvoll ist, erfordern sie teure Ausrüstung oder eine erhebliche Praktische Zeit, oder sie sind ansonsten nicht für mehrere kinetische Probenahmen und nachfolgende Verarbeitungen geeignet. Mit dem hier beschriebenen Verfahren können 96 Proben auf sechs TLC-Platten in etwa 20 min (18 Proben pro Platte) aufgebracht werden, die durch TLC-Entwicklung in weniger als ein paar Stunden gelöst werden, wobei quantitative Daten nach mehreren Stunden oder über Nacht, je nach Etikettierung, intensität.

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Protokoll

1. Medienvorbereitung

1. Für MOPS (3-(N-morpholino)propanesulfonsäure) media²⁵, verwenden Sie 1/10 Volumen von 10x MOPS Salzen, 1/100 Volumen von 100x Mikronährstofflösung, 3 mM Natriumphosphat für Nachtkulturen oder 0,2 mM Natriumphosphat zur gleichmäßigen Kennzeichnung mit ³²P, 0,2% Glukose und 1 g/ml Thiamin (Vitamin B1). Fügen Sie bei Bedarf Aminosäuren mit 40 g/ml hinzu.
   1. Für MOPS-Salze verwenden Sie 400 mM MOPS, 40 mM Tricine, 0,1 mM FeSO₄, 95 mM NH₄Cl, 2,6 mM K₂SO₄, 5 'M CaCl₂, 10.56 mM MgCl₂und 500 mMN NaCl. Fügen Sie die verschiedenen Komponenten in der Reihenfolge hinzu, die geschrieben wurde, um Niederschläge zu vermeiden. Mit KOH auf pH 7,4 einstellen und durch Filtration sterilisieren.
   2. Für 100x Mikronährstofflösung verwenden Sie 3 m (NH₄)₆(MO₇)₂₄, 0,4 mM H₃BO₄, 30 m CoCl₂, 10 'M CuSO₄, 80 m MnCl₂und 10 'M ZnSO₄. Sterilisieren durch Autoklavieren.
   3. Für Glukose (20%) und Natriumphosphat (300 mM) Lösungen, sterilisieren als separate 100x Bestände durch Autoklavieren. Sterilisieren Sie 100-fache Bestände an Thiamin- und Aminosäuremischungen durch Filtration. Bereiten Sie frische Medien aus sterilen Lagerlösungen für jedes Experiment vor.

2. Etikettierung mit ³²P

1. Übernachtkulturen in MOPS-Medien mit 3 mM Natriumphosphat anbauen.
2. In einer 24-Well-Platte 550 l MOPS-Medien mit 0,2 mM Natriumphosphatträger und 30 l jedes bakteriellen Inokulums (Verdünnung 1/20) hinzufügen. Dadurch entläuft sich ein anfängliches Inokulum von OD_600nm 0.1. Verwenden Sie eine gut mit frischen Medien als Sterilitätskontrolle.
3. Legen Sie die Platte auf einen Schüttelinkubator bei 37 °C Schütteln bei 900 Rpm für 30 min. Kulturen werden von unten erhitzt und Schütteln sorgt für Belüftung. Befestigen Sie die Platte fest mit Klebeband, um Kippen oder Verschütten zu vermeiden. Das Wachstum kann mit einer Replizierungsplatte parallel in Medien ohne ³²P mit einem Plattenleser und Inkubation unter den gleichen Bedingungen überwacht werden.
4. Fügen Sie jedem Bohrgut mit ³²P Orthophosphat (20 l aus einem 5 mCi/ml-Bestand) 100 Ci hinzu.
   HINWEIS: Die Radioaktivität kann auch an den experimentellen Bedarf angepasst werden. Bei niedrigen Basalwerten funktionieren 100 -Ci mit 0,2 mM Trägerphosphat gut, aber für die Messung (p)ppGpp-Werte, die voraussichtlich den GTP-Pools entsprechen, kann die Kennzeichnung auf 25 oder 50 C/Ci gesenkt werden. Eine Senkung des Trägerphosphats unter 0,2 mM wird nicht empfohlen, um zu vermeiden, dass der Phosphatgehalt für das Wachstum begrenzt wird.
   VORSICHT: ³²P ist ein emittierendes Isotop, also verwenden Sie die richtige Abschirmung, die für die Sicherheit angegeben ist. Das gesamte radioaktive Material muss unter Allen möglichen Vorsichtsmaßnahmen ordnungsgemäß entsorgt werden.
5. Wachsen Sie im Schüttelinkubator für 1 bis 2 Verdoppelungen (1 h oder mehr), damit externe Etiketten weitgehend mit intrazellulären Nukleotidbecken gleichsetzen können, bevor Stress entsteht.

3. Induktion von Stress oder Hunger

1. Induzieren Sie Stress mit einer Methode Ihrer Wahl, abhängig von der Art des untersuchten Stresses, z. B. Zugabe von Stoffwechselweginhibitoren, Temperaturänderung, erschöpfende benötigte Nährstoffe, Verschiebung der Osmolaritätsverschiebungen, Induzieren von oxidativem Stress, Zugabe von Toxinen usw.
   1. Fügen Sie z. B. 100 g/ml L-Valin hinzu, um Isoleucin-Hunger in E. coli K-12-Stämmen zu induzieren. Erhöhte ppGpp-Spiegel werden nach 5 Minuten Induktion beobachtet.

4. Probenahme und ppGpp-Extraktion

1. Fügen Sie 20 l jeder beschrifteten Zellprobe in ein 0,2 ml PCR-Rohr mit 20 l eiskalter 6 M Ameisensäure hinzu.
2. Die Proben sofort in Trockeneis geben.
3. Verbessern Sie die Effizienz der zellulären Extraktion durch 3 Zyklen des Einfrierens und Auftauens.
4. Kurz vor der Erkennung pei Zellulose Dünnschicht Chromatogramme, Zentrifugenproben für 1 min bei maximaler Geschwindigkeit, um Zellablagerungen zu pellet, um zu vermeiden, dass es auf Chromatogrammen zu erkennen.

5. Dünnschicht-Chromatographie

1. Markieren Sie mit einem weichen Bleistift eine Ursprungslinie 1 cm vom Rand der 20 cm x 20 cm PEI-Cellulose TLC Platte, die mit einer Schere 5 cm von der Oberseite entfernt wurde. Für jede Probe 5 l als Tröpfchen in der PEI-Oberfläche auftragen. Beginnen Sie die aufsteigende Entwicklung, ohne diesen Punkt trocknen zu lassen, wodurch die Auflösung durch Minimierung von Streaking verbessert wird.
2. Führen Sie die aufsteigende Entwicklung in einem Tank mit einer Schicht von 1,5 M KH₂PO₄ (pH 3.4) Lösung flach genug, so dass Flüssigkeit nicht berühren die Ursprungsprobe Punkt. Bedecken Sie den Tank mit einer luftdichten Dichtung und lassen Sie den flüssigen Aufstieg an die Oberseite des getrimmten Blattes, 15 cm, zu. Um pH 3,4 für eine 1,5 M KH₂PO₄ Lösung zu erreichen, ist es notwendig, den pH-Wert durch Zugabe von H₃PO₄einzustellen.
3. Entfernen Sie das ausgereifte Chromatogramm und trocknen Sie die Luft bei Raumtemperatur.
4. Schneiden und entsorgen Sie den oberen (pH-Front) Teil des Chromatogramms, das die freien ³²P enthält, in radioaktiven Abfall. Dieser Teil wird in Abbildung 2 in gelber Farbe dargestellt und unter UV-Licht leicht visualisiert. Wenn nur (p)ppGpp-Nukleotide gemessen werden, die langsamer als GTP migrieren, wird empfohlen, einen UV-sichtbaren GTP-Standard auszuführen und dann einen größeren oberen Teil (alles über GTP, wie in Abbildung 2dargestellt) zu schneiden und zu verwerfen.
5. Stellen Sie autoradiografische Filme über Nacht mit einem Phosphorbildschirm aus.
6. Entwickeln Sie den Film. Erfassen und quantitieren Sie das Phosphor-Bildschirmsignal mit einem Phosphoimager.

6. Quantifizierung von (p)ppGpp

1. Quantitieren Sie radioaktive Flecken mit Bild J^26,27.
   HINWEIS: Die Menge an (p)ppGpp kann auf die Gesamtmenge der in jeder Stichprobe beobachteten G-Nukleotide normalisiert werden (Abbildung 2). Wenn die Hintergrundmenge homogen ist, kann ein einzelnes Rohling (Feld 4 aus Abbildung 2) subtrahiert werden, um den Hintergrund zu korrigieren. Total G ist die Summe der ermittelten GTP + ppGpp + pppGpp. Diese Normalisierung setzt voraus, dass der GMP- und das BIP-Niveau vernachlässigbar sind, was für E. coligilt. Das Verhältnis eines gegebenen Nukleotids zu Gesamt-G bietet eine wichtige Möglichkeit, Variationen des angewendeten Probenvolumens zu korrigieren.

7. Messung der Rate des ppGpp-Zerfalls

HINWEIS: Eine Änderung dieses Protokolls ermöglicht Messungen von ppGpp-Zerfallsraten.

1. Nach einer Zeit, die ausreichte, um eine ppGpp-Akkumulation zu ermöglichen (Schritt 3), um die Spannung umzukehren, um die fortgesetzte ppGpp-Synthese zu blockieren, die den Nachweis hydrolytischer Raten ermöglicht. Das Verfahren zur Umkehrung hängt von der Belastung ab. Fügen Sie z. B. 200 g/ml Chloramphenicol hinzu, um den Hunger der Aminosäure umzukehren.
2. Zerfallsraten sind in der Regel schnell, können aber variieren, so nehmen Sie Proben alle 20-30 s bis zu 2 min. Prozessproben wie in Schritt 4.
3. Sobald der TLC entwickelt ist (wie in Schritt 5) und die während des Zeitverlaufs erhaltenen ppGpp-Ebenen, zeichnen Sie den Rest-ppGpp-Inhalt auf einem semilogarithmischen Diagramm vs. Zeit, um die Visualisierung von Null-Order-Zerfallsraten als gerade Linie und die Schätzung der ppGpp-Halbwertszeit zu ermöglichen.

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Ergebnisse

Bei E. coli K-12-Stämmen provoziert die Zugabe von Valin einen endogene Hunger von Isoleucin, was zu einer Erhöhung des ppGpp-Spiegels nach 5 min³führt. Zellen, die in MOPS angebaut wurden und alle Aminosäuren mit Ausnahme von ILV enthielten, wurden mit ³²P gekennzeichnet, wie in Abbildung 1angegeben. Nach der Etikettierung wurden 6 l mit 10 mg/ml L-Valin (100 g/ml Endkonzentration) zugegeben, um Isoleucin-Hunger zu erzeugen. Die Proben ...

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Diskussion

Die Nahe eine einheitliche Kennzeichnung der Zellen ist ein entscheidender Schritt für dieses Protokoll. Daher ist die Verwendung definierter Medien wie MOPS- oder Tris-Medien von entscheidender Bedeutung, um eine Variation der Phosphatkonzentrationen des Trägers und spezifische Aktivitäten zu ermöglichen. Phosphatgepufferte Medien wie M9 oder Media A können nicht verwendet werden. Die meisten undefinierten Medien enthalten variable Mengen an Phosphat, wie LB, Trypton und Casaminosäuren. Das Phosphatisotop ^33<...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
(NH4)6(MO7)24	Fisher Scientifics	A-674
Autoradiography film	Denville scientific inc.	E3218
CaCl2	J.T.Baker	1-1309
Chloramphenicol	RPI	C61000-25.0
CoCl2	Fisher Scientifics	C-371
CuSO4	J.T.Baker	1843
FeSO4	Fisher Scientifics	I-146
Formic acid	Fisher Biotech	BP1215-500
Glucose	Macron	4912-12
H3BO4	Macron	2549-04
H3PO4	J.T.Baker	0260-02
K2SO4	Sigma	P9458-250G
KH2PO4	Fisher Biotech	BP362-500
L-Valine	Sigma	V-6504
MgCl2	Fisher Scientifics	FL-06-0303
Microplate reader Synergy HT	Biotek	Synergy HT
MnCl2	Sigma	M-9522
MOPS	Sigma	M1254-1KG
Na2HPO4	Mallinckrodt	7892
NaCl	J.T.Baker	3624-01
NaH2PO4	Mallinckrodt	7917
NH4Cl	Sigma	A0171-500G
P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi)	Perkin Elmer	NEX053005MC
Storage phosphor screen	Kodak	So230
Thermomixer	Eppendorf	5382000015
Thiamine	Sigma	T-4625
TLC PEI Cellulose F	Merk-Millipore	1.05579.0001
Tricine	RPI	T2400-500.0
Typhoon 9400 imager	GE Healthcare
ZnSO4	Fisher Scientifics	Z-68