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요약

마이크로티터 접시에 방사성 표지된 세균 배양물의 성장은 (p)ppGpp를 포함하여 뉴클레오티드 풀 풍부의 다중 기술적 및 생물학적 복제 측정을 허용하는 높은 처리량 샘플링을 용이하게 합니다. 생리 적 스트레스의 소스에 의해 자극 성장 전환의 효과 뿐만 아니라 스트레스에서 복구 모니터링할 수 있습니다.

초록

(p)pppp 뉴클레오티드는 다양한 신체적 및 영양적 스트레스에 반응하여 박테리아에서 글로벌 조절제로서 기능한다. 그것은 GTP 풀의 접근 또는 초과 수준의 축적에 이르게 초, 빠른 발병이있다. 스트레스 반전은 (p)ppGpp의 급속한 실종을 발생, 종종 1 분 미만의 반감기와. (p)ppGpp의 존재는 스트레스의 해로운 영향에 대응하는 세포 유전자 발현 및 신진 대사의 변경으로 이됩니다. 그람 음성 및 그람 양성 박테리아는 서로 다른 반응 메커니즘을 가지고 있지만 둘 다 (p)ppGpp 농도에 의존한다. 어쨌든, 중요한 스트레스 전환 기간 동안 10 초에서 시간까지 다를 수있는 시간 간격으로 많은 방사성 표지 된 박테리아 배양을 동시에 모니터링 할 필요가 있습니다. 이 프로토콜은 이러한 기술적 문제를 해결합니다. 이 방법은 온도 및 셰이커 제어 마이크로 티터 접시 인큐베이터를 활용하여 성장 (흡광도)의 병렬 모니터링및 균일한 인산염 방사성 표지 배양물의 신속한 샘플링을 통해 뉴클레오티드 풀을 해결하고 정량화합니다. PEI 셀룰로오스에 얇은 층 크로마토그래피. 분석의 여러 기술적 및 생물학적 복제에 소량의 샘플이 필요합니다. 이러한 복잡한 성장 전환, 예컨대 급속한 성장 및 급속한 (p)ppGpp 이직률은 이 방법에 의해 정량적으로 평가될 수 있다.

서문

(p)ppGpp 제2 메신저는 리보솜 및 아미노산을 합성하기 위한 유전자를 포함하는 다수의 유전자의 발현을 조절하는 글로벌 레귤레이터1,2. 처음에 대장균3에서 발견되었지만 , (p)ppGpp는 식물 엽록체4,5뿐만아니라 그람 양성 및 그램 음성 박테리아 모두에서 발견 될 수 있습니다. 대장균 및 기타 그람 음성 박테리아의 경우,(p)ppGpp는 두 개의 서로다른 부위6,7,8에서RNA 폴리머라제와 직접 상호 작용합니다. 그람 양성에서, (p)ppGpp는 조절9,10으로이어지는 유전자 특이적 DNA 인식 모티프를 가진 GTP 결합 단백질인 CodY에 의해 감지되는 GTP 풍부를 억제한다. (p)ppGpp는 다른 영양소 및 스트레스 조건에 대한 기아에 대한 응답으로 축적되어, 스트레스11,12에적응할 수 있도록 유전자 발현의 느린 성장 및 조정을 초래한다.

축적된 ppGpp의 순량은 합성체와 하이드라아제 활동 사이의 균형을 반영한다. 대장균RelA는 강한 합성이고 SpoT는 강한 하이드로 라제와 약한 합성으로, 각각스트레스 의존적 방식으로 다르게 조절될 수 있는 이중기능성이다. 강한 RelA 합성은 단백질 합성의 요구를 따라가지 못할 때 리보소말 A 부위에 결합된 코돈 지정 충전 tRNA의 가용성이 활성화되는 경우13,14,15. 약한 SpoT (p)ppGpp 합성효소는 강한 (p)ppGpp 하이드로라제는 다른 스트레스 조건 및 다른 메커니즘에 반응하여 억제되는 동안 활성화된다. 몇몇 조건하에서, ACP 또는 Rsd와 같은 단백질은 또한 가수분해와 합성16,17사이 균형을 바꾸는 SpoT에 묶일 수 있습니다. 그람 양성에서, 합성 및 가수 분해는 강한 합성 및 가수 분해 활동뿐만 아니라 작은 하이드로 라제 및 / 또는 합성 12와 단일 RelASpoT 상동체 (RSH) 단백질 사이의 더 복잡한 균형을 반영한다.

(p)ppGpp 뉴클레오티드는 아미노산 기아에 의해 유도된 엄격한 반응 동안 얇은 층 크로마토그램(TLC)의 자가 방사성도에 나타난특이한 32P표지 반점으로 처음 발견되었다 3. 더 자세한 라벨링 프로토콜은 18. 여기서 설명된프로토콜(도 1)은 마이크로티터 플레이트상에서 다중 샘플의 성장을 모니터링할 수 있는 이러한 프로토콜의 수정이다. 이는 (p)ppGpp 풍부도 변화의 여러 생물학적 및 기술적 추정치를 용이하게 하고처음에 19의 디오틱 시프트연구를 위해 개발되었다. (p)ppGpp의 라벨링(p)ppGpp와 32P및 TLC에 의한 검출은 또한 (p)ppGpp 저하율의 측정을 허용한다. (p)ppGpp 수준을 결정하기 위한 대체 방법이 개발되었으며, 이러한 질량 분석법, HPLC20,형광 화학센서21,22,및 GFP 유전자 융합ppPp23에의해 영향을 받는 프로모터에대한, 24. 형광 화학 센서는 현재 ppGpp 를 바인딩 한 후 작은 스펙트럼 이동뿐만 아니라 ppGpp와 pppGpp21을구별하는 문제로 인해 제한된 사용이 있습니다. 이 방법은 시험관 내에서 (p)ppGpp를 검출하는 데 효율적이지만 세포 추출물에서는 검출하지 않는다. HPLC와 관련된 방법은20개 개선되었지만 고가의 장비가 필요하며 높은 스루풋에 잘 적응되지 않았습니다. 마지막으로, GFP 융합은 ppGpp 의존적 활성화 또는 억제의 추정치를 제공할 수 있지만, ppGpp 자체를 측정하지는 않는다. 이러한 대체 방법 각각은 가치가 있지만 값비싼 장비 나 실질적인 실습 시간이 필요하거나 여러 역학 샘플링 및 후속 처리를 수행할 수 없습니다. 여기에 설명된 방법을 통해 96개의 샘플을 약 20분(플레이트당 18개 샘플)에 6개의 TLC 플레이트에 적용할 수 있으며, TLC 개발에 의해 2시간 이내에 해결되며, 라벨링에 따라 몇 시간 또는 하룻밤 후에 얻은 정량적 데이터로 해결됩니다. 강도.

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프로토콜

1. 미디어 준비

  1. MOPS (3-(N-morpholino) 프로판설포닉산) 배지25,10x MOPS 염의 1/10 부피, 100x 미량 영양소 용액의 1/100 부피, 하룻밤 배양용 3 mM 나트륨 인산나트륨 또는 32P로 균일한 라벨링을 위한 0.2 mM 인산나트륨을 사용하십시오. 0.2% 포도당과 1 μg/mL 티아민 (비타민 B1). 필요한 경우 아미노산을 40 μg/mL로 첨가하십시오.
    1. MOPS 소금의 경우 400 mM MOPS, 40 mM 트리신, 0.1 mM FeSO4,95 mM NH4Cl, 2.6 mM K2SO 4, 5 μM CaCl2,10.56 mM MgCl2,500 mM NaCl을 사용하십시오. 강수량을 피하기 위해 작성된 순서대로 다른 구성 요소를 추가합니다. KOH로 pH 7.4로 조정하고 여과에 의해 살균하십시오.
    2. 100x 미량 영양소 용액의 경우3 μM (NH 4)6(MO7)24, 0.4 mM H3BO4,30 μM CoCl2,10 μM CuSO4,80 μM MnCl2및 10 μM ZnSO4를사용하십시오. 오토클레이브에 의한 살균.
    3. 포도당용 (20%) 및 나트륨 인산염 (300 mM) 용액은 오토 클레이브에 의해 별도의 100x 주식으로 살균합니다. 여과에 의해 티아민과 아미노산 혼합물의 100x 주식을 살균. 각 실험에 대한 멸균 스톡 솔루션에서 신선한 매체를 준비합니다.

2. 32P로라벨링

  1. MOPS 배지에서 3 mMM 인산나트륨으로 밤새 배양해 있습니다.
  2. 24 웰 플레이트에 0.2 mM 나트륨 인산염 담체를 함유한 MOPS 매체 550 μL과 각 세균 접종균의 30 μL을 첨가합니다 (희석 1/20). 이것은 OD600nm 0.1의 초기 접종을 생성할 것이다. 멸균 제어로 신선한 매체와 함께 잘 사용하십시오.
  3. 300 rpm에서 37°C에서 37°C에서 흔들리는 인큐베이터에 플레이트를 놓고 30분 동안 배양물을 가열하고 흔들림은 폭기를 제공한다. 기울어지거나 흘리지 않도록 테이프로 플레이트를 단단히 부착하십시오. 성장은 플레이트 리더를 사용하여 32P가 결여된 매체에서 병렬로 복제 플레이트로 모니터링하고 동일한 조건하에서 배양할 수 있다.
  4. 32P 정형 외과 인산염의 각 우물에 100 μCi를 추가하십시오 (5 mCi / mL 스톡에서 20 μL).
    참고: 방사능의 양은 또한 실험적인 필요를 충족시키기 위하여 조정될 수 있습니다. 0.2 mM 캐리어 인산염이 있는 낮은 기저 수준 100 μCi의 경우 잘 작동하지만 GTP 풀과 동등해질 것으로 예상되는 (p)ppGpp 수준을 측정하려면 라벨을 25 또는 50 μCi로 떨어뜨릴 수 있습니다. 담체 인산염을 0.2 mM 이하로 낮추는 것은 인산염 수치가 성장을 제한하는 것을 피하는 것이 좋습니다.
    주의: 32P는 β 방출 동위원소이므로 안전을 위해 지정된 적절한 차폐를 사용합니다. 모든 방사성 물질은 가능한 모든 예방 조치를 취하여 적절하게 폐기되어야 합니다.
  5. 1 -2 배 (1 시간 이상)에 대한 흔들리는 인큐베이터에서 성장하여 외부 라벨이 스트레스를 유발하기 전에 세포 내 뉴클레오티드 풀과 크게 균형을 이수할 수 있습니다.

3. 스트레스 또는 기아의 유도

  1. 신진 대사 경로 억제제 추가, 온도 변화, 필요한 영양소 소모, 삼투압 변화, 산화 스트레스 유도, 독소 추가 등과 같은 연구된 스트레스의 종류에 따라 선택한 방법으로 스트레스를 유도합니다.
    1. 예를 들어, 대장균 K-12 균주에서 이솔루신 기아를 유도하기 위해 100 μg/mL L-valine을 추가합니다. ppGpp의 증가 된 수준은 유도 5 분 후에 관찰됩니다.

4. 샘플링 및 ppGpp 추출

  1. 얼음 차가운 6 M Formic 산의 20 μL을 포함하는 0.2 mL PCR 튜브에 각 표지 된 세포 샘플의 20 μL을 추가합니다.
  2. 즉시 샘플을 드라이 아이스에 놓습니다.
  3. 동결 및 해동 3주기로 세포 추출 효율을 향상시킵니다.
  4. PEI 셀룰로오스 얇은 층 크로마토그램을 발견하기 직전에, 크로마토그램에서 이를 발견하지 않도록 펠릿 세포 파편에 최대 속도로 1 분 동안 원심 분리기 샘플을 채우십시오.

5. 얇은 층 크로마토그래피

  1. 부드러운 연필로, 가위로 위에서 5cm 를 제거 한 20cm x 20cm PEI-셀룰로오스 TLC 플레이트의 가장자리에서 원점 선을 표시합니다. 각 시료에 대해 PEI 표면에 5 μL을 액적으로 적용합니다. 이 지점이 마르지 않고 오름차순 개발을 시작하여 줄무늬를 최소화하여 해상도를 향상시킵니다.
  2. 액체가 원점 샘플 스팟에 닿지 않도록1.5 M KH2 PO4 (pH 3.4) 용액의 층을 가진 탱크에서 오름차순 개발을 수행하십시오. 탱크를 밀폐 된 밀봉으로 덮고 15cm의 트림 시트 상단으로 액체상승을 허용하십시오. 1.5 M KH2PO4 용액에 대한 pH 3.4를 달성하려면H3 PO4를첨가하여 pH를 조절할 필요가 있다.
  3. 완전히 개발된 크로마토그램을 제거하고 실온에서 공기 건조.
  4. 자유 32P를 함유하는 크로마토그램의 상부(pH 프런트) 부분을 방사성 폐기물로 자르고 버린다. 이 부분은 그림 2에서 노란색으로 표시되며 UV 광 하에서 쉽게 시각화됩니다. GTP보다 느리게 이동하는 (p)ppGpp 뉴클레오티드만 측정하는 경우 UV 가시 GTP 표준을 실행한 다음 더 큰 상부를 절단하고 폐기하는 것이 좋습니다(그림 2와같이 GTP 위의 모든 것).
  5. 인광체 스크린으로 밤새 자가 방사선 필름을 노출합니다.
  6. 필름을 개발합니다. 인광화체로 인광체 스크린 신호를 캡처하고 정량화합니다.

6. (p)ppGpp의 정량화

  1. 이미지 J26,27로방사성 반점 의 양을 정량화합니다.
    참고: (p)ppGpp의 양은 각 샘플에서 관찰되는 G 뉴클레오티드의총량으로 정규화될 수 있다(도 2). 배경의 양이 균일한 경우 배경에 대해 수정하기 위해 단일 공백(그림 2의 상자 4)을 뺄 수 있습니다. 총 G는 GTP + ppGpp + pppGpp 검출의 합계입니다. 이 정규화는 GMP와 GDP 수준이 무시할 수 있다고 가정합니다. 주어진 뉴클레오티드와 총 G의 비율은 적용된 샘플 체적의 변이를 교정하는 중요한 방법을 제공한다.

7. ppGpp 붕괴속도 측정

참고: 이 프로토콜을 수정하면 ppGpp 붕괴 율을 측정할 수 있습니다.

  1. ppGpp 축적을 허용하기에 충분한 시간 동안 스트레스 또는 기아를 유발한 후(단계 3), 지속적인 ppGpp 합성을 차단하기 위해 응력역전, 이는 가수분해 속도의 검출을 가능하게 한다. 반전 절차는 스트레스에 따라 달라집니다. 예를 들어, 200 μg/mL의 클로람페니콜을 추가하여 아미노산 결분의 경우를 반대로 합니다.
  2. 부패율은 일반적으로 빠르지만 다양할 수 있으므로 20-30s마다 최대 2분마다 샘플을 채취하십시오. 4 단계에서와 같이 샘플을 처리합니다.
  3. TLC가 개발되면 (5 단계에서와 같이) 시간 과정 동안 얻은 ppGpp의 수준, 반 로그 플롯 대 시간에 잔류 ppGpp 함량을 플롯하여 부패의 제로 오더 레이트의 시각화를 허용하고, 직선으로, ppGpp 반감기의 추정.

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결과

대장균 K-12 균주에서 발린을 첨가하면 isoleucine의 내인성 기아가 유발되어 5 분3후 ppGpp 수치가 증가합니다. ILV를 제외한 모든 아미노산을 함유하는 MOPS에서 성장한 세포는 도1에 도시된 바와 같이 32P로표지되었다. 일단 라벨이 붙으면, 10 mg/mL L-발린(100 μg/mL 최종 농도)의 6 μL이 첨가되어 이솔루신 기아를 일으킵니다. 샘플을 발린을 첨가?...

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토론

세포의 거의 균일 한 라벨링을 달성하는 것은이 프로토콜에 대한 중요한 단계입니다. 따라서 MOPS 또는 Tris 매체와 같은 정의된 매체의 사용은 담체 인산염 농도 및 특정 활성의 변이를 허용하는 데 매우 중요합니다. M9 또는 미디어 A와 같은 인산염 버퍼링 된 미디어는 사용할 수 없습니다. 대부분의 정의되지 않은 매체는 LB, 트립톤 및 카자미노산과 같은 가변적인 양의 인산염을 함유하고 있습니다...

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공개

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 말

이 연구는 교내 연구 프로그램, 유니스 케네디 슈리버 국립 아동 건강 및 인간 개발 연구소, NIH를 지원했다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
(NH4)6(MO7)24Fisher ScientificsA-674
Autoradiography filmDenville scientific inc.E3218
CaCl2J.T.Baker1-1309
ChloramphenicolRPIC61000-25.0
CoCl2Fisher ScientificsC-371
CuSO4J.T.Baker1843
FeSO4Fisher ScientificsI-146
Formic acidFisher BiotechBP1215-500
GlucoseMacron4912-12
H3BO4Macron2549-04
H3PO4J.T.Baker0260-02
K2SO4SigmaP9458-250G
KH2PO4Fisher BiotechBP362-500
L-ValineSigmaV-6504
MgCl2Fisher ScientificsFL-06-0303
Microplate reader Synergy HTBiotekSynergy HT
MnCl2SigmaM-9522
MOPSSigmaM1254-1KG
Na2HPO4Mallinckrodt7892
NaClJ.T.Baker3624-01
NaH2PO4Mallinckrodt7917
NH4ClSigmaA0171-500G
P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi)Perkin ElmerNEX053005MC
Storage phosphor screenKodakSo230
ThermomixerEppendorf5382000015
ThiamineSigmaT-4625
TLC PEI Cellulose FMerk-Millipore1.05579.0001
TricineRPIT2400-500.0
Typhoon 9400 imagerGE Healthcare
ZnSO4Fisher ScientificsZ-68

참고문헌

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