JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Рост радиомаркированных бактериальных культур в посудах микротитеров облегчает выборку с высокой пропускной мощностью, что позволяет многократно ерастить анализы изобилия нуклеотидов бассейнов, в том числе (p)ppGpp. Последствия переходов роста, вызванных источниками физиологического стресса, а также восстановление мгновения после стресса, могут контролироваться.

Аннотация

Нуклеотид (p)ppGpp функционирует как глобальный регулятор бактерий в ответ на различные физические и питательные стрессы. Он имеет быстрое начало, в секундах, что приводит к накоплению уровней, которые приближаются или превышают уровни пулов GTP. Стресс разворота случаях быстрого исчезновения (p)ppGpp, часто с периодом полураспада менее минуты. Наличие (p)ppGpp приводит к изменению экспрессии клеточных генов и метаболизма, которые противостоят разрушительным последствиям стресса. Грамотрицательные и грамположительные бактерии имеют различные механизмы реакции, но оба зависят от (p)ppGpp концентрации. В любом случае, существует необходимость одновременного мониторинга многих радиомаркированных бактериальных культур с интервалом во времени, которые могут варьироваться от 10 секунд до часов во время критических периодов перехода стресса. Этот протокол решает эту техническую проблему. Метод использует температуры и шейкер контролируемых микротитер овраник иинкубаторы, которые позволяют параллельный мониторинг роста (абсорбции) и быстрый отбор проб равномерно фосфат-радиоlabeled культур для решения и количественно нуклеотидных бассейнов хроматография на PEI-целлюлозе. Небольшие объемы выборки необходимы для нескольких технических и биологических повторов анализов. С помощью этого метода можно количественно оценить сложные переходы роста, такие как диотический рост и быстрые (p)ppGpp коэффициенты текучести кадров.

Введение

Второй посланник (p)ppGpp является глобальным регулятором, который модулирует экспрессию большого количества генов, включая гены для синтеза рибосом и аминокислот1,2. Хотя первоначально обнаружены в Escherichia coli3, (p)ppGpp можно найти в обоих Грам положительных и грам отрицательных бактерий, а также в растительных хлоропластов4,5. Для кишечной палочки и других грамотрицательных бактерий, (p)ppGpp взаимодействует непосредственнос РНК-полимераза на двух различных участках 6,7,8. В Gram срабатывает, (p)ppGpp ингибирует изобилие GTP, которое чувствуется CodY, GTP-связывающимпротеином с ген-специфическими мотивами распознавания ДНК которые водят к регулировке 9,10. (p)ppGpp накапливается в ответ на голод для различных питательных веществ и стрессовых условий, что приводит к медленному росту и корректировке экспрессии генов, чтобы адаптация к стрессу11,12.

Чистый объем накопленного ppGpp отражает баланс между синтезаза и гидролаза деятельности. В E. coli RelA является сильным синтезатором и SpoT является бифункциональным, с сильной гидролазы и слабой синтеза, каждый из которых может регулироваться по-разному в зависимости от стресса образом. Сильный синтезатор RelA активируется, когда наличие кодона-указанного заряженного tRNA связано с рибосомальным местом, когда он не в состоянии идти в ногу с требованиями синтеза белка13,14,15. Слабый SpoT (p)ppGpp синтезатаза активируется в то время как сильный (p)ppGpp гидролаза ингибируется в ответ на другие стрессовые условия и через другие механизмы. При некоторых условиях, белки, такие как ACP или Rsd может связываться с SpoT, которые также изменить баланс между гидролизом и синтезом16,17. В Gram срабатываний, синтез и гидролиз отражают более сложный баланс между одним relA SpoT омолог (RSH) белка с сильным синтезом и гидролизом деятельности, а также меньшие гидролазы и / или синтезаторы12.

(p)ppGpp нуклеотиды были впервые обнаружены как необычные 32 Pпомечены пятна, которые появились на авторадиограммы тонкослойных хроматограмм (TLC) во время строгой реакции индуцированной аминокислоты голодания3. Более подробные протоколы маркировки были рассмотрены 18. Описанный здесь протокол(рисунок1) является модификацией этих протоколов, которая позволяет контролировать рост нескольких образцов на микротитерных пластинах. Это облегчает несколько биологических и технических оценок (p)ppGpp изменения изобилия и был первоначально разработан для исследований диоксических сдвигов19. Маркировка (p)ppGpp с 32P и обнаружение TLC также позволяет измерения (p)ppGpp скорости деградации. Альтернативные методы были разработаны для определения (p)ppGpp уровней, таких как масс-спектрометрия, HPLC20, флуоресцентные химиосенсоры21,22, и GFP синтезгенов для промоутеров, пострадавших от ppGpp23, 24. Флуоресцентные химиосенсоры в настоящее время имеют ограниченное использование из-за небольших спектральных сдвигов после связывания ppGpp, а также проблемы, проводящие различие между ppGpp и pppGpp21. Этот метод эффективен для обнаружения (p)ppGpp in vitro, но не в клеточных экстрактах. Методы с участием HPLC были улучшены20, но требуют дорогостоящего оборудования и не хорошо адаптированы к высокой через-положить. Наконец, слияние GFP может дать оценку активации или торможения ppGpp, но не измерить ppGpp себя. Хотя каждый из этих альтернативных методов ценен, они требуют дорогостоящего оборудования или значительного практического времени, или в противном случае они не поддаются нескольким кинетической выборки и последующей обработки. С помощью описанного здесь метода 96 образцов могут быть применены к шести пластинам TLC примерно за 20 минут (18 образцов на тарелку), решенными за счет разработки TLC менее чем за пару часов, при этом количественные данные, полученные через несколько часов или за одну ночь, в зависимости от маркировки Интенсивность.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка средств массовой информации

  1. Для MOPS (3-(N-(N-morpholino)propanesulfonic кислоты) сми25, используйте 1/10 том 10x солей MOPS, 1/100 том 100x микроэлементов раствор, 3 mM фосфат натрия для ночных культур или 0.2 mM фосфат натрия для равномерной маркировки с 32 P, P, 3 mM фосфат натрия для ночных культур или 0.2 mM фосфат натрия для равномерной маркировки с 32P, P, P 0,2% глюкозы и 1 мкг/мл тиамина (витамин В1). При необходимости добавьте аминокислоты по 40 мкг/мл.
    1. Для солей MOPS, используйте 400 mM MOPS, 40 mM Tricine, 0.1 mM FeSO4,95 mM NH4Cl, 2.6 mM K2SO 4, 5 мкм CaCl2, 10.56 mM MgCl2, и 500 mM NaCl. Добавьте различные компоненты в заказ, написанный, чтобы избежать осадков. Отрегулируйте к pH 7.4 с KOH и стерилизовать фильтрацией.
    2. Для 100x микроэлементов раствор, используйте 3 мкм (NH4)6(MO7)24, 0,4 мМ H3BO4, 30 мкм CoCl2, 10 мкм CuSO4, 80 мкм MnCl2, и 10 мкм ЗнСО4. Стерилизовать с помощью автоклавирования.
    3. Для глюкозы (20%) и фосфат натрия (300 мМ) растворы, стерилизовать как отдельные 100x запасов путем автоклавирования. Стерилизовать 100x запасов тиамина и аминокислотных смесей путем фильтрации. Подготовьте свежие носители из стерильных стоковых решений для каждого эксперимента.

2. Маркировка с 32P

  1. Выращивайте ночные культуры в MOPS media с фосфатами натрия 3 мМ.
  2. В 24 хорошо пластины, добавить 550 л MOPS средств, содержащих 0,2 мМ фосфата натрия перевозчика и 30 л каждого бактериального инокулума (разбавление 1/20). Это позволит произвести начальный инокулумOD 600nm 0.1. Используйте один хорошо со свежими средствами массовой информации в качестве стерильности контроля.
  3. Поместите тарелку на встряхиваемый инкубатор при 37 градусах по Цельсию при 900 об/мин в течение 30 мин. Культуры нагреваются снизу и встряхивание обеспечивает аэрацию. Прикрепите пластину твердо с лентой, чтобы избежать наклона или разливов. Рост можно контролировать с помощью репликации пластины параллельно в средствах массовой информации не хватает 32P с помощью пластины читателя и инкубации в тех же условиях.
  4. Добавьте 100 кик к каждой скважине 32P ортофосфата (20 л из запаса 5 мКИ/мл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество радиоактивности также может быть скорректировано для удовлетворения экспериментальных потребностей. Для низких базальных уровней 100 зКС с 0,2 мМ фосфаты перевозчика хорошо работает, но для измерения (p)ppGpp уровней, которые, как ожидается, станет эквивалентом гТП бассейны, этикетка может быть снижена до 25 или 50 "Ci. Снижение фосфата носителя ниже 0,2 мМ не рекомендуется, чтобы избежать ограничения уровня фосфатов для роста.
    ВНИМАНИЕ: 32P является изотопом, излучающим, поэтому используйте надлежащий экранирование, указанное для безопасности. Все радиоактивные материалы должны быть надлежащим образом удалены с учетом всех возможных мер предосторожности.
  5. Расти в встряхивая инкубатор для 1 до 2 удвоений (1 ч или более), чтобы внешний ярлык в значительной степени уравновесить с внутриклеточнымну нуклеотидных бассейнов до индуцирования стресса.

3. Индукция стресса или голодания

  1. Индуцируйте стресс с помощью выбранного метода, в зависимости от вида изученного стресса, например, добавление ингибиторов метаболического пути, изменение температуры, изнурительные необходимые питательные вещества, смещение сдвигов осмоляритности, индуцирование окислительного стресса, добавление токсинов и т.д.
    1. Например, добавьте 100 мкг/мл L-валина, чтобы вызвать угное голодание в штаммах E. coli K-12. Повышенный уровень ppGpp будет наблюдаться после 5 минут индукции.

4. Отбор проб и ppGpp Добыча

  1. Добавьте 20 кЛ каждого маркированного образца клеток в трубку ПЦР 0,2 мл, содержащую 20 л ледяной 6 М Formic acid.
  2. Немедленно поместите образцы в сухой лед.
  3. Повысить эффективность клеточной экстракции на 3 цикла замораживания и оттаивания.
  4. Незадолго до пятнистости PEI целлюлозы тонкого слоя хроматограмм, центрифуги образцов в течение 1 мин на максимальной скорости, чтобы гранулы клеточного мусора, чтобы избежать пятнистости его на хроматограммах.

5. Тонкослойная хроматография

  1. Мягким карандашом отметьте линию происхождения на 1 см от края 20 см х 20 см пластины PEI-Cellulose TLC, которая с ножницами убрала 5 см сверху. Нанесите 5 л в качестве капли на поверхности PEI для каждого образца. Начните восходящее развитие, не позволяя этому месту высохнуть, что улучшает разрешение за счет минимизации полос.
  2. У восходящей развития в баке с слоем 1,5 M KH2PO4 (pH 3.4) раствор достаточно мелкий, так что жидкость не касается места образца происхождения. Накройте бак герметичной уплотнением и дайте жидкости поднимигнуть к верхней части обрезанного листа, 15 см. Для достижения pH 3.4 для 1,5 М KH2PO4 решения, необходимо настроить рН путем добавления H3PO4.
  3. Удалите полностью развитую хроматограмму и высушите воздух при комнатной температуре.
  4. Вырезать и отбросить верхнюю (pH переднюю) часть хроматограммы, содержащей свободные 32P в радиоактивные отходы. Эта часть представлена желтым цветом на рисунке 2 и легко визуализирована под ультрафиолетовым светом. При измерении только (p)ppGpp нуклеотидов, которые мигрируют медленнее, чем GTP, рекомендуется запустить УФ-видимый стандарт GTP, а затем вырезать и отбросить большую верхнюю часть (все выше GTP, как показано на рисунке 2).
  5. Выставляем авторадиографические пленки на ночь с фосфорным экраном.
  6. Разработайте фильм. Захват и количественная оценка сигнала фосфорного экрана с помощью фосфомаизера.

6. Количественная оценка (p)ppGpp

  1. Количественная радиоактивные пятна с изображением J26,27.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество (p)ppGpp может быть нормализовано до общего количества нуклеотидов G, наблюдаемых в каждом образце(рисунок2). Если количество фона однородное, можно вычесть один пробел (коробка 4 с рисунка 2) для коррекции фона. Всего G является сумма GTP ppGpp pppp ppppGpp обнаружены. Эта нормализация предполагает, что уровни GMP и ВВП незначительны, что верно для кишечной палочки. Отношение данного нуклеотида к общему G является важным способом коррекции вариаций прикладного объема образца.

7. Измерение скорости распада ppGpp

ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение этого протокола позволяет измерять скорость распада ppGpp.

  1. После провоцирования стресса или голодания в течение некоторого времени, достаточного для того, чтобы позволить накопление ppGpp (шаг 3), обратить вспять стресс, чтобы блокировать продолжающийся синтез ppGpp, который позволяет обнаруживать гидролитические скорости. Процедура разворота будет зависеть от стресса. Например, добавьте 200 мкг/мл хлорамфеникол, чтобы обратить вспять любое аминокислотное голодание.
  2. Скорость распада, как правило, быстро, но может варьироваться, поэтому брать пробы каждые 20-30 с до 2 мин. Процесс образцов, как в шаге 4.
  3. После того, как TLC разработан (как в шаге 5) и уровни ppGpp, полученные в течение курса времени, участок остаточного ppGpp содержание на полу-логарифмический участок против времени, чтобы визуализация нулевого порядка ставки распада, как прямая линия, и оценка ppGpp период полураспада.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В штаммах E. coli K-12 добавление валина провоцирует эндогенное голодание изолеуцина, что приводит к увеличению уровня ppGpp после 5 мин3. Клетки, выращенные в MOPS, содержащие все аминокислоты, за исключением ILV были помечены 32P, как указано на рисунке 1. ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Достижение почти единообразной маркировки ячеек является критическим шагом для этого протокола. Таким образом, использование определенных носителей, таких как MOPS или Tris media, имеет решающее значение для обеспечения изменения концентрации переносчиков фосфатов и конкретной активности...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано Intramural исследовательской программы, Eunice Кеннеди Шрайвер Национальный институт здоровья детей и развития человека, NIH.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
(NH4)6(MO7)24Fisher ScientificsA-674
Autoradiography filmDenville scientific inc.E3218
CaCl2J.T.Baker1-1309
ChloramphenicolRPIC61000-25.0
CoCl2Fisher ScientificsC-371
CuSO4J.T.Baker1843
FeSO4Fisher ScientificsI-146
Formic acidFisher BiotechBP1215-500
GlucoseMacron4912-12
H3BO4Macron2549-04
H3PO4J.T.Baker0260-02
K2SO4SigmaP9458-250G
KH2PO4Fisher BiotechBP362-500
L-ValineSigmaV-6504
MgCl2Fisher ScientificsFL-06-0303
Microplate reader Synergy HTBiotekSynergy HT
MnCl2SigmaM-9522
MOPSSigmaM1254-1KG
Na2HPO4Mallinckrodt7892
NaClJ.T.Baker3624-01
NaH2PO4Mallinckrodt7917
NH4ClSigmaA0171-500G
P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi)Perkin ElmerNEX053005MC
Storage phosphor screenKodakSo230
ThermomixerEppendorf5382000015
ThiamineSigmaT-4625
TLC PEI Cellulose FMerk-Millipore1.05579.0001
TricineRPIT2400-500.0
Typhoon 9400 imagerGE Healthcare
ZnSO4Fisher ScientificsZ-68

Ссылки

  1. Cashel, M., Gentry, D., Hernandez, V., Vinella, D. The stringent Response. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. , 1458-1489 (1996).
  2. Magnusson, L. U., Farewell, A., Nyström, T. ppGpp: a global regulator in Escherichia coli. Trends in Microbiology. 13 (5), 236-242 (2005).
  3. Cashel, M., Gallant, J. Two Compounds implicated in the Function of the RC Gene of Escherichia coli. Nature. 221 (5183), 838-841 (1969).
  4. Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).
  5. Atkinson, G. C., Tenson, T., Hauryliuk, V. The RelA/SpoT homolog (RSH) superfamily: distribution and functional evolution of ppGpp synthetases and hydrolases across the tree of life. PloS One. 6 (8), e23479(2011).
  6. Mechold, U., Potrykus, K., Murphy, H., Murakami, K. S., Cashel, M. Differential regulation by ppGpp versus pppGpp in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 41 (12), 6175-6189 (2013).
  7. Molodtsov, V., et al. Allosteric Effector ppGpp Potentiates the Inhibition of Transcript Initiation by DksA. Molecular Cell. 69 (5), 828-839 (2018).
  8. Ross, W., Sanchez-Vazquez, P., Chen, A. Y. Y., Lee, J. -H. H., Burgos, H. L. L., Gourse, R. L. L. ppGpp Binding to a Site at the RNAP-DksA Interface Accounts for Its Dramatic Effects on Transcription Initiation during the Stringent Response. Molecular Cell. 62 (6), 811-823 (2016).
  9. Kriel, A., et al. Direct Regulation of GTP Homeostasis by (p)ppGpp: A Critical Component of Viability and Stress Resistance. Molecular Cell. 48 (2), 231-241 (2012).
  10. Kriel, A., et al. GTP dysregulation in Bacillus subtilis cells lacking (p)ppGpp results in phenotypic amino acid auxotrophy and failure to adapt to nutrient downshift and regulate biosynthesis genes. Journal of Bacteriology. 196 (1), 189-201 (2014).
  11. Potrykus, K., Cashel, M. p)ppGpp: still magical. Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).
  12. Hauryliuk, V., Atkinson, G. C., Murakami, K. S., Tenson, T., Gerdes, K. Recent functional insights into the role of (p)ppGpp in bacterial physiology. Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 298-309 (2015).
  13. Arenz, S., et al. The stringent factor RelA adopts an open conformation on the ribosome to stimulate ppGpp synthesis. Nucleic Acids Research. 44 (13), 6471-6481 (2016).
  14. Loveland, A. B., et al. Ribosome•RelA structures reveal the mechanism of stringent response activation. eLife. 5, e17029(2016).
  15. Brown, A., Fernández, I. S., Gordiyenko, Y., Ramakrishnan, V. Ribosome-dependent activation of stringent control. Nature. 534 (7606), 277-280 (2016).
  16. Battesti, A., Bouveret, E. Acyl carrier protein/SpoT interaction, the switch linking SpoT-dependent stress response to fatty acid metabolism. Molecular Microbiology. 62 (4), 1048-1063 (2006).
  17. Lee, J. -W., Park, Y. -H., Seok, Y. -J. Rsd balances (p)ppGpp level by stimulating the hydrolase activity of SpoT during carbon source downshift in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), E6845-E6854 (2018).
  18. Cashel, M. Detection of (p)ppGpp Accumulation Patterns in Escherichia coli mutants. Molecular Microbiology Techniques. 3, 341-356 (1994).
  19. Fernández-Coll, L., Cashel, M. Contributions of SpoT Hydrolase, SpoT Synthetase, and RelA Synthetase to Carbon Source Diauxic Growth Transitions in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. , (2018).
  20. Varik, V., Oliveira, S. R. A., Hauryliuk, V., Tenson, T. HPLC-based quantification of bacterial housekeeping nucleotides and alarmone messengers ppGpp and pppGpp. Scientific Reports. 7 (1), 11022(2017).
  21. Rhee, H. -W., et al. Selective Fluorescent Chemosensor for the Bacterial Alarmone (p)ppGpp. J. Am. Chem. Soc. 130 (3), 784-785 (2008).
  22. Wang, J., Chen, W., Liu, X., Wesdemiotis, C., Pang, Y. A Mononuclear Zinc Complex for Selective Detection of Diphosphate via Fluorescence ESIPT Turn-On. Journal of Materials Chemistry B. 2 (21), 3349-3354 (2014).
  23. Pokhilko, A. Monitoring of nutrient limitation in growing E. coli: a mathematical model of a ppGpp-based biosensor. BMC Systems Biology. 11 (1), 106(2017).
  24. Funabashi, H., Mie, M., Yanagida, Y., Kobatake, E., Aizawa, M. Fluorescent monitoring of cellular physiological status depending on the accumulation of ppGpp. Biotechnology Letters. 24 (4), 269-273 (2002).
  25. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  27. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  28. Peselis, A., Serganov, A. ykkC riboswitches employ an add-on helix to adjust specificity for polyanionic ligands. Nature Chemical Biology. 14 (9), 887-894 (2018).
  29. Oki, T., Yoshimoto, A., Sato, S., Takamatsu, A. Purine nucleotide pyrophosphotransferase from Streptomyces morookaensis, capable of synthesizing pppApp and pppGpp. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 410 (2), 262-272 (1975).
  30. Travers, A. A. ppApp alters transcriptional selectivity of Escherichia coli RNA polymerase. FEBS Letters. 94 (2), 345-348 (1978).
  31. Bruhn-Olszewska, B., et al. Structure-function comparisons of (p)ppApp vs (p)ppGpp for Escherichia coli RNA polymerase binding sites and for rrnB P1 promoter regulatory responses in vitro. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1861 (8), 731-742 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

148p ppGpp32PEscherichia coli

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены