Utilizzo della radioetichettatura microtiter Piatto per le misurazioni multiple In Vivo di Escherichia coli (p)ppGpp seguito dalla cromatografia a strati sottile

Riepilogo

La crescita di colture batteriche radioetichettate nei piatti microtiteri facilita il campionamento ad alta produttività che consente molteplici analisi tecniche e biologiche di abbondanza di piscine nucleotidiche, tra cui quella di (p)ppGpp. Gli effetti delle transizioni di crescita provocati da fonti di stress fisiologico e di recupero dallo stress possono essere monitorati.

Abstract

Il nucleotide (p)ppGpp funziona come regolatore globale nei batteri in risposta a una varietà di stress fisico e nutrizionale. Ha un rapido insorgenza, in secondi, che porta ad accumulo di livelli che si avvicinano o superano quelli dei pool GTP. L'inversione dello stress è una rapida scomparsa di (p)ppGpp, spesso con un'emivita di meno di un minuto. La presenza di (p)ppGpp provoca alterazioni dell'espressione genica cellulare e del metabolismo che contrastano gli effetti dannosi dello stress. I batteri Gram-negativi e Gram-positivi hanno meccanismi di risposta diversi, ma entrambi dipendono dalla concentrazione (p)ppGpp. In ogni caso, è necessario monitorare contemporaneamente molte colture batteriche radioetichettate a intervalli di tempo che possono variare da 10 secondi a ore durante i periodi di transizione allo stress critico. Questo protocollo affronta questa sfida tecnica. Il metodo si avvale di incubatori di microtitori a temperatura e a scossore che consentono un monitoraggio parallelo della crescita (assorbimento) e di un rapido campionamento di colture uniformemente radioetichettate con fosfato per risolvere e quantitare le pool di nucleotidi cromatografia a strato sottile sulla cellulosa PEI. Piccole quantità di campione sono necessarie per molteplici repliche tecniche e biologiche delle analisi. Con questo metodo è possibile valutare quantitativamente transizioni complesse di crescita, come la crescita diaustica e i tassi di rotazione rapidi (p)ppGpp.

Introduzione

Il secondo messaggero (p)ppGpp è un regolatore globale che modula l'espressione di un gran numero di geni, compresi i geni per sintetizzare ribosomi e amminoacidi^1,2. Anche se inizialmente scoperto in Escherichia coli³, (p)ppGpp può essere trovato sia nei batteri Gram positivi e Gram negativi, così come nelle cloroplasti vegetali^4,5. Per E. coli e altri batteri Gram-negativi, (p)ppGpp interagisce direttamente con la polimerasi dell'RNA in due siti diversi^6,7,8. In Gram positivi, (p)ppGpp inibisce l'abbondanza GTP, che viene percepita da CodY, una proteina legante GTP con motivi di riconoscimento del DNA gene-specifici che portano al regolamento^9,10. (p)ppGpp si accumula in risposta alla fame di diversi nutrienti e condizioni di stress, con conseguente crescita lenta e aggiustamenti dell'espressione genica per consentire l'adattamento allo stress^11,12.

La quantità netta di ppGpp accumulata riflette un equilibrio tra le attività di sintetasi e idrolasi. In E. coli RelA è una forte sintetasi e SpoT è bifunzionale, con una forte idrolasi e una sintetasi debole, ognuna delle quali potrebbe essere regolata in modo diverso in modo dipendente dallo stress. La forte sintetasi RelA si attiva quando la disponibilità di tRNA carico carica specificato codone legato al sito ribosomal A quando non riesce a tenere il passo con le esigenze di sintesi proteica^13,14,15. La debole sintetasi SpoT (p)ppGpp viene attivata mentre l'idrolasi forte (p)ppGpp è inibita in risposta ad altre condizioni di stress e attraverso altri meccanismi. In alcune condizioni, proteine come ACP o Rsd possono legarsi a SpoT, che cambia anche l'equilibrio tra idrolisi e sintesi^16,17. Nei positivi Gram, sintesi e idrolisi riflettono un equilibrio più complesso tra una singola proteina relA SpoT (RSH) con forti attività di sintesi e idrolisi, nonché idrolasi e/o sintetasi più piccole¹².

I nucleotidi (p)ppGpp sono stati scoperti per la prima volta come insoliti punti etichettati ^{da 32}P che sono apparsi sugli autoradiogrammi dei cromotrigrammi a strato sottile (TLC) durante una risposta rigorosa indotta dalla fame di amminoacido³. Sono stati esaminati protocolli di etichettatura più dettagliati ¹⁸. Il protocollo descritto qui (Figura 1) è una modifica di questi protocolli che consente di monitorare la crescita di più campioni su piastre di microtiteri. Questo facilita molteplici stime biologiche e tecniche dei cambiamenti di abbondanza (p)ppGpp ed è stato inizialmente sviluppato per studi sui cambiamenti diauxici¹⁹. L'etichettatura di (p)ppGpp con ³²P e rilevamento da parte di TLC consente anche misurazioni dei tassi di degradazione (p)ppGpp. Sono stati sviluppati metodi alternativi per determinare i livelli (p)ppGpp come la spettrometria di massa, HPLC²⁰, chemiosensori fluorescenti^21,22e le fusioni geniali GFP per i promotori affetti da ppGpp^{23, 24}. I chemiosensori fluorescenti hanno attualmente un uso limitato a causa di piccoli spostamenti spettrali dopo il legame ppGpp così come problemi che distinguono tra ppGpp e pppGpp²¹. Questo metodo è efficace per rilevare (p)ppGpp in vitro, ma non in estratti cellulari. I metodi che coinvolgono HPLC sono stati migliorati^{a 20} ma richiedono attrezzature costose e non sono ben adattati all'elevata velocità. Infine, le fusioni GFP possono fornire una stima dell'attivazione o dell'inibizione dipendente da ppGpp, ma non misurano la ppGpp stessa. Sebbene ciascuno di questi metodi alternativi sia prezioso, richiedono attrezzature costose o tempi di pratica sostanziali oppure non sono suscettibili di campionamento cinetico multiplo e di successiva elaborazione. Con il metodo qui descritto, 96 campioni possono essere applicati a sei piastre TLC in circa 20 min (18 campioni per piastra), risolti dallo sviluppo di TLC in meno di un paio d'ore, con dati quantitativi ottenuti dopo diverse ore o durante la notte, a seconda dell'etichettatura intensità.

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Protocollo

1. Preparazione dei supporti

1. Per moPS (3-(N-morpholino)propanesulfonic acid) media²⁵, utilizzare 1/10 volume di sali 10x MOPS, 1/100 volume di soluzione 100x micronutrienti, 3 mM fosfato di sodio per colture notturne o 0,2 mM di fosfato di sodio per un'etichettatura uniforme con ³²P, 0,2% di glucosio e 1 g/mL di tiano (vitamina B1). Se necessario, aggiungere gli amminoacidi a 40 g/mL.
   1. Per i salti MOPS, utilizzare 400 mM MOPS, 40 mM Tricine, 0,1 mM FeSO₄, 95 mM NH₄Cl, 2,6 mM K₂SO₄, 5 CaCl₂, 10,56 mM MgCl₂e 500 mM NaCl. Aggiungere i diversi componenti nell'ordine scritto per evitare precipitazioni. Regolare a pH 7.4 con KOH e sterilizzare per filtrazione.
   2. Per la soluzione di micronutrienti 100x, utilizzare 3 M (NH₄)₆(MO₇)₂₄, 0,4 mM H₃BO₄, 30 M CoCl₂, 10 CuSO₄, 80M MnCl₂, e 10 M nSO₄. Sterilizzare autoclaving.
   3. Per il glucosio (20%) e soluzioni di fosfato di sodio (300 mM), sterilizzare come scorte 100x separate autoclaving. Sterilizzare 100 volte le scorte di tiamina e miscele di amminoacidi per filtrazione. Preparare supporti freschi da soluzioni sterili per ogni esperimento.

2. Etichettatura con ³²P

1. Coltiva le colture notturne con i media MOPS con 3 mM di fosfato di sodio.
2. In una piastra di 24 pozzetti, aggiungere 550 - L di molo DI MOPS contenente 0,2 mM di portafosato di sodio e 30 di ogni inoculum batterico (diluizione 1/20). Questo produrrà un inoculum iniziale di OD_600nm 0.1. Utilizzare un pozzo con supporti freschi come controllo di sterilità.
3. Posizionare la piastra su un'incubatrice agitazione a 37 gradi centigradi tremando a 900 giri/mm per 30 min. Fissare saldamente la piastra con del nastro adesivo per evitare inclinazioni o fuoriuscite. La crescita può essere monitorata con una piastra replicante in parallelo su supporti privi ^{di 32}P utilizzando un lettore di lastre e incubando si incubano nelle stesse condizioni.
4. Aggiungete 100 Ci ad ogni pozzetto da ³²P orthophosphate (20 -L da un'azione di 5 mCi/mL).
   NOT: La quantità di radioattività può anche essere regolata per soddisfare le esigenze sperimentali. Per i bassi livelli basali 100 -Ci con 0,2 mM di fosfato portante funziona bene, ma per misurare i livelli (p)ppGpp che dovrebbero diventare equivalenti a piscine GTP, etichetta può essere sceso a 25 o 50 Ci. Abbassare il fosfato portante al di sotto di 0,2 mM non è raccomandato per evitare che i livelli di fosfato diventino limitanti per la crescita.
   AGGIORNAMENTO: ³²P è un isotopo che emette, quindi usa una schermatura adeguata specificata per la sicurezza. Tutto il materiale radioattivo deve essere smaltito correttamente prendendo tutte le precauzioni possibili.
5. Coltivare in incubatrice acquosa per 1 o 2 raddoppi (1 h o più) per consentire all'etichetta esterna di eclarare in gran parte con pool di nucleotidi intracellulari prima di indurre lo stress.

3. Induzione di stress o di fame

1. Indurre lo stress utilizzando un metodo di vostra scelta, a seconda del tipo di stress studiato, ad esempio l'aggiunta di inibitori della via metabolica, cambiamento della temperatura, estenuante nutrienti necessari, spostamento di spostamento degli spostamenti di osmolarità, indurre stress ossidativo, aggiunta di tossine, ecc.
   1. Ad esempio, aggiungere 100 g/mL L-valine per indurre la fame di isoleoucina nei ceppi di E. coli K-12. I livelli aumentati di ppGpp saranno osservati dopo 5 minuti di induzione.

4. Campionamento e estrazione ppGpp

1. Aggiungere 20 l di ogni campione di cellule etichettate a un tubo PCR da 0,2 mL contenente 20 -L di ghiaccio freddo 6 M di acido formicico.
2. Mettere immediatamente i campioni nel ghiaccio secco.
3. Migliora l'efficienza dell'estrazione cellulare di 3 cicli di congelamento e scongelamento.
4. Poco prima di avvistare i cromatogrammi a strato sottile di cellulosa PEI, centrifugare campioni per 1 min alla massima velocità per pellet detriti cellulari per evitare di avvistarlo su cromatogrammi.

5. Cromatografia a strato sottile

1. Con una matita morbida, segnare una linea di origine a 1 cm dal bordo della piastra PEI-Cellulose TLC da 20 cm x 20 cm che ha avuto 5 cm di rimozione dalla parte superiore con le forbici. Applicare 5 -L come goccia nella superficie PEI per ogni campione. Iniziare lo sviluppo ascendente senza lasciare che questo punto si asciughi, migliorando la risoluzione riducendo al minimo le striature.
2. Fai lo sviluppo ascendente in un serbatoio con uno strato di 1,5 M KH₂PO₄ (pH 3.4) soluzione abbastanza superficiale in modo che il liquido non tocchi il punto campione di origine. Coprire il serbatoio con una guarnire a tenuta d'aria e lasciare che la salita liquida alla parte superiore del foglio tagliato, 15 cm. Per ottenere il pH 3.4 per una soluzione da 1,5 M KH₂PO_4, è necessario regolare il pH aggiungendo H₃PO₄.
3. Rimuovere lo cromatogramma completamente sviluppato e l'aria si asciugano a temperatura ambiente.
4. Tagliare e scartare la parte superiore (pH anteriore) del cromatogramma contenente il ^{libero 32}P in scorie radioattive. Questa porzione è rappresentata in colore giallo nella Figura 2 e facilmente visualizzabile sotto la luce UV. Se si misurano solo i nucleotidi (p)ppGpp che migrano più lentamente di GTP, si consiglia di eseguire uno standard GTP visibile ai raggi UV e quindi tagliare e scartare una porzione superiore più grande (qualsiasi elemento sopra GTP, come mostrato nella Figura 2).
5. Esponi le pellicole radiografiche durante la notte con uno schermo di fosforo.
6. Sviluppare il film. Catturare e quantificare il segnale dello schermo del fosforo con un fosforo.

6. Quantitazione di (p)ppGpp

1. Quantitate spot radioattivi con l'immagine J^26,27.
   NOT: La quantità di (p)ppGpp può essere normalizzata alla quantità totale di nucleotidi G osservati in ogni campione (Figura 2). Se la quantità di sfondo è omogenea, è possibile sottrarre un singolo spazio vuoto (casella 4 della Figura 2) per correggere lo sfondo. Total G è la somma di GTP - ppGpp - pppGpp rilevato. Questa normalizzazione presuppone che i livelli di GMP e PIL siano trascurabili, il che è vero per E. coli. Il rapporto tra un determinato nucleotide e G totale fornisce un modo importante per correggere le variazioni del volume del campione applicato.

7. Misurazione del tasso di decadimento ppGpp

NOT: Una modifica di questo protocollo consente misurazioni dei tassi di decadimento ppGpp.

1. Dopo aver provocato stress o fame per un tempo sufficiente a consentire l'accumulo di ppGpp (passaggio 3), invertire lo stress per bloccare la sintesi continua del ppGpp, che consente il rilevamento dei tassi idrolitici. La procedura di inversione dipenderà dallo stress. Ad esempio, aggiungere 200 g/mL di cloramfenicolo per invertire qualsiasi amminoacido di fame.
2. I tassi di decadimento sono di solito rapidi, ma possono variare, quindi preleva campioni ogni 20-30 s fino a 2 min.
3. Una volta che il TLC è sviluppato (come nel passaggio 5) e i livelli di ppGpp ottenuti durante il corso temporale, tracciare il contenuto di ppGpp residuo su una trama semi-logaritmica vs tempo per consentire la visualizzazione di zero tassi di decadimento di ordine, come una linea retta, e stima dell'emivita ppGpp.

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Risultati

Nei ceppi E. coli K-12, l'aggiunta di valina provoca una fame endogena di isoleucina, che si traduce in un aumento dei livelli di ppGpp dopo 5 min³. Le cellule coltivate in MOPS contenenti tutti gli aminoacidi ad eccezione di ILV sono state etichettate con ³²P come indicato nella Figura 1. Una volta etichettato, sono stati aggiunti 6 L di 10 mg/mL L-valine (100 g/mL di concentrazione finale) per produrre la fame di isole. I campioni sono sta...

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Discussione

Raggiungere un'etichettatura quasi uniforme delle cellule è un passo fondamentale per questo protocollo. Pertanto, l'uso di supporti definiti, come i supporti MOPS o Tris, è fondamentale per consentire la variazione delle concentrazioni di fosfato del vettore e dell'attività specifica. Non è possibile utilizzare supporti memorizzati nel buffer del fosfato, ad esempio M9 o A. La maggior parte dei supporti indefiniti contiene quantità variabili di fosfato, come LB, tryptone e acidi casamino. L'isotopo fosfato ^33<...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
(NH4)6(MO7)24	Fisher Scientifics	A-674
Autoradiography film	Denville scientific inc.	E3218
CaCl2	J.T.Baker	1-1309
Chloramphenicol	RPI	C61000-25.0
CoCl2	Fisher Scientifics	C-371
CuSO4	J.T.Baker	1843
FeSO4	Fisher Scientifics	I-146
Formic acid	Fisher Biotech	BP1215-500
Glucose	Macron	4912-12
H3BO4	Macron	2549-04
H3PO4	J.T.Baker	0260-02
K2SO4	Sigma	P9458-250G
KH2PO4	Fisher Biotech	BP362-500
L-Valine	Sigma	V-6504
MgCl2	Fisher Scientifics	FL-06-0303
Microplate reader Synergy HT	Biotek	Synergy HT
MnCl2	Sigma	M-9522
MOPS	Sigma	M1254-1KG
Na2HPO4	Mallinckrodt	7892
NaCl	J.T.Baker	3624-01
NaH2PO4	Mallinckrodt	7917
NH4Cl	Sigma	A0171-500G
P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi)	Perkin Elmer	NEX053005MC
Storage phosphor screen	Kodak	So230
Thermomixer	Eppendorf	5382000015
Thiamine	Sigma	T-4625
TLC PEI Cellulose F	Merk-Millipore	1.05579.0001
Tricine	RPI	T2400-500.0
Typhoon 9400 imager	GE Healthcare
ZnSO4	Fisher Scientifics	Z-68