Purkinje Zell Überleben in organotypischen Zerebellar Slice Kulturen

Zusammenfassung

Organotypische Scheibenkulturen sind ein leistungsfähiges Werkzeug, um neuroentwicklungsfördernde oder degenerative/regenerative Prozesse zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das den neuroentwicklungsbedingten Tod von Purkinje-Zellen in Maus-Kleinhirn-Scheibenkulturen modelliert. Diese Methode kann die Forschung in neuroprotektive Arzneimittel Entdeckung profitieren.

Zusammenfassung

Organotypische Scheibenkultur ist ein leistungsfähiges In-vitro-Modell, das in vivo Bedingungen näher imitiert als dissoziierte primäre Zellkulturen. In der frühen postnatalen Entwicklung, Kleinhirn Purkinje Zellen sind dafür bekannt, durch eine anfällige Periode zu gehen, in der sie programmierten Zelltod. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um in dieser kritischen Zeit eine organotypische Kleinhirn-Slice-Kultur der Maus durchzuführen. Die Scheiben werden weiter gekennzeichnet, um das Überleben der Purkinje-Zellunde und die Wirksamkeit neuroprotektive Behandlungen zu bewerten. Diese Methode kann extrem wertvoll sein, um auf neue neuroaktive Moleküle zu überprüfen.

Einleitung

In-vitro-Modellierung ist ein wesentliches Werkzeug in der biomedizinischen Forschung. Es ermöglicht den Forschern, spezifische Mechanismen in eingeschränkten Zelltypen oder in isolierten Systemen/Organen zu untersuchen und streng zu kontrollieren. Organotypische Scheibenkultur ist eine weit verbreitete In-vitro-Technik, vor allem im Bereich der Neurowissenschaften¹. Die Methode wurde zuerst von Gähwiler etabliert, der Gehirnscheiben mit der Rollenrohrtechnik²kultivierte, und später modifiziert von Yamamoto et al., der die Verwendung einer mikroporösen Membran einführte, um kortikale Scheibenkulturen durchzuführen³. Im Vergleich zu primären Zellkulturen bieten organotypische Scheibenkulturen den Vorteil, die Zytoarchitektur des Gewebes sowie einheimische Zell-Zell-Verbindungen in der Ebene des Gewebeabschnitts zu erhalten.

Organotypische Scheiben wurden aus vielen Teilen des zentralen Nervensystems kultiviert, wie der Hippocampus⁴, Cortex⁵, Striatum⁶, Kleinhirn^4,7, und Rückenmark^8,9, unter anderem. Sie haben sich als ein leistungsfähiges Werkzeug in Drogen-Entdeckungsstudien¹⁰. Die Auswirkungen neuroaktiver Moleküle können auf vielfältige Weise bewertet werden: Überleben und Neurodegeneration mit Immunostaining- und Biochemie-Assays, neuronale Schaltungsbildung oder Unterbrechung enthoben mit Elektrophysiologie und Live-Imaging.

Das Ziel dieser Arbeit ist es, eine einfache Methode zu beschreiben, um organotypische Kleinhirn-Scheibenkultur durchzuführen, die bekanntermaßen ein relevantes Modell ist, um die Entwicklung von Kleinhirn in vitro nachzuahmen. Insbesondere konzentrierten wir uns auf die Untersuchung des Purkinje-Zellentwicklungstodes. In vivo, Purkinje-Zellen unterziehen Apoptose während der ersten postnatalen Woche, Höhepunkt am postnatalen Tag 3 (P3)¹¹. Das gleiche Muster wird in der Kleinhirnscheibenkultur beobachtet, wobei Purkinje-Neuronen durch Apoptose sterben, wenn Kleinhirn von Tieren zwischen P1 und P8 genommen wird, mit einem Spitzenwert bei P3^4,12. Die Verwendung der organotypischen Kleinhirnscheibenkulturen hat es ermöglicht, mehrere neuroprotektive Moleküle^7,13, sowie das Verständnis eines Teils der Mechanismen, die an diesem programmierten Zelltod beteiligt sind, zu identifizieren^14,15,16. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das auf der Untersuchung von Stoppini et al.¹⁷ im Hippocampus basiert und von Dusart et al. an Kleinhirn angepasst wurde.⁴ Es beinhaltet eine schnelle Zerlegung und Zerkleinerung der postnatalen Kleinhirn; Kultur auf einen Zellkultureinsatz schneiden, der eine mikroporöse Membran mit oder ohne neuroprotektive Behandlung enthält; und Immunfluoreszenzfärbung zur Beurteilung des neuronalen Überlebens.

Protokoll

Alle Versuche mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit dem Northwestern University Animal Studies Committee durchgeführt.

1. Zubereitung vor organotypischen Kleinhirnscheibenkulturen

1. In einer Zellkulturhaube, die vorher mit 70% Ethanol besprüht wurde, 200 ml Kulturmedium in einem 250 ml Flaschen-Top-Vakuumfilter vorbereiten, der an einem sterilen Flaschenempfänger befestigt ist. Fügen Sie 100 ml Basal Medium Eagle (BME), 50 ml Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), 50 ml hitzeinaktiviertes Pferdeserum, 1 ml 200 ml L-Glutamin (Endkonzentration 1 mM) und 5 ml 200 g/l Glukose (Endkonzentration 5 mg/ml) hinzu. Vakuumfiltern Sie das Kulturmedium und halten Sie es bis zu einem Monat bei +4 °C.
2. Nehmen Sie im sterilisierten Biosicherheitsschrank eine 6-Well-Kulturplatte aus der Verpackung heraus. Füllen Sie jeden gut mit 1 ml Kulturmedium. Wenn eine Behandlung getestet wird, fügen Sie das pharmakologische Mittel in den behandelten Brunnen und das gleiche Volumen der Fahrzeuglösung für den Kontrollbrunnen hinzu. In der vorliegenden Studie haben wir dem behandelten Brunnen (30 mM Endwasser) und 1 l sterilem Wasser 1 l sterile 3 M KCl-Lösung zu den Kontrollbrunnen hinzugefügt.
3. Bringen Sie die benötigte Anzahl individuell umwickelter Zellkultureinsätze mit hydrophiler Polytetrafluorethylen (PTFE)-Membran (Porengröße = 0,4 m) in die Zellkulturhaube. Sie vorsichtig auspacken und die Zellkultureinsätze mit steriler Zange herausnehmen. Lassen Sie sie eins nach dem anderen in einem Brunnen einer 6-Well-Platte fallen, wodurch Blasen an der Schnittstelle zwischen der Insert-Membran und dem Zellkulturmedium vermieden werden. Lassen Sie die Einsätze im Medium in einem 37 °C, 5%_{CO2-Inkubator} für mindestens 2 h vor der Kultur ausdemieren.
   HINWEIS: Der Gewebechopper befindet sich dauerhaft in der Zellkulturhaube.
4. Bereiten Sie zwei 200 ml Becher vor, von dem einer mit 150 ml sterilem Wasser und der andere mit 150 ml 70% Ethanol gefüllt ist. Tauchen Sie die chirurgischen Werkzeuge in das 70% Ethanol-Bad und dann in Wasser, bevor Sie sie verwenden.
   HINWEIS: Verwenden Sie keine chirurgischen Werkzeuge unmittelbar nach dem Kontakt mit Ethanol.
5. Desinfizieren Sie die zweischneidige Klinge im 70% EthanolBecher. Legen Sie ihn mit sterilen Zangen auf den Klingenhalter und halten Sie ihn mit dem Klingenklemmenschlüssel ein. Lassen Sie es trocknen, bis es verwendet wird.
6. Desinfizieren Sie die mit dem Tissue-Chopper im 70% Ethanolbecher gelieferte Kunststoffscheibe. Sprühen Sie den Schneidtisch mit 70% Ethanol, bevor Sie die Scheibe darauf legen. Trocknen lassen, bis es verwendet wird.

2. Dissektion und Zerebellar Organotypische Scheibenkulturen

1. Bringen Sie den Mauswelpen in die Zellkulturhaube, um die Sezierung durchzuführen.
2. Enthaupten Sie den Welpen schnell mit geraden Bedienscheren (Abbildung 1A).
3. Während Sie den Kopf des Welpen an der Nase mit geraden Ankleidezangen halten, schneiden Sie die Kopfhaut mit einer geraden Augenschere auf, beginnend vom hinteren Ende, und gehen Sie seitlich zur Mittellinie.
4. Gehen Sie identisch für den Schädel.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, Scherenspitzen nach außen zu zeigen, um zu vermeiden, dass das Kleinhirn während der Zerlegung beschädigt wird.
5. Nehmen Sie das Gehirn heraus und übertragen Sie es auf eine 60-mm-Schale, gefüllt mit kaltem HBSS + 5 mg/ml Glukose.
6. Sezieren Sie das Kleinhirn vorsichtig mit sterilen geraden FeinenZangen (Abbildung 1B). Übertragen Sie es mit sterilgekrümmten FeinenZangen auf die Aufdruckscheibe des Tissue-Choppers.
7. Richten Sie das Gewebe aus, indem Sie den Schneidtisch drehen, um parasagittale Abschnitte durchzuführen.
8. Bewegen Sie den Schneidtisch, indem Sie den Tischfreigabeknopf nach rechts ziehen, sodass die Klinge am Rand des Gewebes positioniert ist.
9. Passen Sie die Scheibendicke auf 350 m und die Klingengeschwindigkeit auf mittel an.
10. Starten Sie den Chopper. Sobald das ganze Kleinhirn in Scheiben geschnitten wurde (Abbildung 1C), schalten Sie den Chopper aus.
11. Entfernen Sie die Kunststoffscheibe mit steriler Zange.
12. Bringen Sie die Kunststoffscheibe vorsichtig in die Nähe einer 60-mm-Schale, die HBSS + 5 mg/ml Glukose enthält. Pipette kalt HBSS + 5 mg/ml Glukose auf das Gewebe mit einer sterilen Transferpipette, um die Ernte von Kleinhirnscheiben in der puffergefüllten Schale zu ermöglichen.
13. Trennen Sie die Kleinhirnscheiben mit einer Mikrosonde voneinander. Nehmen Sie mit der Transferpipette hochwertige Abschnitte heraus (es wird empfohlen, Gewebeabschnitte zu verwenden, die in der Nähe der Vermis liegen) und legen Sie sie in einem vorausgeglichenen Zellkultureinsatz ab (Abbildung 1D).
14. Positionieren Sie die Kleinhirnscheiben mit der Mikrosonde auf dem Zellkultureinsatz und entfernen Sie dann vorsichtig die überschüssige HBSS + 5 mg/ml Glukoselösung mit der Transferpipette.
    HINWEIS: In diesem Stadium ist das Gewebe extrem zart und anfällig für körperliche Schäden. Die maximale Anzahl von Kleinhirnscheiben pro Zellkultureinsatz hängt vom Alter des Spendertiers ab. 6–8 Scheiben können für ein P0-P4-altes Tier und 4–6 Scheiben für Tiere, die älter als P5 sind, kultiviert werden.
15. Legen Sie das Kulturgericht in den Inkubator und wechseln Sie das Medium alle 2–3 Tage komplett.
16. Um das Überleben der Purkinje-Zell zu beurteilen, können Scheiben bereits 5 Tage in vitro gesammelt werden. Für andere Zwecke können sie in kultur für mehrere Wochen aufrechterhalten werden (Abbildung 1F).
    ANMERKUNG: Bei Purkinje-Zell-Überlebensexperimenten besteht keine Notwendigkeit, die pharmakologische Behandlung zu erneuern, wenn das Medium der Zellkultur verändert wird (Abbildung 1F).

3. Immunfluoreszenz

1. Nehmen Sie die 6-Well-Platte aus dem Inkubator. Entfernen Sie das Zellkulturmedium, waschen Sie den Zellkultureinsatz mit 1x PBS, und fixieren Sie die Scheiben mit kalter 4% Paraformaldehydlösung für 1 h, mit 1 ml unter dem Zellkultureinsatz und 500 l über dem Zellkultureinsatz.
2. Waschen Sie die Einsätze 4x 10 min mit 1x PBS, mit 1 ml unter und 500 l auf der Oberseite des Einsatzes, auf einem Orbital-Shaker.
3. Mit einem Pinsel die Kleinhirnscheiben von 1 Zellkultureinsatz auf 1 Brunnen eines 24-well vorgefüllten mit 1x PBS, 0,25% Triton X-100 und 3% BSA (PBS-TB), 500 l/well übertragen.
4. Permeabilisieren und blockieren Sie die Scheiben durch Inkubation in PBS-TB für 1 h bei Raumtemperatur.
5. Inkubieren Sie mit primär in der PBS-TB-Lösung verdünnten Primärantikörpern über Nacht bei + 4 °C auf einem Orbital-Shaker, 200 l/well.
6. Führen Sie am nächsten Tag vier Wälzungen von 10 min mit 1x PBS, auf einem Orbital-Shaker, 500 l/well.
7. Inkubieren Sie mit sekundären Antikörpern, die in der PBS-TB-Lösung verdünnt sind, zwei Stunden bei Raumtemperatur, auf einem Orbital-Shaker und vor Licht geschützt, 200 l/well.
8. Führen Sie vier Wässen von 10 min mit 1x PBS, auf einem Orbital-Shaker, 500 l/well.
9. Gegenbeflecken Sie die Scheiben mit Hoechst 33342, verdünnt in 1x PBS (2 g/ml), für 10 min bei Raumtemperatur, geschützt vor Licht, 500 l/well.
10. Montieren Sie die Kleinhirnscheiben auf einem Mikroskopschlitten mit einer Transferpipette. Lassen Sie sie vollständig lufttrocknen, vor Licht geschützt. Befeuchten Sie sie mit 1x PBS und tragen Sie einen Deckelschlupf auf, der mit wenigen Tropfen Montagemedium bedeckt ist. Vermeiden Sie Blasen.
11. Sobald das Montagemedium ausgehärtet ist, sind Kleinhirnabschnitte bereit, abgebildet zu werden.

4. Bildgebung und Quantifizierung des Zellüberlebens

1. Schalten Sie das Mikroskop und die Laser gemäß den Anweisungen des Herstellers und/oder der Bildaufnahmeeinrichtung ein.
2. Starten Sie die Erfassungssoftware.
3. Mit einem 10-fachen Objektiv, lokalisieren Sie nicht veränderte Kleinhirnscheiben, die 9–10 Lobulen präsentieren (in der Regel Kleinhirnabschnitte in der Nähe der Vermis).
4. Aktivieren Sie die Z-Stack-Erfassung. Definieren Sie den Bereich des Z-Stacks, um alle Purkinje-Zellen im Kleinhirnbereich einzuschließen. Legen Sie eine Schrittgröße von 2 m fest und starten Sie die Erfassung. Speichern Sie das erworbene Bild im Format des Herstellers der Erfassungssoftware, um die zugehörigen Metadaten beizubehalten.
5. Öffnen Sie die erworbene Datei in ImageJ mit dem Bio-Format-Plugin¹⁸.
6. Gehen Sie zu Bild > Stapel > Z-Projekt... (Abbildung 2A).
7. Wählen Sie Max Intensität im Dropdown-Menü Projektionstyp und klicken Sie auf OK (Abbildung 2B).
8. Es wird ein abgeflachtes 2D-Bild generiert. Doppelklicken Sie auf das Multi-Point-Werkzeug, um das Fenster Punktwerkzeug erscheinen zu lassen. Deaktivieren Sie die Option Beschriftungspunkte, um die Visualisierung gezählter Zellen zu vereinfachen. Klicken Sie dann direkt auf ein Soma einer Purkinje-Zelle, um mit der Zählung zu beginnen (Abbildung 1E). Die Gesamtzahl der gezählten Zellen wird am unteren Rand des Fensters Punktwerkzeug angezeigt (Abbildung 3).
   HINWEIS: In der Regel können mindestens 3 nicht beschädigte Abschnitte mit 9–10 Lobulen pro Zellkultureinsatz quantifiziert werden. Um die neuroprotektive Wirkung eines pharmakologischen Wirkstoffs zu bewerten, sollten mindestens 3 unabhängige Experimente durchgeführt werden.

Ergebnisse

Wie in Abbildung 4dargestellt, produziert dieses Protokoll organotypische Kleinhirnscheibenkulturen, in denen das Überleben von Purkinje-Zellen nach den Immunfluoreszenz- und Bildaufnahmeschritten beurteilt werden kann. Purkinje-Zellen wurden mit einer Kombination von Anti-Calbindin D-28K (Verdünnung 1/200) und Alexa594 Anti-Maus-Antikörper (Verdünnung 1/300) Anti-Maus-Antikörper gekennzeichnet. Die Bildnähte wurden automatisch von der Mikroskoperfassungssoftware (NIS-Elemente) durchge...

Diskussion

Cerebellar Slice Kultur ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um programmiertpuren Zelltod während der postnatalen Entwicklung zu studieren. Diese Technik kann verwendet werden, um Kandidatenmoleküle schnell auf ihr neuroprotektives Potenzial zu untersuchen. Der Hauptvorteil ist, dass die Einrichtung einfach und sehr kostengünstig ist und nur eine bescheidene Investition in die Ausrüstung erfordert (ein Vibratome kann bis zu 3-mal mehr kosten als ein Gewebe-Chopper). Darüber hinaus können 10 bis 15 gesunde Scheiben a...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody	ThermoFisher scientific	A21203
Basal Medium Eagle (BME)	ThermoFisher scientific	21010046
Biosafety cabinet Class II, Type A2	NuAire	NU-540-400
Bovine serum albumin	Millipore Sigma	A2153
Brush
anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955)	Abcam	ab82812
CO2 Incubator	NuAire	NU-5700
Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates	Fisher Scientific	07-200-83
Coverslips, 22 x 50 mm	Fisher Scientific	12-545-E
Dressing forceps, straight	Harvard Apparatus	72-8949
Double edge blades	Fisher Scientific	50949411
Ethanol 200 proof	Decon Labs, Inc	2701
Eye Scissors, straight	Harvard Apparatus	72-8428
Fine forceps	Fisher Scientific	16-100-127
L-Glutamine 100X	ThermoFisher scientific	25030149
Glucose solution	ThermoFisher scientific	A2494001
Hanks’ Balanced Salt Solution	ThermoFisher scientific	14025092
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Fisher Scientific	H21492
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin	ThermoFisher scientific	26050088
ImageJ
McIlwain Tissue Chopper	Fisher Scientific	NC9914528
Microprobes	Fisher Scientific	08-850
Millicell Cell Culture Inserts	Millipore Sigma	PICM0RG50
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL	ThermoFisher scientific	168-0045
Nikon A1R confocal laser microscope system	Nikon
NIS-Elements Imaging Software	Nikon
Paraformaldehyde	Acros Organics	41678-0010
Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-20D
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-500
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher scientific	P10144
Operating Scissors, straight	Harvard Apparatus	72-8403
Orbital shaker Belly Dancer	IBI Scientific	BDRLS0003
Prism 8	GraphPad
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring	Fisher Scientific	FB012921
Tissue culture plate, 24 well	Falcon/Corning	353047
Transfer pipettes, sterile	ThermoFisher scientific	13-711-21
Triton X-100	ThermoFisher scientific	BP151-500