JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Органотипические срезные культуры являются мощным инструментом для изучения нейроразвития или дегенеративных / регенеративных процессов. Здесь мы описываем протокол, который моделирует нейроразвитие смерти клеток Purkinje в мыши мозжечковой культуры ломтик. Этот метод может принести пользу исследованиям в нейропротекторных открытий наркотиков.

Аннотация

Organotypic срез культуры является мощным in vitro модель, которая имитирует в условиях vivo более тесно, чем разъединенных первичных культур клеток. В начале послеродового развития, мозжечковые клетки Purkinje, как известно, проходят через уязвимый период, в течение которого они претерпевают запрограммированную гибель клеток. Здесь мы предоставляем подробный протокол для выполнения мыши organotypic мозжечковой культуры ломтик в это критическое время. Ломтики дополнительно помечены для оценки выживания клеток Пуркинье и эффективности нейропротекторных методов лечения. Этот метод может быть чрезвычайно ценным для проверки новых нейроактивных молекул.

Введение

Моделирование in vitro является важным инструментом в биомедицинских исследованиях. Это позволяет следователям изучать и жестко контролировать конкретные механизмы в ограниченных типов клеток, или в изолированных системах / органах. Органотипическая срезная культура широко используется в пробирке техника, особенно в области неврологии1. Метод был впервые создан Гюхвилер, который культивируется мозг ломтиками с помощью роликовой трубки техники2, а затем изменены Ямамото и др., который ввел использование микропористых мембраны для выполнения корковых культур ломтик3. По сравнению с первичными культурами клеток, органотипические срезные культуры представляют собой преимущество сохранения цитоархитектуры ткани, а также родных клеточных соединений в плоскости ткани.

Органотипические ломтики были культивированы из многих частей центральной нервной системы, таких как гиппокамп4,кора5,стриатум6,мозжечок4,7,и спинной мозг 8,9, среди других. Они были доказаны, чтобы быть мощным инструментом в исследованиях открытия наркотиков10. Эффекты нейроактивных молекул можно оценить по-разному: выживание и нейродегенерация с помощью иммуностоинга и биохимии анализов, формирования нейрональных цепей, или нарушения с помощью электрофизиологии и живой визуализации.

Цель этой работы состоит в том, чтобы описать простой метод для выполнения органотипической мозжечковой культуры ломтик, который, как известно, соответствующая модель для имитации мозжечкового развития в пробирке. В частности, мы сосредоточились на изучении смерти клеток Пуркинье. In vivo, Purkinje клетки проходят апоптоз в течение первой послеродовой недели, достигнув пика в послеродовой день 3 (P3)11. Такая же картина наблюдается в мозжечковой культуры ломтик, с Purkinje нейронов умирают от апоптоза, когда церебелла взяты из животных между P1 и P8, с пиком на P34,12. Использование органотипических мозжечковых культур ломтик позволило определить несколько нейропротекторных молекул7,13, а также понимание части механизмов, участвующих в этой запрограммированной клеточной смерти14,15,16. Здесь мы описываем протокол, основанный на изучении Stoppini et al.17 в гиппокампе, и адаптированный к мозжечке Dusart et al.4 Он включает в себя быстрое вскрытие и измельчение послеродовой церебелли; нарезка культуры на вставку клеточной культуры, содержащая микропористую мембрану, с нейропротекторным лечением или без нее; и иммунофлуоресценции окрашивания для оценки выживаемости нейронов.

протокол

Все эксперименты с участием животных проводились в соответствии с комитетом По изучению животных Северо-Западного университета.

1. Подготовка до органотипической мозжечковой культуры ломтик

  1. В клеточной культуре капот распыляется с 70% этанола заранее, подготовить 200 мл культуры среды в 250 мл бутылки-топ вакуумный фильтр, прикрепленный к стерильной бутылке приемника. Добавьте 100 мл базального среднего орла (BME), 50 мл сбалансированного соляного раствора Хэнкса (HBSS), 50 мл теплоинактивированной лошадиной сыворотки, 1 мл 200 мМ L-глютамина (окончательная концентрация 1 мМ) и 5 мл глюкозы 200 г/л (окончательная концентрация 5 мг/мл). Вакуум-фильтруйте среду культуры и держите ее на уровне 4 градусов по Цельсию в течение месяца.
  2. В стерилизованном шкафу биобезопасности выняйте из упаковки 6-колодец культурную плиту. Заполните каждый колодец с 1 мл культуры среды. Если лечение проверено, добавьте фармакологический агент к обработанной скважине, и такой же объем решения транспортного средства для управления хорошо. В настоящем исследовании мы добавили в обработанные скважины 1 кЛ стерильного раствора 3 М ККЛ (30 мМ финала) и 1 л стерильной воды.
  3. Принесите внутри капюшона клеточной культуры необходимое количество индивидуально обернутых вставок клеточной культуры с гидрофильной политетрафтотрилен (PTFE) мембрана (пор овый размер 0,4 мкм). Тщательно развернуть их и вынуть клеточной культуры вставки со стерильными щипцы. Бросьте их один за другим в колодец 6-ну хорошо пластины, избегая пузырьков на интерфейсе между вставкой мембраны и среды клеточной культуры. Пусть вставки уравновешивать в среде в 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 инкубатор, по крайней мере 2 ч до культуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тканевой измельчитель постоянно находится в капюшоне клеточной культуры.
  4. Приготовьте два бикера 200 мл, один из них заполнен стерильной водой 150 мл, а другой заполнен 150 мл 70% этанола. Dip хирургических инструментов в 70% этанола ванны, а затем в воде до их использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте хирургические инструменты сразу после контакта с этанолом.
  5. Дезинфекция обоюдоострого лезвия в 70% этанола стакан. Поместите его на держатель лезвия с помощью стерильных щипц и удерживайте его на месте с помощью гаечного ключа лезвия. Дайте ему высохнуть до использования.
  6. Дезинфицировать пластиковый диск, обеспеченный тканевым измельчитель в 70% этанола стакан. Спрей режущий стол с 70% этанола до размещения диска на нем. Дайте высохнуть до использования.

2. Рассечение и церебеллярные органотипические культуры фрагмента

  1. Принесите щенка мыши внутри капюшона культуры клетки для выполнения вскрытия.
  2. Обезглавить щенка быстро с помощью прямых операционных ножниц(Рисунок 1A).
  3. Держа голову щенка за нос прямыми депеловыми щипцыми, разрежьте кожу головы ножницами прямого глаза, начиная с заднего конца и переходя боковыми к средней линии.
  4. Продолжить одинаково для черепа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, чтобы указать ножницы советы наружу, чтобы избежать повреждения мозжечка во время вскрытия.
  5. Выняйте мозг и перенесите его в 60-мм блюдо, наполненное холодным HBSS и глюкозой 5 мг/мл.
  6. Тщательно вскрыть мозжечок с помощью стерильных прямых тонких щипцов(рисунок 1B). Перенесите его на пластиковый диск, помещенный на режущий стол тканевого измельчителя с помощью стерильных изогнутых тонких щипочек.
  7. Ориентируйте ткань, вращая режущий стол для выполнения паразиттальных секций.
  8. Переместите режущий стол, потянув за стол ручкой вправо, так что лезвие расположено на краю ткани.
  9. Отрегулируйте толщину ломтика до 350 мкм и скорость лезвия до средней.
  10. Запустите вертолет. После того, как весь мозжечок был нарезан(Рисунок 1C), выключите измельчитель.
  11. Удалите пластиковый диск стерильными щипками.
  12. Аккуратно принесите пластиковый диск близко к 60-мм блюду, содержащему HBSS и 5 мг/мл глюкозы. Pipette холодный HBSS 5 мг/мл глюкозы на ткани с помощью стерильной передачи пипетки, чтобы позволить уборку мозжечковых ломтиков в буфер-заполненные блюдо.
  13. Отделите мозжечковые ломтики друг от друга с помощью микрозонда. Выняйте секции хорошего качества с передачей пипетки (рекомендуется использовать ткани разделы, которые близки к vermis) и высадить их в предварительно уравновешенной клеточной культуры вставки (Рисунок 1D).
  14. Расположите мозжечковые ломтики на вставку клеточной культуры с помощью микрозонда, затем аккуратно удалите избыток HBSS - 5 мг/мл раствор глюкозы с помощью передачи пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе ткань чрезвычайно нежная и подвержена физическому повреждению. Максимальное количество мозжечковых ломтиков на вставку клеточной культуры зависит от возраста донорского животного. 6-8 ломтиков могут быть культивированы для P0-P4-старого животного, и 4-6 ломтиков для животных старше P5.
  15. Поместите блюдо культуры в инкубатор, полностью меняя среду каждые 2-3 дня.
  16. Для оценки выживаемости клеток Пуркинье ломтики можно собирать уже через 5 дней в пробирке. Для других целей, они могут быть сохранены в культуре в течение нескольких недель(рисунок 1F).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В случае экспериментов по выживанию клеток Purkinje, нет необходимости возобновлять фармакологическое лечение при изменении среды клеточной культуры(рисунок 1F).

3. Иммунофлуоресценция

  1. Вынизвините 6-колодую тарелку из инкубатора. Удалить среды культуры клеток, мыть клеточной культуры вставить с 1x PBS, и исправить ломтики с холодным 4% параформальдегида решение для 1 ч, с 1 мл под клеточной культуры вставки и 500 Л на вершине клеточной культуры вставки.
  2. Вымойте вставки 4x 10 мин с 1x PBS, с 1 мл под и 500 л на верхней части вставки, на орбитальной шейкер.
  3. С помощью кисти, передача мозжечковой ломтики из 1 клеточной культуры вставить в 1 хорошо 24-хорошо предварительно заполнены 1x PBS, 0,25% Тритон X-100, и 3% BSA (PBS-TB), 500 Л / хорошо.
  4. Пермяки и блокировать ломтики инкубации в PBS-ТБ в течение 1 ч при комнатной температуре.
  5. Инкубировать с первичными антителами, разбавленными в растворе PBS-TB, на ночь при 4 градусах По Цельсия, на орбитальном шейкере, 200 л/ну.
  6. На следующий день выполните четыре мотания по 10 мин с 1x PBS, на орбитальном шейкере, 500 л/ну.
  7. Инкубировать вторичными антителами, разбавленными в растворе PBS-TB, два часа при комнатной температуре, на орбитальной шейкере и защищенной от света, 200 л/ну.
  8. Выполните четыре стирки 10 мин с 1x PBS, на орбитальной шейкер, 500 л/ну.
  9. Противокоите ломтики с помощью Hoechst 33342, разбавленные в 1x PBS (2 мкг/мл), в течение 10 мин при комнатной температуре, защищены от света, 500 л/ну.
  10. Установите мозжечковые ломтики на слайд ескопии микроскопии с передачей пипетки. Пусть они полностью высохнут, защищены от света. Повторно увлажнить их с 1x PBS и применить coverslip покрыты несколько капель монтажа среды (80 л). Избегайте каких-либо пузырьков.
  11. После того, как монтажная среда вылечилась, мозжечковые секции готовы к изображению.

4. Визуализация и количественная оценка выживаемости клеток

  1. Включите микроскоп и лазеры в соответствии с инструкциями производителя и/или основных изображений.
  2. Запустите программное обеспечение для приобретения.
  3. Используя цель 10X, найдите неизмененные мозжечковые ломтики, которые представляют 9-10 лобул (обычно мозжечковые участки близко к vermis).
  4. Активировать приобретение z-stack. Определите диапазон z-стек, чтобы включить все клетки Purkinje, присутствующие в мозжечковом ломтике. Установите размер шага в 2 мкм и начните приобретение. Сохранить приобретенную картину в формате производителя программного обеспечения для приобретения, чтобы сохранить связанные метаданные.
  5. Откройте приобретенный файл в ImageJ с помощью плагина Bio-formats18.
  6. Перейти к изображению и gt; Стеки
  7. Выберите Максимальную интенсивность в меню выпадения типа проекции и нажмите OK (рисунок 2B).
  8. Сплющенный 2-D изображение будет создано. Дважды щелкните по многоточечному инструменту, чтобы показать окно Point Tool. Отоверьте опцию очков Label, чтобы облегчить визуализацию подсчитанных ячеек. Затем нажмите прямо на сому клетки Purkinje, чтобы начать подсчет(рисунок 1E). Общее количество подсчитанных ячеек будет указано в нижней части окна Point Tool (рисунок 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно, по крайней мере 3 неповрежденных разделов, содержащих 9-10 lobules на вставку клеточной культуры, могут быть количественно оценены. Для оценки нейропротекторного эффекта фармакологического агента необходимо провести не менее 3 независимых экспериментов.

Результаты

Как показано на рисунке 4, этот протокол производит органотипические мозжечковые срез культуры, в которых purkinje выживания клеток может быть оценена после иммунофлуоресценции и изображения приобретения шагов. Клетки Пуркинье были помечены комбинацией антикальбиндина D-...

Обсуждение

Церебелля среза культура является мощным инструментом для изучения запрограммированных Purkinje смерти клеток во время послеродового развития. Этот метод может быть использован для быстрого экрана молекулы кандидатов на их нейропротекторный потенциал. Основным преимуществом является ?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Imaging работы были выполнены в Северо-Западном университете Центр расширенной микроскопии щедро поддерживается NCI CCSG P30 CA060553 присуждается Роберт H Lurie Всеобъемлющий онкологический центр. Мы благодарим Шона Макдермотта за его техническую помощь и поддержку, а Майю Эпштейн за рисованные иллюстрации, показанные на рисунке 1.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibodyThermoFisher scientificA21203
Basal Medium Eagle (BME)ThermoFisher scientific21010046
Biosafety cabinet Class II, Type A2NuAireNU-540-400
Bovine serum albuminMillipore SigmaA2153
Brush
anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955)Abcamab82812
CO2 IncubatorNuAireNU-5700
Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture PlatesFisher Scientific07-200-83
Coverslips, 22 x 50 mmFisher Scientific12-545-E
Dressing forceps, straightHarvard Apparatus72-8949
Double edge bladesFisher Scientific50949411
Ethanol 200 proofDecon Labs, Inc2701
Eye Scissors, straightHarvard Apparatus72-8428
Fine forcepsFisher Scientific16-100-127
L-Glutamine 100XThermoFisher scientific25030149
Glucose solutionThermoFisher scientificA2494001
Hanks’ Balanced Salt SolutionThermoFisher scientific14025092
Hoechst 33342, Trihydrochloride, TrihydrateFisher ScientificH21492
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand originThermoFisher scientific26050088
ImageJ
McIlwain Tissue ChopperFisher ScientificNC9914528
MicroprobesFisher Scientific08-850
Millicell Cell Culture InsertsMillipore SigmaPICM0RG50
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mLThermoFisher scientific168-0045
Nikon A1R confocal laser microscope systemNikon
NIS-Elements Imaging SoftwareNikon
ParaformaldehydeAcros Organics41678-0010
Pasteur pipetsFisher Scientific13-678-20D
Potassium ChlorideFisher ScientificBP366-500
ProLong Gold Antifade MountantThermoFisher scientificP10144
Operating Scissors, straightHarvard Apparatus72-8403
Orbital shaker Belly DancerIBI ScientificBDRLS0003
Prism 8GraphPad
Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ringFisher ScientificFB012921
Tissue culture plate, 24 wellFalcon/Corning353047
Transfer pipettes, sterileThermoFisher scientific13-711-21
Triton X-100ThermoFisher scientificBP151-500

Ссылки

  1. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  2. Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
  3. Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
  4. Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study. Journal of Neuroscience. 17 (10), 3710-3726 (1997).
  5. Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation. Journal of Visualized Experiments. (125), e55886 (2017).
  6. Daviaud, N., et al. Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease. Neuroscience. 256, 10-22 (2014).
  7. Ghoumari, A. M., et al. Mifepristone (RU486) protects Purkinje cells from cell death in organotypic slice cultures of postnatal rat and mouse cerebellum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7953-7958 (2003).
  8. Labombarda, F., et al. Neuroprotection by steroids after neurotrauma in organotypic spinal cord cultures: a key role for progesterone receptors and steroidal modulators of GABA(A) receptors. Neuropharmacology. 71, 46-55 (2013).
  9. Gao, P., et al. P2X7 receptor-sensitivity of astrocytes and neurons in the substantia gelatinosa of organotypic spinal cord slices of the mouse depends on the length of the culture period. Neuroscience. , 195-207 (2017).
  10. Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).
  11. Jankowski, J., Miething, A., Schilling, K., Baader, S. L. Physiological purkinje cell death is spatiotemporally organized in the developing mouse cerebellum. Cerebellum. 8 (3), 277-290 (2009).
  12. Ghoumari, A. M., Wehrle, R., Bernard, O., Sotelo, C., Dusart, I. Implication of Bcl-2 and Caspase-3 in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture: an in vitro model to study apoptosis. European Journal of Neuroscience. 12 (8), 2935-2949 (2000).
  13. Ghoumari, A. M., Wehrle, R., De Zeeuw, C. I., Sotelo, C., Dusart, I. Inhibition of protein kinase C prevents Purkinje cell death but does not affect axonal regeneration. Journal of Neuroscience. 22 (9), 3531-3542 (2002).
  14. Ghoumari, A. M., et al. Neuroprotective effect of mifepristone involves neuron depolarization. FASEB Journal. 20 (9), 1377-1386 (2006).
  15. Repici, M., Wehrle, R., Antoniou, X., Borsello, T., Dusart, I. c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 play different roles in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture. Cerebellum. 10 (2), 281-290 (2011).
  16. Rakotomamonjy, J., Ghoumari, A. M. Brain-Derived Neurotrophic Factor Is Required for the Neuroprotective Effect of Mifepristone on Immature Purkinje Cells in Cerebellar Slice Culture. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), (2019).
  17. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
  18. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  19. Uesaka, N., et al. Organotypic coculture preparation for the study of developmental synapse elimination in mammalian brain. Journal of Neuroscience. 32 (34), 11657-11670 (2012).
  20. Falsig, J., et al. Prion pathogenesis is faithfully reproduced in cerebellar organotypic slice cultures. PLoS Pathogens. 8 (11), 1002985 (2012).
  21. Bouslama-Oueghlani, L., Wehrle, R., Sotelo, C., Dusart, I. The developmental loss of the ability of Purkinje cells to regenerate their axons occurs in the absence of myelin: an in vitro model to prevent myelination. Journal of Neuroscience. 23 (23), 8318-8329 (2003).
  22. Apuschkin, M., Ougaard, M., Rekling, J. C. Spontaneous calcium waves in granule cells in cerebellar slice cultures. Neuroscience Letters. 553, 78-83 (2013).
  23. Audinat, E., Knopfel, T., Gahwiler, B. H. Responses to excitatory amino acids of Purkinje cells' and neurones of the deep nuclei in cerebellar slice cultures. Journal of Physiology. 430, 297-313 (1990).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

154

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены